Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kit xét nghiệm chẩn đoán SARS cov 2 được sử dụng phổ biến ở việt nam (tt)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ VŨ NGỌC HOÀNG ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA BỘ KIT XÉT NGHIỆM CHUẨN ĐOÁN SARS-COV-2 ĐƯỢC SỬ DỤNG PHỔ BIẾN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 8420201 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đà Nẵng – Năm 2022 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội Cơng trình hoàn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Xuân Phản biện 1: TS Ngơ Thái Bích Vân Phản biện 2: TS Phạm Trần Vĩnh Phú Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Công nghệ Sinh học họp Trường Đại học Bách khoa vào ngày tháng năm 2022 Có thể tìm hiểu luận văn tại: − Trung tâm Học liệu truyền thông, Trường Đại học Bách khoaĐHĐN; − Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đại dịch COVID-19, đại dịch diễn phạm vi toàn cầu Coronavirus (SARS-CoV-2) gây Sars-CoV-2 có tên đầy đủ hội chứng hơ hấp cấp tính nghiêm trọng coronavirus để phân biệt với Sar-Cov-1 diễn vào năm 2002 bắt nguồn từ Trung Quốc Cho đến chưa có thuốc cách chữa trị hữu hiệu COVID-19 Các nghiên cứu triệu chứng bệnh khơng xuất tuần bị nhiễm virus, nhiên người bệnh lây lan virus thời gian này.[1] Trong tình hình chung giới nhu cầu cấp thiết Việt Nam, nhà khoa học Việt Nam tiến hành nghiên cứu phát triển kit sàng lọc nhanh COVID-19 Trong kit Bộ Y tế cấp phép sử dụng phòng xét nghiệm COVID-19 Việt Nam kit công ty Việt Á công ty Sao Thái Dương Nhằm khẳng định tính hiệu dụng kit thực tế sử dụng phòng xét nghiệm, tiến hành đề tài “Đánh giá giá trị sử dụng kít xét nghiệm chuẩn đoán Sars-CoV-2 sử dụng phổ biến Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu Đề tài nhằm mục đích: “Đánh giá giá trị sử dụng kít xét nghiệm chuẩn đốn Sars-CoV-2 kỹ thuật Real-Time RT-PCR sử dụng phổ biến Việt Nam kit công ty cổ phần công nghệ Việt Á công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất, nhằm THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội khẳng định hiệu sử dụng kit sàng lọc điều kiện thực tế phòng xét nghiệm” Mục tiêu cụ thể đề tài bao gồm: - Đánh giá giá cả, thuận lợi thao tác cho kỹ thuật viên điều kiện thực tiễn - Đánh giá ảnh hưởng yếu tố thường gặp phòng xét nghiệm: mẫu trình tách chiết sử dụng kit tách chiết khác nhau, ảnh hưởng ngoại nhiễm sản phẩm - Đánh giá khả sử dụng kit trường hợp thực việc gộp mẫu với số lượng mẫu gộp khác - Đánh giá việc nhiễm máu xảy trình lấy mẫu đến phát Sars-Cov-2 kit Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu ➢ Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân lấy mẫu xét nghiệm Sars- CoV- phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Quảng Nam ➢ Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đoán Sars- CoV- 2: Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR Cơng ty Cổ phần Cơng nghệ Việt Á; Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong công ty cổ phần Sao Thái Dương 3.2 Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu tiến hành quy mơ phịng thí nghiệm nhằm đánh giá lại so sánh hiệu kit với yếu tố THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội ảnh hưởng đến kết RT-PCR chưa công bố nhà sản xuất Phương pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu việc lấy mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu xét nghiệm mẫu phản ứng Realtime RT- PCR nhằm phát Vi rút Sars- CoV- Bộ Y tế quy định Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài sử dụng phương pháp công cụ sinh học phân tử đại Reverse transcription- polymerase chain reaction máy… Kết thu xử lý phần mềm chuyên dụng nhằm đưa kết có độ tin cậy cao Ngồi ra, kết đề tài cung cấp thêm thông tin khoa học có giá trị kit sàng lọc Sars-CoV-2 phát triển Việt Nam, bao gồm: khả bảo tồn mẫu, khả loại bỏ ngoại nhiễm sản phẩm, loại bỏ ức chế phản ứng PCR việc nhiễm mẫu máu tồn trình lấy mẫu 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Các thông tin khoa học cung cấp đề tài nhằm đưa khuyến cáo việc sử dụng kit điều kiện thực tế, trình đánh giá kết thu nhận được, từ đảm bảo tính xác kết xét nghiệm THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại dịch COVID-19 Đại dịch COVID-19 đại dịch bệnh truyền nhiễm với tác nhân virus SARS-CoV-2 biến thể diễn phạm vi toàn cầu.[15] Khởi nguồn vào cuối tháng 12 năm 2019 với tâm dịch thành phố Vũ Hán thuộc miền Trung Trung Quốc đại lục, bắt nguồn từ nhóm người mắc viêm phổi không rõ nguyên nhân Giới chức y tế địa phương xác nhận trước họ tiếp xúc, chủ yếu với thương nhân buôn bán làm việc chợ bán buôn hải sản Hoa Nam Các nhà khoa học Trung Quốc tiến hành nghiên cứu phân lập chủng coronavirus mà Tổ chức Y tế Thế giới lúc tạm gọi 2019-nCoV, có trình tự gen giống với SARS-CoV trước với mức tương đồng lên tới 79,5%.[16][17][18] Ngày 11 tháng năm 2020, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tuyên bố gọi "COVID-19" "Đại dịch toàn cầu".[21] Những ảnh hưởng toàn giới đại dịch COVID-19 bao gồm: thiệt hại sinh mạng người, bất ổn kinh tế xã hội,[23] tình trạng ngoại phân biệt chủng tộc người gốc Trung Quốc Đông Á, việc truyền bá thơng tin sai lệch trực tuyến vũ khí sinh học.[24] 1.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 nước giới 1.2.1 Tình hình dịch bệnh Covid-19 giới THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội Tính đến ngày 11/3/2022, chạm ngưỡng năm sau Tổ chức Y tế giới tuyên bố COVID-19 “đại dịch tồn cầu”, giới có 450 triệu ca mắc, 6,01 triệu ca tử vong 1.2.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 nước Tại Việt Nam, tính đến sáng 11/3/2022, Việt Nam có 5,26 triệu ca nhiễm, đứng thứ 20/225 quốc gia vùng lãnh thổ, cịn tính số ca mắc triệu dân nước ta đứng thứ 130 (bình quân triệu người có 53.253 ca mắc) [25] 1.3 Tổng quan vi rút SARS-CoV-2 1.3.1 Tên gọi Virus corona gây hội chứng hơ hấp cấp tính nặng 2, viết tắt SARSCoV-2 (tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2),[26] trước có tên virus corona 2019 (2019-nCoV) gọi virus corona người 2019 (HCoV-19 hCoV-19), chủng coronavirus gây bệnh viêm đường hô hấp cấp virus corona 2019 (COVID-19),[27] xuất lần vào tháng 12 năm 2019, đợt bùng phát đại dịch COVID-19 thành phố Vũ Hán, Trung Quốc bắt đầu lây lan nhanh chóng, sau trở thành đại dịch tồn cầu 1.3.2 Vi rút SARS-CoV-2 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 1.3.2.1 Cấu trúc Mỗi virion SARS-CoV-2 có đường kính 60–140 nanomet (2,4 × 10−6–5,5 × 10−6 in); [40] SARS-CoV-2 bao gồm loại protein cấu trúc khác nhau: N, S, E M Protein N, nucleocapsid, bao bọc gen, protein S (gai), E (vỏ) M (màng) bao gồm lớp vỏ kép lipid xung quanh [41] Đặc biệt protein S, cho phép virus lây nhiễm vào tế bào thông qua thụ thể ACE-2 màng tế bào sau dung hợp với màng Điều làm cho cấu trúc protein thụ thể tế bào chủ trở thành mục tiêu lý tưởng cho phương pháp điều trị 1.3.2.2 Bộ gene SARS-CoV-2 có gen RNA mạch đơn, tuyến tính, cảm nhận dương, dài khoảng 30.000 base [44] Bộ gen virus RNA sợi dương hoạt động RNA thông tin (mRNA) dịch mã trực tiếp thành protein tế bào chủ chúng Các chất trung gian RNA sợi âm tạo CoV đóng vai trị khn mẫu cho: tổng hợp RNA gen sợi dương, sau đóng gói protein cấu trúc để lắp ráp virion con; phiên mã RNA hệ gen Bộ gen có khuynh hướng nucleotide cytosine (C) guanine (G), giống coronavirus khác 1.3.2.3 Chu kỳ nhân virus Nhiễm virus bắt đầu phần tử virus liên kết với thụ thể tế bào bề mặt vật chủ Các thí nghiệm mơ hình protein protein đột biến virus sớm gợi ý SARS‑CoV‑2 có đủ lực với enzym chuyển đổi angiotensin (ACE2) tế bào người để sử dụng chúng chế xâm nhập tế bào THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội Protein, serine (TMPRSS2), protease xuyên màng, yếu tố cần thiết cho xâm nhập SARS ‑ CoV ‑ [49] Protein neuropilin (NRP1) tế bào chủ hỗ trợ virus xâm nhập vào tế bào vật chủ cách sử dụng ACE2 Sau virion SARS ‑ CoV ‑ gắn vào tế bào đích, TMPRSS2 tế bào cắt mở protein đột biến vi rút, để lộ peptid dung hợp tiểu đơn vị S2 thụ thể chủ ACE2 Sau dung hợp, endosome hình thành xung quanh virion, ngăn cách với phần cịn lại tế bào chủ Virion thoát độ pH endosome giảm xuống cathepsin, cysteine protease vật chủ, phân cắt Sau đó, virion giải phóng RNA vào tế bào buộc tế bào sản xuất phổ biến vi rút, vi rút lây nhiễm sang nhiều tế bào 1.3.3 Phát sinh lồi biến thể Có hàng nghìn biến thể SARS-CoV-2, nhóm lại thành nhóm lớn nhiều Một số danh pháp phân nhánh khác đề xuất Nextstrain chia biến thể thành năm nhóm (19A, 19B, 20A, 20B 20C), GISAID chia chúng thành bảy (L, O, V, S, G, GH GR) [50] Một số biến thể đáng ý SARS-CoV-2 xuất vào cuối năm 2020 Tổ chức Y tế Thế giới tuyên bố năm biến thể cần quan tâm, là: [51] • Alpha: Lineage B.1.1.7 xuất Vương quốc Anh vào tháng năm 2020, với chứng khả lây truyền độc lực gia tăng Các đột biến đáng ý bao gồm N501Y P681H THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội • Beta: Lineage B.1.351 xuất Nam Phi vào tháng năm 2020, với chứng khả lây truyền gia tăng thay đổi tính kháng nguyên, với số quan chức y tế công cộng đưa cảnh báo tác động hiệu số loại vắc xin Các đột biến đáng ý bao gồm K417N, E484K N501Y • Gamma: Lineage P.1 xuất Brazil vào tháng 11 năm 2020, với chứng khả lây truyền độc lực gia tăng, với thay đổi tính kháng nguyên Mối quan tâm tương tự hiệu vắc-xin nêu Các đột biến đáng ý bao gồm K417N, E484K N501Y • Delta: Lineage B.1.617.2 xuất Ấn Độ vào tháng 10 năm 2020 Cũng có chứng gia tăng khả lây truyền thay đổi tính kháng ngun • Omicron: Lineage B.1.1.529 xuất Botswana vào tháng 11 năm 2021 Các biến thể đáng ý khác bao gồm biến thể khác WHO định điều tra Cụm 5, xuất số chồn Đan Mạch dẫn đến chiến dịch diệt chồn khiến gần tuyệt chủng [51] 1.4 Vai trò xét nghiệm yếu tố ảnh hưởng đến kết xét nghiệm Sars-CoV-2 kỹ thuật Real Time RT-PCR 1.4.1 Real Time RT-PCR Tế bào, tất sinh vật điều hòa biểu gen chu kỳ phiên mã gen (RNA sợi đơn): Số lượng gen biểu tế bào đo số lượng phiên mã RNA gen có THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 12 1.7 Giới thiệu kít xét nghiệm chuẩn đốn SARS-CoV2 Việt Nam sản xuất Việt Nam sản xuất kít xét nghiệm Bộ Y tế cấp phép sử dụng phịng xét nghiệm COVID-19 là: + Một là: Bộ kit công ty Việt Á (ra mắt ngày 5-3-2020 đến ngày 24/4/2020, Tổ chức Y tế giới (WHO) công nhận đánh giá đạt chuẩn quốc tế + Hai kít Cơng ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất Bộ Y tế Việt Nam cấp số lưu hành vào ngày 7/5/2020 Bộ kit kết nghiên cứu nhà khoa học đến từ Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine sinh phẩm y tế Đại học Bách khoa Hà Nội, sau chuyển giao công nghệ cho công ty cổ phần Sao Thái Dương CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Sơ đồ nghiên cứu THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 13 Với mục tiêu nghiên cứu đặt ra, thực phương pháp nghiên cứu tương ứng trình bày cụ thể theo sơ đồ sau: Đánh giá sơ bộ kít (quy trình, thời gian, chi phí…) So sánh Ct CV kít kít xét nghiệm chuẩn Đánh giá khả phòng ngừa ngoại nhiễm sản Đánh giá kít Khảo sát thay đổi chu kỳ ngưỡng gộp mẫu Kiểm tra tương tác phản ứng PCR nhiễm mẫu máu Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 2.2 Đối tượng, thiết bị nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu bệnh phẩm bệnh nhân lấy mẫu, xét nghiệm Sars- CoV- lưu mẫu phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Quảng Nam - Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đoán Sars- CoV- Việt Nam sản xuất 2.3 Phương pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu việc lấy THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 14 mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu xét nghiệm mẫu phản ứng Realtime RT- PCR nhằm phát Vi rút Sars- CoV- Bộ Y tế quy định 2.3.1 Phương pháp biện luận kết Mẫu dương tính có đường khuyếch đại dạng log linear, máy hiển thị giá trị ct (40) Đối với mẫu cần lặp lại xét nghiệm 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm xử lý số liệu Excel, SPSS, để xử lý kết thu Để so sánh tìm khác biệt kit, paired sample t-test sử dụng Số liệu thí nghiệm kết trung bình cộng lần lặp lại Kết thí nghiệm xử lý để thu giá trị trung bình giá trị độ lệch chuẩn phần mềm Excel Giá trị hệ số biến thiên CV tính tốn dựa cơng thức đây: 𝐶𝑉% = 𝑆𝐷 × 100% 𝑋̅ CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá quy trình thực hiện, thời gian tiến hành, chi phí số số khác kit THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 15 Từ quy trình xét nghiệm kít, chúng tơi tiến hành so sánh, đánh giá kít thơng qua số: phương pháp tách chiết RNA, vùng gen phát hiện, đối chứng, thời gian thực hiện, chi phí v.v… cho xét nghiệm theo nội dung bảng đây: Các tiêu Phươ ng pháp tách chiết RNA Thời gian thực 01 xét nghiệm Bộ kít Việt Á Bộ kít Sao Thái Dương Phương pháp Phương pháp tách chiết hữu ly tâm, sử dụng màng lọc - Thời gian tách chiết: 50-60 phút; - Thời gian chạy phản ứng: 73 phút; - Thời tách chiết: phút; - Thời chạy phản 110’ gian 20-25 Yêu cầu kỹ thuật WHO dành cho kit phát SarsCoV-2 nucleic acid Tùy chọn - 4-5 - Lý tưởng < 3.5 h gian ứng: Tổng thời gian: Tổng thời gian: 123-133 phút 130-135 phút - Gen mục - Gen mục Vùng tiêu: N1, N2 gene phát tiêu gen N; vùng gen đặc hiệu THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - Ít hai mục tiêu độc lập Lưu hành nội 16 - Kênh màu FAM xác định trình tự mục tiêu SARS-CoV-2, màu TEXAS RED xác định SARS- like coronaviruses, màu HEX xác định chứng nội cho SARS-CoV-2 N3 (gen chung phát novel coronaviruses, có SARS-CoV-2); - Kênh màu ROX xác định gen N1, màu HEX xác định gen N2, màu FAM xác định gen N3, Cy5 xác định chứng nội Đối chứng âm - Đi kèm kit - Đi kèm kit - Phải có Đối chứng dương - Đi kèm kit - Đi kèm kit - Phải có (mồi – primer) Giới hạn phát (LOD) ≤ copy/ µL, loại bệnh phẩm đường hô hấp đường hô hấp ≤ copy/ µL, loại bệnh phẩm đường hô hấp đường hô hấp THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG gen SARSCoV-2 - Tuy nhiên, khu vực có lây lan SARS-CoV-2 lớn, vùng gen phát chấp nhận với mục tiêu phân biệt - Có thể chấp nhận: Tương đương với 10³ copy/ mL loại mẫu bệnh phẩm đường hô hấp - Mong muốn: Tương đương với 10² copy/mL Lưu hành nội 17 với mẫu bệnh phẩm bệnh phẩm đường hô hấp phân Tỉ lệ sai sót Chưa tìm thấy cơng bố Chưa tìm thấy cơng bố 40 >40 >40 SAO THÁI DƯƠNG >40 >40 >40 Đối với phương pháp gây nhiễm loại 02: Mẫu gây nhiễm RNA ban đầu cho kết dương tính với vi rút Sars-CoV-2 Ct 20,32 Bảng 3.4: Kết quả mẫu gây nhiễm loại LẦN LẦN LẦN VIỆT Á 23.15 24.98 24.41 SAO THÁI DƯƠNG 24.52 25.36 24.16 3.4 Khảo sát thay đổi số chu kỳ nhiệt gộp 4, gộp 9, gộp 14 mẫu âm tính với mẫu dương tính Sar-CoV- Bảng 3.5: Bảng giá trị Ct của mẫu gộp sau phản ứng Realtime RT-PCR kít Việt Á Sinh phẩm Việt Á (TB±độ lệch chuẩn) THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 22 Mẫu dương tính ban đầu (A1) Gộp mẫu (1 dương âm) (A2) Gộp 10 mẫu (1 dương âm) (A3) Gộp 15 mẫu (1 dương 14 âm) (A4) MẪU MẪU MẪU MẪU MẪU 12.27± 14.13± 18.78± 24.98± 29.91± 0.16 0.21 0.12 0.23 0.15 15.28± 17.32± 21.51± 26.60± 31.33± 0.21 0.2 0.18 0.07 0.22 16.65± 18.63± 23.16± 27.75± 32.11± 0.15 0.28 0.11 0.12 0.24 17.61± 19.14± 24.89± 28.88± 33.17± 0.28 0.32 0.22 0.24 0.24 Bảng 3.6: Bảng giá trị Ct của mẫu gộp sau phản ứng Realtime RT-PCR kít Sao Thái Dương Sinh phẩm Sao Thái Dương (TB±độ lệch chuẩn) Mẫu dương tính MẪU MẪU MẪU MẪU MẪU 16.22± 17.37± 23.99± 23,70± 25,75± THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội 23 ban đầu (B1) Gộp mẫu (1 dương âm) (B2) Gộp 10 mẫu (1 dương âm) (B3) Gộp 15 mẫu (1 dương 14 âm) (B4) 0.12 0.22 0.1 0.08 0.18 19.01± 20.00± 25.84± 25,28± 27,83± 0.21 0.22 0.14 0.14 0.18 20.35± 21.61± 26.77± 26,85± 28,15± 0.22 0.24 0.16 0.22 0.12 21.24± 0.21 23.32± 0.23 28.04± 0.12 27,97± 0.25 29,06± 0.32 Kết cho thấy, kit hoạt động cho mẫu gộp chí cho mẫu gộp lớn 15 mẫu Tuy việc gộp mẫu làm gia tăng giá trị Ct, nằm vùng phát dương tính (Ct