Lịch sử hình thành Định nghĩa sắc ký Các giai đoạn của quá trình sắc ký PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu, graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TIỂU LUẬN MÔN CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẢNG VIÊN: TS BÙI HỮU TÀI HỌC VIÊN: ĐÀO THỊ MAI LỚP: CHE2019B-1 Hà Nội - 2021 MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử hình thành Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett cho dung dịch sắc tố thực vật ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ lên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống dưới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vịng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tvest gọi sắc đồ Ông đặt tên cho phương pháp tách sắc ký (Chromatography) Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa chất màu, graphein có nghĩa viết Tên gọi ngày sử dụng phương pháp cịn dùng tách chất khơng màu Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử chúng Đến năm 1964, Moor gọi “gel permeation chromatography” hay gọi sắc ký lọc gel Năm 1906, sắc ký khí biết đến đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960 Năm 1967, Horvath C tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp 1.2 Định nghĩa sắc ký Sắc ký nhóm phương pháp hố lý dùng để tách thành phần hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa phân chia khác chất khác vào hai pha tiếp xúc khơng hồ lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động (Trong thí nghiệm Tvest: pha tĩnh canxi cacbonat, pha động ete dầu hoả) Pha tĩnh trì hỗn di chuyển thành phần mẫu Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng tách khỏi theo thời gian Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp chuyên chở chất lỏng khí thành phần tách phân bố khác chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng Nhiều kỹ thuật khác dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa tính khác chất mơi trường động khí lỏng mơi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử 1.3 Các giai đoạn trình sắc ký Quá trình sắc ký gồm giai đoạn chính: Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat) Các chất giữ pha tĩnh Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động kéo theo chất di chuyển pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi có vị trí khác pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram) Giai đoạn gọi khai triển sắc ký + Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua chất bị kéo ngồi pha tĩnh (ví dụ: khỏi cột) Đó q trình rửa giải dung môi dùng dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng cuối cột gọi dịch rửa giải (eluate) + Nếu chất tách pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta lấy phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột cột) đem chiết lấy chất + Nếu chất tách ngồi pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta hứng thu lấy phân đoạn dịch rửa giải có chất cần phân tích Phát chất: Các chất màu phát dễ dàng, chất khơng màu phát đèn tử ngoại hay thuốc thử Trong sắc ký rửa giải phát chất chúng khỏi cột cách cho dung dịch rửa giải qua phận phát gọi detector đặt sau cột Hình 1.1 Sơ đồ trình sắc ký CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG 2.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC), dựa chủ yếu vào tượng hấp thu pha động dung môi hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin) Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kiếng, nhôm hay plastic Do chất hấp thu tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc ký lớp mỏng Bình triển khai sắc ký: Một chậu, hũ, lọ thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy Hình 2.1 Bình triển khai sắc ký Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên kiếng, nhôm, hay plastic Chất hấp thu nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay lọai polymer hữu Mẫu cần phân tích: thường hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ vi quản để chấm thành điểm gọn pha tĩnh, vị trí phái cao chút so với mặt thống chất lỏng chứa bình Pha động: dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo lớp mỏng, lơi kéo mẫu chất theo Dung mơi di chuyển cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất di chuyển với vận tốc khác nhau, phía sau mực dung mơi Vận tốc di chuyển phụ thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ mẫu chất lại pha tĩnh tùy thuộc vào độ hòa tan mẫu chất dung môi 2.2 Các bước thực sắc ký lớp mỏng - Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính ống nhỏ, khoảng 1-2mm, dài 10-20cm Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, cần sau lần sử dụng, rửa vi quản dung môi hữu aceton - Chuẩn bị mỏng: mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt với kiách thước cần thiết, phải vừa bình giải ly Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát mức tiền tuyến dung môi - Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu chất lỏng, chấm trực tiếp mẫu lên mỏng, mẫu dung dịch q đặc, pha lỗng mẫu Với mẫu chất rắn phải hịa tan dung mơi hữu phù hợp, nồng độ 2-5% Nhờ vi quản để chấm dung dịch mẫu lên bề mặt sắc ký lớp mỏng cách thận trọng, nhanh dứt khoát tránh làm hỏng bề mặt lớp mỏng Mỗi vết chấm không chứa nhiều 12ug (10ug tối ưu) mẫu chất - Sấy nhẹ để dung môi bay khỏi vết chấm, nhúng vào dung dịch giải ly - Giải ly để dung mơi giải ly di chuyển lên: Sau bình bão hịa dung mơi, người ta đặt mỏng vào bình khai triển vết chấm mẫu bờ cạnh phía đáy bình Cạnh đáy lớp mỏng ngập dung môi giải ly khỏang 0.5-1cm Các vết mẫu không ngập dung môi giải ly, vệt mẫu khuếch tán vào dung mơi - Hiện hình vết sau giải ly: Các hợp chất có màu nhìn thấy mắt thường, phần lớn hợp chất hữu khơng có màu, nên muốn nhìn thấy vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát bằ ng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng nhận hợ p chất hấp thu tia UV, hợp chất có màu tối sẫm sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng phát hợp chất có phát hùynh quang, vết sẫm chất mẫu có màu sáng mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dung thuốc thử iod, 2,7-fluorescein phát đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát aminoacid hay amin, 2,4- dinitrophenylhydrazin phát aldehyde hay caton, clorur antimony phát steroid hay vitamin hay carotenoid,…) Hình 2.2 Các bước trình sắc ký lớp mỏng 2.3 Hệ số di chuyển Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung mơi: Trong đó: a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử (cm); b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo đường vết (cm) Rf: Chỉ có giá trị từ đến l Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf như: Do độ khếch tán dung mơi bình triển khai khơng đồng Do kỹ thuật cắt mỏng kỹ thuật chấm chưa chuẩn làm giá trị R f bị thay đổi Chất lượng hoạt tính chất hấp thụ Bề dày lớp mỏng Chất lượng độ tinh khiết pha động 2.4 Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) phương pháp sắc ký sử dụng để tách lượng nhỏ đơn chất (101000mg) từ hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử) Trong PTLC, dung dịch mẫu thử chấm lớp chất hấp phụ (thường silica gel, nhơm oxit) có độ dày từ 0,5-2mm tráng phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trị pha tĩnh Một dung môi triển khai (pha động) di chuyển dọc theo vận tốc khác nhautaoj thành sắc ký đồ gồm nhiều vết có R f khác Sau triển khai, ta thu cấu tử đặc trưng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết khỏi phản hấp phụ chất khỏi giá hấp phụ dung mơi thích hợp Hợp chất thu từ mỏng tinh chế tiếp TLC hay phương pháp sắc ký khác hợp chất đạt đủ độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc phương pháp phân tích Phương pháp tiến hành PTLC nhìn chung tương tự TLC khác việc sử dụng mỏng dày so với TLC: PTLC 0,5-2mm, dày đến 10 mm tùy yêu cầu sử dụng; TLC 0,2-0,25mm Ưu nhược điểm PTLC Ưu điểm Nhanh, rẻ, thiết bị đơn giản dễ áp dụng so với sắc ký cột cổ điển HPLC điều chế 10 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT 3.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký cột Sắc ký cột tiến hành điều kiện áp suất khí Pha tĩnh hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), nạp cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tích đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớ p thủy tinh che chở để lớp mặt khơng bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly đặt phái cao Dung môi giải ly khỏi cột phần bên cột hứng vào lọ nhỏ đặ ống dẫn cột Phương pháp thường làm cho trình tách bị chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột có ưu điểm pha tĩnh dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, triển khai với lượng mẫu tương đối lớn 3.2 Các bước thực sắc ký cột Bước Lựa chọn chất hấp thụ Pha tĩnh silicagel loại thường, hợp chất không phân cực giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực giải ly sau Với phân tử khơng phân cực, phân tử n có trọng luợng phân tử lớn có tính phân cực mạnh phân tử kia, bị pha tĩnh giữ lại cột nên di chuyển khỏi cột chậm so với phân tử nhỏ, có lại lâu cột so với phân tử có tính phân cực Bước Lựa chọn dung mơi Mẫu cần sắc ký đuợc hồ tan hồn tồn dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 mỏng 2,5x10cm Chấm lên tấm khoảng 2-5ul dd(A) Mỗi mỏng triển khai với loại dung mơi giải ly khác nhau, kế phát đèn UV hay thuốc thử Với đơn dung môi dễ dàng thấy dung môi phù hợp Từ kết đó, cố gắng tìm hỗn hợp dung mơi, dung mơi phân cực dung mơi phân cực thí dụ ete dầu hỏa: etyl acetate 12 Hình 3.1 Hình ảnh cột sắc ký Bước Chuẩn bị cột Một số cột có lớp lọc thủy tinh frit (hình 3.2, bên trái) để tránh thất thoát pha tĩnh từ đáy cột; loại khác khơng có cần phải có lớp đệm thủy tinh vải đáy cột Đặt thêm lớp vải thủy tinh hay lớp vải nghe lạ với lỗ lọc thủy tinh frit khó làm gây nhiễm tạp, chẳng hạn silica rò rỉ qua lỗ lọc frit vào phân đoạn thu hồi Để tránh tượng cho thêm lớp cát lỗ lọc frit silica Mật độ, kích thước lỗ lọc frit không giống Nghĩa tốc độ dịng dung mơi cột khác khác Loại lớp lọc frit lớn làm rò rỉ nhiều silica hơn, loại lỗ nhỏ cho tốc độ dịng thấp – đơi thấp – dẫn đên tạo áp lực sắc ký cột nhanh 13 Hình 3.2 Cột có lớp lọc frit (trái) khơng có lớp lọc frit (phải) Cột có lớp lọc frit Chọn cột có kích thước phù hợp, rửa thật sạch, tráng với nước cất sấy khô Kẹp cột thẳng đứng lên giá đóng van phía cột lại (trên hình 3.2) Cho vào lớp cát mỏng (khoảng 0,5cm, muốn) Cột khơng có lớp lọc frit Miếng đệm vải sợi thủy tinh cần đủ rộng để che đáy cột, không rộng chặt làm cản trở dịng chảy dung mơi (hình 3.3) Một mảnh có kích thước ngón tay út đủ dùng Vị trí miếng đệm bơng hay sợi thủy tinh phải đảm bảo nằm chắn phần hẹp cột cách dùng đũa thủy tinh dụng cụ khác nén xuống Kẹp cột thẳng đứng lên giá đóng van phía cột lại (trên hình 3.2) Thêm lớp cát vào cột (khoảng 2cm, Hình 3.3) Điều đảm bảo pha tĩnh lớp ngăn tập trung không liên tục lớp vải chất cuối cột 14 Hình 3.3 Hướng dẫn chọn kích cỡ miếng đệm vải hay sợi thủy tinh lượng cát phù hợp cho cột khơng có lớp lọc frit Bước Nhồi cột Có số phương pháp nhồi cột sau: Cách 1: Nhồi cột khô kiểu Dụng cụ cần thiết: Cột chuẩn bị Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khô Van để đóng cột Dung mơi Silica Alumina Ưu điểm + Giảm thiểu trình rửa cột Cách làm: Nhược điểm Khó đạt hiệu nhồi cao Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát miếng đêm bơng vải để loại bọt khí (Hình 3.4, bước B) Đặt phễu khô đỉnh cột đổ từ từ silica alumina (pha tĩnh) vào dung môi Để dung môi chảy từ từ tránh bị tràn (hình 3.4, bước C) Để pha tĩnh lắng xuống nhẹ nhàng đóng van cột lại để silica/alumina nhồi chặt cột (Hình 3.4, bước D) Tháo dung môi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn (hình 3.4, bước E) 15 Hình 3.4 Phương pháp nhồi cột khô kiểu Cách 2: Nhồi cột khô kiểu Dụng cụ cần thiết: Cột chuẩn bị Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khô Dây dẫn chân không Dung môi Silica Alumina Ưu điểm Nhồi cột chặt Cách làm: + Nhược điểm Cần nhiều dung môi - Thêm silica gel khô vào cột nối chân không cách nối ống chân không vào đầu cột (hình 3.5, bước B) Chân khơng giúp q trình nén silica gel giữ ổn định cho bước Quá trình nhồi tốt vỗ nhẹ lên thành cột (hình 3.5, bước C) Khi tạo độ chân khơng rồi, rót từ từ dung mơi vào (Hình 3.5, bước D) 16 Để dung môi chảy qua cột tới chảy đến đáy cột Tại điểm này, đóng van tắt chân khơng (Hình 3.5, bước E) Để dung mơi qua cột với lượng khoảng – lần lượng dung môi đầy cột để đảm bảo hồn thành q trình nhồi cột Tháo dung môi mức dung môi cột chạm vào bề mặt pha tĩnh (hình 3.5, bước F) Hình 3.5 Phương pháp nhồi cột khơ kiểu Cách 3: Nhồi cột kiểu ướt (huyền phù) Dụng cụ cần thiết: Cột chuẩn bị Phễu phù hợp dùng cho chất rắn ướt cốc có mỏ bình tam giác Que khuấy thủy tinh Dung mơi Silica Alumina Pipet Pasteur 17 Ưu điểm Nhanh dễ dàng Cách làm: + Nhược điểm Cho hiệu rửa tốt - Rót dung mơi vào khoảng 1/3 dung tích cột (Hình 3.6, bước B) Dùng cốc có mỏ, đong lượng silica/alumina vừa đủ Trong bình phản ứng cốc có mỏ, đong lượng dung mơi gấp khoảng 1,5 lần lượng silica Thêm silica vào dung môi, một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng pipet Pasteur đũa thủy tinh để khuấy lên Rót dùng pipet để thêm hỗn hợp silica dung môi vào cột Để dung mơi khỏi cột tránh bị tràn (Hình 3.6, bước C) Gõ nhẹ vào cột để bọt khí silica lắng xuống (Hình 3.6, bước D) Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến tất lượng silica/alumina hết Rửa thành cột cách rót dung mơi lên thành cột Mở van tháo dung môi đến mức dung môi cột chạm đến bề mặt pha tĩnh (Hình 3.6, bước E) Hình 3.6 Nhồi cột kiểu ướt 18 19 Bước Làm cột Sau có sản phẩm tách ra, cơng việc cịn lại đổ silica làm cột cho lần tách Để làm nhanh rình, việc rửa giải loại bỏ dung mơi dùng máy nén khí cho dịng khí qua cột khoảng Q trình làm khơ silica, từ đổ khỏi cột dễ nhiều Sau rửa giải tất dung môi giữ cột thẳng đứng, úp ngược vào cốc có mỏ lớn, để khơ qua đêm tủ hút 3.3 Sự khác mặt vật lý, hóa học chất hấp phụ Silica gel Silica gel pha đảo Bề mặt hạt silica gel – SiO xử lý (thủy phân) cách đun nóng với HCl 0,1M hai ngày để tạo nhóm SiOH sau (thơng thường có khoảng µmol SiOH/m2 bề mặt): Trong đó, pha đảo tạo phản ứng với organochlorosilan để tạo pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình phân cực tùy theo nhóm R gắn vào Do đặc tính chứa nhóm SiOH bề mặt, silica gel có tính phân cực mạnh nên giữ lại chất phân cực cao, tương tác với chất phân cực Do đó, sắc ký pha thuận, dung mơi sử dụng theo thứ tự tăng dần độ phân cực, chất phân cực trước chất phân cực Trái lại, bề mặt xử lý loại bỏ nhóm –OH thay gốc alkyl nên pha đảo có tính phân cực Trong sắc ký cột pha đảo, chất phân cực bị giữ lại lâu pha tĩnh, chất phân cực rửa giải 20 trước Dung môi sử dụng thường điều chỉnh cho giảm độ phân cực Không sử dụng dung môi hữu phân cực cho sắc ký pha đảo 21 22 23 24 ... thập kỷ 1930-1940, phương pháp phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp... phát gọi detector đặt sau cột Hình 1.1 Sơ đồ trình sắc ký CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG 2.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC), dựa... silicate, Sắc ký phương pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký phương pháp nhanh, dễ dàng không ảnh hưởng đến protein, phương pháp đề nghị nghiên cứu định lượng protein hay phân tử 1.3 Các