T NG QUAN V B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M
T ng quan v gen HBB (beta-hemoglobin)[44]
Gen beta-hemoglobin (HBB) mã hóa protein beta-globin, có kích th c 1606 bp (v trí nucleotide 5.246.695 ậ 5.248.300) trên NST 11p15.5.
Hình I.1: Hình nh c a gen HBB[44]
S đ t bi n trên gen HBB có th d n đ n 2 d ng bi n th chính:
t bi n đi m trên trình t gen HBB d n đ n s t ng h p chu i globin b t th ng (HbS, HbC, HbE, HbD, ).
Nhóm bi n th thalassemia d n đ n làm gi m ho c b t ho t s t ng h p chu i globin
Các bi n th c a HBB có t n s xu t hi n kho ng 1-1,5/1000
Hemoglobin đ c c u t o b i b n chu i globin bao g m 2 lo i hemoglobin: [2]
Hemoglobin bào thai (HbF) có hai chu i vƠ hai chu i ( β β).
Hemoglobin ng i l n (HbA) có hai chu i vƠ hai chu i ( β β).
M i ti u đ n v protein c a hemoglobin mang m t phân t heme Phân t này c n cho các t bƠo máu đ đ l y oxy t ph i và cung c p cho các t bào kh p c
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 4 th M t hemoglobin hoàn ch nh có kh n ng mang b n phân t oxy cùng m t lúc (m t phân t oxy g n v i m t phân t heme).[44]
B nh h ng c u hình li m (Sickle cell disease, SCD)
I.1.2.1 nh ngh a b nh h ng c u hình li m (SCD)
Bệnh huyết sắc tố hình liềm (Sickle cell disease - SCD) là một rối loạn di truyền về máu, xảy ra do sự thay đổi trong gen HBB, dẫn đến việc sản xuất hemoglobin hình liềm Điều này làm giảm khả năng vận chuyển oxy đến các tế bào, gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng.
Các d ng b t th ng c a ậ globin th ng x y ra v i m t ti u đ n v ậ globin b bi n đ i thành hemoglobin S (HbS), ti u đ n v ậ globin còn l i b đ t bi n thành hemoglobin C (HbC), hemoglobin E (HbE), [44]
Các d ng b nh h ng c u hình li m:
Dòng bệnh HbSS là kết quả của đột biến trên gen HBB, dẫn đến sự hình thành hemoglobin S (HbS) do sự thay thế acid glutamic bằng valine tại vị trí 6 của chuỗi polypeptide globin Đột biến này xảy ra tại exon 1 của gen globin, cụ thể là do sự thay đổi nucleotide từ GAG thành GTG Hemoglobin S gây ra các triệu chứng liên quan đến bệnh lý huyết học.
D ng b nh HbSC: d ng b nh h ng c u hình li m HbSC x y ra do s đ t bi n trên gen HBB đƣ t o nên các ti u đ n v ậ globin th HbS và HbC
Hemoglobin C (HbC) được hình thành do sự thay thế glutamic bằng lysine ở vị trí acid amin thứ 6 (Glu6Lys) Mặc dù triệu chứng của dạng bệnh HbSC khá biến động, nhưng nó cũng nghiêm trọng như bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm HbSS.
D ng b nh HbSE: d ng b nh h ng c u hình li m HbSE x y ra do s đ t bi n trên gen HBB đƣ t o nên các ti u đ n v ậ globin th HbS và HbE Th
Hemoglobin E (HbE) hình thành do sự thay thế glutamic bằng lysine tại vị trí acid amin 26 (Glu26Lys) Với biến dị này, người bệnh có thể trải qua các dấu hiệu và triệu chứng nghiêm trọng liên quan đến thiếu máu, bao gồm các đợt đau, thiếu máu và chức năng lách bị ảnh hưởng.
D ng b nh HbSD: d ng b nh h ng c u hình li m HbSD x y ra do s đ t bi n trên gen HBB đƣ t o nên các ti u đ n v ậ globin th HbS và HbD
Th hemoglobin D (HbD) hình thành do s thay th glutamic b ng glutamin v trí acid amin 121.[2]
M t d ng b nh khác là HbS BetaThal, đ c gây ra b i đ t bi n hemoglobin
HbS và beta thalassemia thường xảy ra đồng thời, dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng hơn so với tình trạng HbSC Các dấu hiệu và triệu chứng của HbS beta thalassemia có thể bao gồm cơn đau nghiêm trọng và tổn thương cơ quan Beta thalassemia hình thành do sự thiếu hụt chuỗi -globin.
SCD là một nhóm các rối loạn di truyền ảnh hưởng đến tính chất của hemoglobin, trong đó người bệnh mang hai gen globin bị đột biến Một trong những gen này luôn luôn có sự thay đổi cấu trúc liền mạch.
I.1.2.2 Các th b nh h ng c u hình li m [2]
Bệnh hình cầu hồng cầu có hai thể: thể đồng hợp tử và thể dị hợp tử Thể dị hợp tử HbAS không có biểu hiện lâm sàng, trong khi các thể dị hợp tử khác như HbSC, HbSD hoặc HbS Thalassemie lại có biểu hiện lâm sàng rõ ràng.
I.1.2.3 D u hi u c a b nh h ng c u hình li m [2]
D u hi u lâm sàng c a b nh h ng c u hình li m
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 6
B ng I.1 Các đ c đi m lâm sàng c a b nh h ng c u hình li m
Th b nh D u hi u lâm sàng
S t, đau kh p, đau b ng, đau x ng.
Vàng da, thi u máu, tan máu m n, có c n tan máu
R i lo n nh p tim, ngh n m ch
Lách to, có th b t n th ng gan, ph i, th n, m c treo ru t ho c võng m c m t
Thi u máu n ng, có c n tan máu.
Thi u máu, tan máu m n tính, có c n tan máu.
Thi u máu n ng, có c n tan máu nh
D u hi u sinh h c c a b nh h ng c u hình li m
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 7
B ng I.2 Các đ c đi m sinh h c c a b nh h ng c u hình li m
Huy t đ : thi u máu, tan máu m n H ng c u hình l i li m: 40 ậ 100%
T y đ : h ng c u t ng, có h ng c u hình li m
Lách đ : th y nhi u h ng c u li m
Bilirubin gián ti p gi m nh
i n di Hb: th y HbS t 77 ậ 78%; HbA 2 2,5%; HbF 5 ậ 10% có khi t i 25%; HbA không có.
HbSD i n di th y HbS và HbD
HbSC i n di Hb th y HbS 52,5%; HbC 43,5%; HbF
HbS Thalassemia i n di Hb th y HbS và HbF
i n di Hb th y HbA và HbS.
B nh h ng c u hình li m th HbSS[24]
Thiếu máu hồng cầu hình liềm (HbSS) là một bệnh di truyền do đột biến điểm (GAG GTG) trong exon 1 của gen globin, dẫn đến sự thay thế của acid glutamic bằng valine (Glu6Val) tại vị trí acid amin thứ sáu của chuỗi polypeptide α-globin Sự biến đổi này làm cho HbA chuyển thành HbS, gây ra tình trạng thiếu máu hồng cầu hình liềm.
Thiếu máu hồng cầu liềm là một bệnh lý nghiêm trọng liên quan đến máu, gây ra sự thay đổi hình dạng của tế bào máu do sự phân tách hemoglobin Kết quả của tình trạng này là sự sản xuất một dạng bất thường của hemoglobin gọi là HbS.
Người bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm (HbSS) là do di truyền gen HbS từ cả cha và mẹ Triệu chứng của bệnh này bao gồm thiếu máu do sự thay thế của hai tiểu đơn vị globin bằng HbS.
TÌNH HÌNH B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M
Tình hình trên th gi i
Bệnh hình cầu hồng cầu đầu tiên được công nhận là một rối loạn huyết học do Herrick phát hiện vào năm 1910 Đến năm 1949, Pauling công bố nghiên cứu về một loại huyết cầu có ảnh hưởng đến cấu trúc của các bệnh nhân thiếu máu, đây là một căn bệnh phân tán.
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), bệnh thiếu máu do thiếu hụt hemoglobin chủ yếu xảy ra ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhưng hiện nay đã trở thành vấn đề toàn cầu do di cư Bệnh này phổ biến hơn ở những người sống tại Châu Phi, các nước vùng Trung Á, Ấn Độ, Thái Bình Dương, bán đảo Ả Rập, miền Tây Nam Âu, Trung Mỹ (đặc biệt là Panama), và các khu vực thuộc vùng biển Caribe.
Bệnh hình cầu hình liềm (SCD) ảnh hưởng đến khoảng 1/500 người Mỹ gốc Phi và 1/1000 đến 1/1400 người Mỹ gốc Tây Ban Nha, với khoảng 70.000 người tại Hoa Kỳ và ít nhất 75.000 ca nhập viện hàng năm, gây tổn thất kinh tế hơn 500 triệu USD Hơn 2 triệu người Mỹ gốc Phi mang gen bệnh này.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 9
Bệnh thiếu máu ở Brazil có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở nhóm tuổi từ 0 đến 9, với tỷ lệ 31% Tỷ lệ nam giới mắc bệnh là 47,6% và nữ giới là 52,4%.
SCD (bệnh hồng cầu hình liềm) là một bệnh di truyền phổ biến tại các quốc gia ở Châu Phi, đặc biệt là trong khu vực Sahara, với tỷ lệ mang bệnh lên đến 30% trong dân số Ghana, trong khi chỉ có 2% trẻ sơ sinh mắc bệnh hình liềm Tanzania cũng ghi nhận tỷ lệ tử vong cao ở nhóm trẻ dưới 5 tuổi (9,1%), với tuổi thọ trung bình của nam là 7 tuổi và nữ là 9 tuổi Hemoglobin hình liềm là rối loạn di truyền phổ biến nhất trong các bệnh lý hồng cầu ở Trung và Nam Phi, được phát hiện lần đầu tiên tại một bệnh viện miền Nam vào năm 1950 Mỗi năm có khoảng 5.200 trẻ em sinh ra mắc bệnh hồng cầu hình liềm.
Rối loạn hemoglobin ảnh hưởng đến 60% dân số của 229 quốc gia, với 75% các ca sinh liên quan Tỷ lệ mắc bệnh này cao, với 71% quốc gia ghi nhận và 89% ca sinh bị ảnh hưởng Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ít nhất 5,2% dân số toàn cầu và hơn 7% phụ nữ mang thai có một dạng rối loạn hemoglobin Hemoglobin S chiếm 40% của các thể mang và gây ra hơn 80% các rối loạn, trong đó 85% là rối loạn hemoglobin hình cầu và hơn 70% ca sinh bệnh xảy ra tại châu Phi Ngoài ra, ít nhất 20% dân số toàn cầu mắc thalassemia.
Khoảng 1,1% các cặp vợ chồng trên toàn thế giới có nguy cơ sinh con mắc phải loạn hemoglobin, với tỷ lệ thai bẩm sinh là 2,7/1000 Tỷ lệ sinh con mắc bệnh này cao hơn ở những quốc gia có thu nhập cao, với 2,55/1000 trẻ em, trong khi ở những nước có thu nhập thấp, trẻ em sinh ra mắc bệnh này có nguy cơ cao hơn Tỷ lệ tử vong trẻ em dưới 5 tuổi trên toàn cầu là 3,4%, và ở châu Phi, con số này lên tới 6,4%.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 10
Tình hình b nh Vi t Nam
Tính đến năm 2014, Việt Nam vẫn chưa có số liệu thống kê đầy đủ về tình hình bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm Điều này cho thấy các nghiên cứu phân tích về bệnh này tại Việt Nam còn rất hạn chế Chính vì vậy, việc nghiên cứu tình hình bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm ở Việt Nam là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về mức độ ảnh hưởng của nó.
BI N CH NG C A B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M
t qu
t qu là m t bi n ch ng nghiêm tr ng c a thi u máu h ng c u hình li m
Thiếu máu cục bộ là một trong những biến chứng nghiêm trọng nhất của SCD, có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao Triệu chứng bao gồm đau nhức, tê chân tay và nhiều biểu hiện khác Nếu không được điều trị kịp thời, tình trạng này có thể gây nguy hiểm đến tính mạng.
H i ch ng ng c c p tính (ACS)
ACS là một bệnh lý phổ biến liên quan đến tình trạng thiếu máu, gây ra các triệu chứng như đau ngực, khó thở và khò khè Đây là một quá trình cấp tính và biến chứng đe dọa tính mạng của bệnh nhân thiếu máu hồng cầu hình liềm Nguyên nhân thường gặp do nhồi máu phổi, khi các tế bào hồng cầu hình liềm chặn mạch máu, dẫn đến tình trạng tắc nghẽn ACS là biến chứng phổ biến thứ hai của SCD, với tỷ lệ khoảng 1β,8 trường hợp trên 100 bệnh nhân mỗi năm.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 11 ch ng d ng này gây ra kho ng β5% tr ng h p t vong đ i v i b nh này.
T n th ng c quan m n tính
ơy lƠ các đ t đ ng h ng c u trong lách, ho i t c p tính th n, bi n ch ng m t, ho i t
Động hành của cầu trong lách có thể dẫn đến đau cấp tính và phình to của lách do việc tắc nghẽn của mạch máu lớn hình liềm Bệnh nhân có thể gặp phải triệu chứng như sưng lên và rối loạn cơn đau Sau các đợt lặp đi lặp lại của việc động hành cầu trong lách, lá lách sẽ bị sưng, xơ hóa, co lại và bảo vệ nhịp điệu.
Hội chứng suy thận mạn (SCD) là tình trạng mà thận không còn khả năng lọc máu hiệu quả, dẫn đến tích tụ các chất độc hại trong cơ thể Người mắc SCD có thể gặp phải những biến chứng nghiêm trọng, bao gồm suy thận toàn phần Việc theo dõi và quản lý tình trạng này là rất quan trọng để ngăn ngừa sự tiến triển của bệnh và bảo vệ sức khỏe thận.
Hội chứng đau mạn tính ở vùng hông và các khớp liên quan có thể do kết quả của thiếu máu cục bộ, dẫn đến tình trạng đau nhức, sưng và các triệu chứng nghiêm trọng khác Tình trạng này không chỉ gây khó khăn trong việc vận động mà còn ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống, có thể dẫn đến tàn tật nếu không được điều trị kịp thời.
Nhồi máu trên khuôn mặt có thể dẫn đến tình trạng giảm cung cấp oxy cho võng mạc, gây ảnh hưởng đến các mô mắt và làm tổn thương tế bào hình nón Tình trạng này có thể dẫn đến bệnh võng mạc, bệnh võng mạc tự sinh, xuất huyết và bong võng mạc, từ đó gây ra nguy cơ mù lòa.
Bệnh HbSS có thể gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng, bao gồm tắc nghẽn mạch máu dẫn đến cơn đau, thậm chí là tử vong Các biến chứng này có thể gây ra loét, hoại tử và dẫn đến nhiễm trùng toàn thân, đồng thời có thể gây ra biến chứng xơ hóa.
I.4 TỄC NG C A B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 12
B nh nh h ng đ n s c kh e c a tr em c v th ch t l n trí tu T l t vong c a tr em d i 5 tu i chơu Phi lƠ 5% vƠ 16% tr ng h p t vong các qu c gia tây Phi.
Trẻ em mắc bệnh SCA thường gặp khó khăn trong quá trình tiếp thu kiến thức, điều này được ghi nhận bởi Ezenwosu và cộng sự (2013) Nghiên cứu chỉ ra rằng trẻ em SCA có nguy cơ học tập kém do chỉ số IQ thấp hơn, ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng trí tuệ Tỷ lệ trẻ em từ 2-15 tuổi mắc SCA có nguy cơ cao hơn so với các trẻ em khác, với 12% ca tử vong ở trẻ em mắc bệnh này liên quan đến tình trạng thiếu máu Bệnh nhân SCA ở độ tuổi trên 15 có nguy cơ phát triển các biến chứng nghiêm trọng hơn so với những người không mắc bệnh.
Trẻ em từ 15 tuổi trở lên có nguy cơ phát triển nhồi máu não, liên quan đến suy giảm nhận thức và kết quả học tập kém Khoảng 11% bệnh nhân dưới 20 tuổi bị ảnh hưởng Trong số 300.000 ca sinh trên toàn cầu, 75% trẻ em mắc bệnh này, và 50-80% trong số họ sẽ gặp khó khăn khi trưởng thành.
Sự phát triển của thai nhi phụ thuộc vào sự cung cấp oxy và dinh dưỡng từ nhau thai Thiếu oxy và dinh dưỡng có thể dẫn đến các biến chứng như sinh non hoặc trẻ có cân nặng thấp khi ra đời.
Kho ng 30% b nh nhơn ng i l n b thi u máu h ng c u hình li m có t ng áp ph i.[24]
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 13
I.5 CỄC PH NG PHỄP CH N OỄN B NH THI U MÁU
Xét nghiệm máu là một phần quan trọng trong sàng lọc sức khỏe, giúp kiểm tra nồng độ hemoglobin S Quy trình này thường được thực hiện tại bệnh viện, trong đó mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch hoặc thu thập từ ngón tay hoặc gót chân Mẫu máu sau đó được gửi đến phòng thí nghiệm để tiến hành xét nghiệm xác định hemoglobin S.
Xét nghiệm âm tính cho thấy không có tế bào ung thư hình liềm Nếu xét nghiệm dương tính, cần thực hiện các xét nghiệm bổ sung để xác định sự hiện diện của một hoặc nhiều gen tế bào ung thư hình liềm.
Huyết tắc tĩnh mạch là tình trạng thiếu máu hồng cầu bình thường Xét nghiệm phiến đồ máu nhuộm khô có thể cho thấy một số tế bào hồng cầu hình liềm, với hình dạng dài và nhọn ở hai đầu Thường gặp tình trạng này trong thời gian có cơn khủng hoảng.
Thí nghiệm tạo hình liềm cho thấy rằng hình dạng liềm của hồng cầu có liên quan đến sự hiện diện của hemoglobin S Khi thêm một dung dịch Metabisulfit Na 2% vào mẫu máu, chất khử oxy này làm giảm độ hòa tan của hemoglobin S, dẫn đến sự hình thành hồng cầu hình liềm.
K thu t đi n di hemoglobin đ c áp d ng đ u tiên vào th p niên 19γ0, sau đó đ c áp d ng r ng rãi trong ch n đoán b nh ng i trong nh ng n m 1950 ậ 1960
Kỹ thuật này cho phép phát hiện các dạng đa hình (polymorphism) người dựa trên nguyên tắc có sự biến đổi trong trình tự DNA mã hóa cho gen, dẫn đến sự khác biệt trong trình tự axit amin trong protein.
K thu t đi n di hemoglobin giúp phân tách các th Hb khác nhau (s khác bi t m c t ng amino acid)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 14
I.5.4 Ph ng pháp PCR (Polymerase chain reaction)
Ph ng pháp PCR ra đ i b i Karl Mullis và c ng s vƠo n m 1985.[4,5]
Nguyên t c c a ph ng pháp PCR:
Sao chép DNA diễn ra khi có sự tham gia của enzyme DNA polymerase, giúp tổng hợp mạch DNA mới bằng cách kết hợp với mạch DNA khuôn và các dNTP trong điều kiện phù hợp Phản ứng PCR là quá trình khuếch đại DNA mạch khuôn theo chu kỳ nhân, với mỗi phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại, trong đó mỗi chu kỳ bao gồm ba bước cơ bản.
Trong phản ứng PCR, các thành phần chính bao gồm dNTP, Mg2+, Taq polymerase và DNA mẫu khuôn DNA mẫu khuôn sẽ bị biến tính bởi tác nhân nhiệt để tạo thành mẫu DNA mới Nhiệt độ này cần phải cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA khuôn mẫu, thường vào khoảng 94-95°C trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 1 phút, đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
CÁC PH NG PHÁP CH N OÁN B NH THI U MÁU H NG C U HÌNH LI M
Xét nghi m máu
Xét nghiệm máu là một phần quan trọng trong sàng lọc sức khỏe, giúp kiểm tra nồng độ hemoglobin S Trong quá trình xét nghiệm, mẫu máu thường được lấy từ cánh tay, ngón tay hoặc gót chân Mẫu máu này sau đó được gửi đến phòng thí nghiệm để thực hiện các xét nghiệm sàng lọc hemoglobin S.
Xét nghiệm âm tính cho thấy không có tế bào ung thư hình dạng lạ Nếu kết quả xét nghiệm là dương tính, cần thực hiện thêm các xét nghiệm để xác định sự có mặt của các gen tế bào ung thư hình dạng lạ.
Xét nghi m c n lâm sàng
Huyết tắc là tình trạng thiếu máu hồng cầu bình thường Xét nghiệm huyết đồ máu khô có thể cho thấy sự hiện diện của các tế bào hồng cầu hình liềm, với đặc điểm là hai đầu kéo dài và nhọn Thường gặp tình trạng này trong thời gian có cơn thiếu máu.
Thí nghiệm tạo hình liềm cho thấy rằng các hình dạng cấu trúc liềm sẽ ảnh hưởng đến khả năng của máu, đặc biệt là khi thêm một giọt Metabisulfit Na 2% vào mẫu máu Chất khử oxy này sẽ làm giảm độ hòa tan của hemoglobin S.
i n di hemoglobin
K thu t đi n di hemoglobin đ c áp d ng đ u tiên vào th p niên 19γ0, sau đó đ c áp d ng r ng rãi trong ch n đoán b nh ng i trong nh ng n m 1950 ậ 1960
Kỹ thuật này cho phép phát hiện các dạng đa hình (polymorphism) của người dựa trên nguyên tắc có sự biến đổi trong trình tự DNA mã hóa cho gen, ảnh hưởng đến trình tự axit amin trong protein.
K thu t đi n di hemoglobin giúp phân tách các th Hb khác nhau (s khác bi t m c t ng amino acid)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 14
Ph ng pháp PCR (Polymerase chain reaction)
Ph ng pháp PCR ra đ i b i Karl Mullis và c ng s vƠo n m 1985.[4,5]
Nguyên t c c a ph ng pháp PCR:
Quá trình sao chép DNA diễn ra khi có sự tham gia của enzyme DNA polymerase, giúp tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và các dNTP trong điều kiện thích hợp Phản ứng PCR là phương pháp khuếch đại DNA mẫu theo cấp số nhân, bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm ba bước cơ bản.
Trong phản ứng PCR, các thành phần chính bao gồm dNTP, Mg2+, Taq polymerase và DNA mẫu khuôn DNA mẫu khuôn sẽ bị biến tính bởi tác nhân nhiệt, với nhiệt độ phải cao hơn Tm của DNA khuôn mẫu, thường nằm trong khoảng 94-95 độ C trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
B c 2: LƠ giai đo n lai (hybridization) là quá trình mà các mối liên kết được hình thành giữa các mảnh khuôn nhi t, tùy thuộc vào nhiệt độ phản ứng Nhiệt độ lý tưởng cho giai đo n này thường dao động trong khoảng 40 đến 70 độ C và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của DNA polymerase là khoảng 72°C, giúp tổng hợp sản phẩm hiệu quả Thời gian kéo dài của quá trình sao chép DNA phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ vài giây đến nhiều phút Đây là giai đoạn kéo dài (elongation) trong quá trình tổng hợp DNA.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 15
Hình I.2: Hình nh mô t các b c trong ph n ng PCR (P1 và P2: các đo n m i-Primers) [49Error! Reference source not found.]
Kỹ thuật PCR đã được các nhà khoa học áp dụng từ năm 1989 để chẩn đoán trước sinh và vẫn là phương pháp phù hợp nhất trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về bệnh lâm sàng hiện nay.
Ph ng pháp gi i trình t
Kỹ thuật phân tích trình tự gen bằng máy tự động dựa trên nguyên tắc Sanger sử dụng 4 loại dideoxynucleotide triphosphat (ddNTP) được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang khác nhau để kết thúc chuỗi DNA Kỹ thuật này cho phép phân tích trình tự gen trước khi tiếp tục bằng máy tự động có thể phân tích từ 300 đến 1000 nucleotide trong một phản ứng Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi để phát hiện nhanh các biến thể di truyền hoặc xóa đoạn gen đơn giản.
Ph n ng gi i trình t t ng t nh PCR, nh ng ch s d ng m t m i duy nh t
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Ngân - 1053012479 Trang 16 Do đó, chính nạp được chuỗi DNA đần Với sự hiển diện của các ddNTP phân ng, có thể kết thúc ngẫu nhiên bất cứ vị trí nào Kết quả cuối cùng là tạo nên nhiều đoạn DNA đần có độ dài khác nhau được gắn huỳnh quang của ddNTP đầu 3'.
Sau khi được xử lý, mẫu DNA sẽ được đưa vào hệ thống phân tích, nơi kích thước của các đoạn DNA được phân biệt một cách nhanh chóng Hệ thống này sử dụng phương pháp phát quang để ghi lại dữ liệu, cho phép xác định chính xác các đoạn DNA trong mẫu.
M t s ph ng pháp khác
Ph ng pháp SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
SNP (single nucleotide polymorphism) là ph ng pháp xác đ nh đ c các d ng allele đ t bi n ho c hoang d i d a trên s đ t bi n t i v trí m t nucleotide c a trình t DNA m c tiêu.[39]
B nh thi u máu h ng c u hình li m đ c phát hi n b ng ph ng pháp SNP
Phương pháp xác định DNA cho phép phân biệt rõ ràng các biến thể gen như HbSS, HbAS và DNA bình thường Ngoài phương pháp này, còn nhiều kỹ thuật khác như RFLP, SSCP và Real-time PCR cũng được sử dụng để phân tích DNA.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479
PH N II: V T LI U VẨ PH NG
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 18
PH NG PHÁP NGHIÊN C U
Khai thác d li u
Khai thác thông tin từ ngân hàng dữ liệu của NCBI (National Center for Biotechnology Information) là rất quan trọng Chúng tôi sử dụng PubMed và PubMed Central để tìm kiếm các báo cáo và công trình nghiên cứu liên quan đến đột biến trên gen HBB Các phương pháp được áp dụng nhằm phát hiện đột biến, giúp xác định đột biến trên gen thông qua các phương pháp phát hiện phù hợp, thích hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Kh o sát in silico ậ thi t k m i
Chúng tôi đã thu nhận trình tự nucleotide của gen HBB (hoàng đế vỏ đậu biển) từ cơ sở dữ liệu gen NCBI Sau đó, chúng tôi tiến hành so sánh sự tương đồng giữa các trình tự thu thập được bằng phần mềm Seaview để kiểm tra và phân tích.
Thu th p các c p m i: chúng tôi thu th p t t c các h ậc p m i t các bƠi báo nghiên c u khoa h c.
Ph ng pháp kh o sát các c p m i, thi t k m i.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích và khảo sát các đặc tính, thông số vật lý và tính chất đặc hiệu của các cấp môi thu thập được từ các báo cáo nghiên cứu khoa học, từ đó hỗ trợ cho việc thiết kế mới Một số công cụ tin sinh học đã được sử dụng trong quá trình phân tích và khảo sát các cấp môi.
IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/): giúp xác đ nh các thông s quan tr ng c a m i nh kích th c, thƠnh
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 19 ph n GC, nhi t đ lai, kh n ng t o hairpin loop, primer-dimer, hetero- dimer,
Annhyb: ki m tra v trí b t c p c a m i vƠ kích th c s n ph m.
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) v i các thông s m c đ nh s n trên NCBI: nh m xác đ nh đ đ c hi u c a h - c p m i.
Seaview4: so sánh s t ng đ ng c a hai hay nhi u trình t sinh h c.
Kh o sát th c nghi m
Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA, trong đó màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó, protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và loại bỏ DNA bền sẽ được tách ra với ethanol lạnh.
Máy ly tơm l nh (Hettich)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 20
B c 1: Thu d ch n i: L y 100 àl d ch mỏu t tube mỏu ch ng đụng EDTA cho vƠo ng eppendorf lo i 1,5 ml, ly tơm 1γ.000 vòng/phút trong 10 phút nhi t đ phòng, thu d ch n i.
B c β: B sung 500 àl H2O, vortex 10.000 vũng/phỳt trong 5 phỳt.
B c γ: B sung m t th tích dung d ch ly gi i (NaCl 5M, Tris - HCl 1M (pH
8), EDTA 0,5M (pH 8), SDS 10%, H 2 O), vƠ proteinase K (18,5 mg/ml), tr n đ u Sau đó, đem d ch 56 o C trong β4 gi
B c 4: B sung m t th tích phù h p dung d ch phenol:chloroform (t l 1:1)
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong γ phút, nhi t đ phòng Thu d ch n i, chuy n sang eppendorf m i.
B c 5: B sung m t th tích dung d ch chloroform Ly tơm 1γ.000 vòng/phút trong γ phút, nhi t đ phòng Thu d ch n i.
B c 6: Thêm 0,β l n th tích Ammonium acetate 5M vƠ β,5 l n th tích Ethanol tuy t đ i (tr l nh) Ly tơm 1γ.000 vòng/γ0 phút, 4 o C Thu t a.
B c 7: R a t a l i b ng Ethanol 70%, ly tơm 1γ.000 vòng/15 phút, 4 o C Thu t a, đ khụ t nhiờn B sung 50àl dung d ch TE, b o qu n -20 o C.
II.2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph
Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 260 nm Giá trị quang phổ OD260nm của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch, với A260nm = 1 OD tương đương với 50 µg/ml DNA Tính chất của DNA cũng được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280.
Ph n ng PCR
Thi t b : Máy PCR (Bio Rad)
Hoá ch t: Mastermix 2X (Taq pol)
Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th tớch β5àl v i c p m i HBB1-F và HBB1-R, thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c a ph n ng PCR nh B ng II.1 vƠ B ng II.β
B ng II.1 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và HBB1-R
ThƠnh ph n Th tớch (àl)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 22
B ng II.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và
Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th tớch β5àl v i c p m i HBBβ-F và HBB2-R, thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c a ph n ng PCR nh B ng II.γ vƠ B ng II.4
B ng II.3 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và HBB2-R
ThƠnh ph n Th tớch (àl)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 23
B ng II.4 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và
X, Y lƠ nhi t đ lai đ c xác đ nh d a vƠo kho ng nhi t đ nóng ch y c a các c p m i nêu trên.
Ph ng pháp đi n di
Các acid nucleic, như DNA, di chuyển trong môi trường gel agarose khi chịu tác động của điện trường Sự di chuyển này phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử DNA Để quan sát các acid nucleic, người ta sử dụng chất nhuộm ethidium bromide, có khả năng phát quang dưới ánh sáng UV do gắn vào các base của acid nucleic Kích thước của các acid nucleic được xác định bằng cách so sánh với kích thước của các chuẩn trên thang chuẩn.
Thi t b : Bu ng đi n di (Bio Rad)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 24
Hoá ch t: Gel agarose (Bio Basic)
S d ng kho ng 5 - 10 àl s n ph m PCR ho c l ng DNA b gen sau tỏch chi t đ ti n hƠnh đi n di trên gel agarose 1,5% hi u đi n th 70V trong 75 phút
K t qu đi n di đ c th hi n b ng các v ch s n ph m, v i ch t nhu m lƠ ethidium bromide.
Ph ng pháp gi i trình t
Các mẫu sau khi điền đầy đủ thông tin và sản phẩm có kích thước trên 500 bp hoặc trên 800 bp thì tiến hành gửi mẫu giới thiệu tới Công ty Nam Khoa Biotek với các sản phẩm (bao gồm cả các công phẩm đi kèm) phù hợp.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479
PH N III: K T QU VÀ BÀN LU N
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 26
KHAI THÁC D LI U
III.1.1 Thu th p bài báo
Chúng tôi đã thu thập nhiều bài báo từ Pubmed và Pubmed Central (PMC) của ngân hàng dữ liệu NCBI, cung cấp thông tin quan trọng về bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, bao gồm sự đột biến trên gen HBB, cách di truyền và biến chứng của bệnh, cũng như tình hình bệnh SCA trên thế giới và tại Việt Nam Việc thu thập các bài báo được thực hiện trong khoảng thời gian từ năm 2001 đến năm 2018 Dựa trên dữ liệu khoa học này, chúng tôi xác định các đột biến trên gen HBB với tỷ lệ đột biến trung bình/tổng số công trình nghiên cứu, dữ liệu này được trình bày trong bảng III.1 và bảng III.2.
Kết quả phân tích ghi nhận tỷ lệ đột biến HbSS khoảng 73% trên thế giới, đây là đột biến liên quan đến bệnh thiếu máu hình liềm Chúng tôi đã tìm hiểu và ghi nhận có sự đa dạng phương pháp sinh học phân tử được áp dụng trong phân tích đột biến trên gen HBB gây bệnh thiếu máu hình liềm, bao gồm PCR và Realtime-PCR.
Trong bối cảnh phòng thí nghiệm sinh học tại Đại học MTP.HCM, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các quy trình phân tích đất biển, đặc biệt là phương pháp phân tích HbSS Các kỹ thuật chính được áp dụng bao gồm AS-PCR và PCR giải trình tự, nhằm đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong quá trình phân tích.
B ng III.1 Các d ng đ t bi n trên gen HBB
(Glu Val) Codon th 6 trên chu i -globin, exon 1, NST 11p15.5
HbSC HbC: Glu Lys Codon th 6 trên chu i -globin, exon 1, NST 11p15.5
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 27
B ng III.2 T l các th đ t bi n trên gen HBB t bi n T l (%) Ngu n trích d n
B ng III.3 Các ph ng pháp đ c s d ng trong xác đ nh đ t bi n
Ph ng pháp Ngu n trích d n
III.1.2 Thu th p trình t gen HBB
Chúng tôi thu th p đ c 12 trình t gen HBB trên ngân hàng d li u gen NCBI, thông tin chi ti t đ c trình bày trong b ng III.4.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 28
B ng III.4 Thông tin trình t gen HBB thu th p trên NCBI
STT Mã truy c p Tên trình t Chi u dài
1 EF105856 Homo sapiens beta ậ globin (HBB) gene, HBB-Hb sickle ậ Monroe allele, exon 1,2 and partial CDS
2 AY351657 Homo sapiens hemoglobin beta gene, repeat region
3 DQ029041 Homo sapiens beta globin chain
(HBB) gene exon 1,2 and partial CDS
4 AF391283 Homo sapiens 11p15.5 clone LOH
5 AY998983 Homo sapiens beta globin (HBB) gene, HBB ậ Raleigh allele, exon 2 and partial CDS
6 FJ876835 Homo sapiens beta globin gene, exon 1,2 and partial CDS
7 AF007546 Homo sapiens beta-globin gene ậ complete CDS
8 AY013299 Homo sapiens mutant beta ậ globin
(HBB) gene HBB ậ YN ậ 6 allele,
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 29 exon 1 and partial CDS
9 U01317 Human beta globin region on chromosome 11
10 U20223 Human thalassemia beta globin gene, complete CDS
11 M34058 Human beta globin gene from a thalassemia patient, complete CDS
12 NM000518 Homo sapiens hemoglobin, beta
III.1.3 Thu th p b m i xác đ nh đ t bi n gen HBB
D a vào công trình nghiên c u c a tác gi Waterfall C.M và c ng s (2001)
[39] chúng tôi thu th p b m i xác đ nh s đ t bi n trên gen HBB đ c trình bày chi ti t trong b ng III.5.
B ng III.5 Các h m i thu th p đ c
Tên m i Trình t Chi u dài Ngu n trích d n
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 30
KH O SÁT IN SILICO
Vùng trình t mƣ hóa cho -hemoglobin (HBB) n m v trí 6β.1γ7 ậ 63.742 trên nhi m s c th s 11(U01γ17.1) có kích th c 1606 bp Gen HBB có 3 exon:
Exon 1 có v trí t 6β.1γ7 ậ6β.β78 exon 1, v trí nucleotide 62.206 (trình t U01γ17.1) thu c codon 6 b đ t bi n: A T.
Dựa trên dữ liệu trình tự gen HBB thu thập từ Genbank, chúng tôi đã tiến hành phân tích mức độ tương đồng giữa các trình tự gen HBB bằng công cụ Blast và Seaview Kết quả khảo sát cho thấy trình tự 7 và 9 có sự tương đồng cao (>99%) so với các trình tự khác mã hóa gen HBB Từ đó, chúng tôi đã chọn trình tự 7 (AF007546) để tiếp tục nghiên cứu.
Trình tự gen 9 (U01317) được sử dụng để tham chiếu trong việc khảo sát các cấp độ mRNA thu thập được Trình tự 7 (AF007546) là trình tự gen -globin của một loài ở Trung Quốc, trong khi trình tự 9 (U01317) là trình tự gen -globin nằm trên nhiễm sắc thể 11 Mối liên hệ giữa trình tự 7 (AF007546) và trình tự 9 (U01317) được trình bày trong phần phụ lục 1 Kết quả phân tích Blast của trình tự 7 (AF007546) được trình bày trong phần phụ lục 2.
Chúng tôi sử dụng phần mềm phân tích IDT để xác định các thông số của mẫu tham khảo trong báo cáo, bao gồm chiều dài mũi, nhiệt độ nóng chảy, %GC, và năng lượng hình thành cấu trúc thực phẩm G Các thông số của mẫu và vị trí bậc cấp được trình bày trong bảng III.6.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 31
B ng III.6 Các thông s v t lý c a m i
Tên m i Trình t Chi u dài Tm %GC G
Ghi chú: 1: kh n ng hình thành c u trúc c p tóc (hairpin loop), 2: kh n ng t b t c p c a m i (self-dimer), 3: kh n ng b t c p chéo c a m i (hetero-dimer)
Các công trình nghiên cứu về bệnh thiếu máu hình liềm đã áp dụng nhiều phương pháp như PCR, SNPs, ARMS và giải trình tự Trong điều kiện thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp AS-PCR hoặc PCR kết hợp với giải trình tự để phân tích đột biến trên gen HBB gây bệnh thiếu máu hình liềm Chúng tôi đã thu thập được hai đoạn HBB1-F và HBB2-F để bổ sung vào nghiên cứu gen này.
Mỗi gen HBB1-F và HBBβ-F đều có nucleotide A ở vị trí đầu γ', với HBB1-F tương ứng với nucleotide T trên trình tự không biến đổi của gen β-globin bình thường, trong khi HBBβ-F có nucleotide T trên trình tự biến đổi của gen HBB Các cặp nucleotide này được sử dụng trong hai phương pháp AS-PCR riêng biệt để xác định chính xác.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 32 allele hoang d i vƠ đ t bi n các m u b nh ph m máu có nghi ng ho c đ c ch n đoán b b nh SCA
Các thông s v t lỦ m i cho th y r ng %GC, n ng l ng t do hình thƠnh c u trúc th c p G < 9 đ u phù h p v i h ng d n c a hãng IDT nh m đ m b o tính hi u qu c a c p m i HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R.
Chúng tôi s d ng ph n m m Annhyb và công c Blast (NCBI) đ đánh giá đ đ c hi u c a các c p m i tham chi u đ c mô t b ng III.7, b ng III.8, ph l c 3
B ng III.7 Kh o sát đ đ c hi u c a m i HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R b ng ph n m m Annhyb
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 33
B ng III.8 đ c hi u c a h m i b ng công c Blast
NM000519.3 32.2 100.00% 5.8 95.00% Homo sapiens hemoglobin, delta (HBD), mRNA
NM000518.4 32.2 100.00% 5.8 95.00% Homo sapiens hemoglobin, beta (HBB), mRNA
NC018922.2 42.1 100.00% 0.01 100.00% Homo sapiens chromosome 11, alternate assembly CHM1_1.1
AC000143.1 42.1 100.00% 0.01 100.00% Homo sapiens chromosome 11, alternate assembly HuRef
HBB2-F NM000518.4 40.1 95.00% 0.02 100.00% Homo sapiens hemoglobin, beta
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 34
NC018922.2 40.1 100.00% 0.02 100.00% Homo sapiens chromosome 11, alternate assembly CHM1_1.1
NC018922.2 42.1 100.00% 0.01 100.00% Homo sapiens chromosome 11, alternate assembly CHM1_1.1
AC000143.1 42.1 100.00% 0.01 100.00% Homo sapiens chromosome 11, alternate assembly HuRef
Chúng tôi s d ng ph n m m Annhyb đ kh o sát đ đ c hi u c a m i HBB1-
Trình tự gen HBB được nghiên cứu với hai phiên bản HBB1-F và HBB1-R, trong đó HBB1-F nằm ở vị trí bắt cặp định hướng từ 51 đến 70, còn HBB1-R nằm ở vị trí bắt cặp định hướng từ 547 đến 567 Sản phẩm khu vực này có chiều dài 517 bp Kết quả nghiên cứu được trình bày trong phụ lục γ Đồng thời, chúng tôi cũng ghi nhận phiên bản mới HBBβ-R có vị trí bắt cặp so với trình tự 7 (AF007546) với giá trị đồng nhất đạt 57,6%.
Sau khi đánh giá mối bang IDT và kiểm tra độ chính xác của mối bang phần mềm Annhyb và công cụ Blast (NCBI), chúng tôi quyết định sử dụng các primer HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R cho nghiên cứu thực nghiệm.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 35
Hình III.1: Hình nh mô t v trí khu ch đ i vùng gen HBB c a b m i
HBB1-F và HBB1-R, HBB2-F và HBB2-R
KH O SÁT TH C NGHI M
B ng III.9 K t qu đo OD DNA b gen ng i c a 3 m u b nh ph m
B ng III.9 trình bày m t s k t qu đo OD s n ph m DNA b gen ng i đ c tách chi t t γ m u b nh ph m, giá tr OD Aβ60/Aβ80