Nguyên t c:
Chúng tôi s d ng ph ng pháp phenol/chloroform đ tách chi t DNA. Trong đó, mƠng t bƠo vƠ mƠng nhơn đ c bi n tính b ng ch t t y m nh. Sau đó protein s đ c bi n tính b ng phenol/chloroform vƠ b lo i b . DNA b gen s đ c t a v i ethanol l nh.
Thi t b vƠ hóa ch t
Thi t b :
Máy ly tơm l nh (Hettich)
B n nhi t (Thermo Final Test)
Hóa ch t: Phenol (TBR) Chloroform (Merck) NaCl 5M Tris HCl 1M (pH=8) EDTA 0,5M (pH=8) SDS 10% Ammonium acetate 5M
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 20
Ethanol 100% (Merck)
Ethanol 70% (Merck)
Proteinase K (Fermentas) Các b c ti n hành
B c 1: Thu d ch n i: L y 100 µl d ch máu t tube máu ch ng đông EDTA cho vƠo ng eppendorf lo i 1,5 ml, ly tơm 1γ.000 vòng/phút trong 10 phút nhi t đ phòng, thu d ch n i.
B c β: B sung 500 µl H2O, vortex 10.000 vịng/phút trong 5 phút.
B c γ: B sung m t th tích dung d ch ly gi i (NaCl 5M, Tris - HCl 1M (pH 8), EDTA 0,5M (pH 8), SDS 10%, H2O), vƠ proteinase K (18,5 mg/ml), tr n đ u.
Sau đó, đem d ch 56oC trong β4 gi .
B c 4: B sung m t th tích phù h p dung d ch phenol:chloroform (t l 1:1).
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong γ phút, nhi t đ phòng. Thu d ch n i, chuy n sang eppendorf m i.
B c 5: B sung m t th tích dung d ch chloroform. Ly tơm 1γ.000 vòng/phút trong γ phút, nhi t đ phòng. Thu d ch n i.
B c 6: Thêm 0,β l n th tích Ammonium acetate 5M vƠ β,5 l n th tích Ethanol tuy t đ i (tr l nh). Ly tơm 1γ.000 vòng/γ0 phút, 4oC. Thu t a.
B c 7: R a t a l i b ng Ethanol 70%, ly tơm 1γ.000 vòng/15 phút, 4o C.
Thu t a, đ khô t nhiên. B sung 50µl dung d ch TE, b o qu n -20oC.
II.2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph
Nguyên t c:
HƠm l ng DNA có th xác đ nh đ c nh s h p thu m nh ánh sáng b c sóng β60 nm. Giá tr m t đ quang OD260nm c a các m u DNA cho phép xác đ nh n ng đ DNA trong dung d ch (v i A260nm= 1 OD = 50 µg/ml DNA s i đơi). tinh s ch c a DNA đ c đánh giá qua t l A260/A280.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 21 Thi t b vƠ hóa ch t:
Thi t b : Máy đo quang ph (Bio Rad)
Hoá ch t: N c c t hai l n. Các b c ti n hƠnh:
DNA sau khi tách chi t đ c pha loƣng 80 l n b ng n c c t vơ trùng. Sau đó chuy n t t c dung d ch vƠo cuvette vƠ đo OD b c sóng β60 nm và OD260/OD280,
xác đ nh n ng đ DNA sau tách chi t.
II.2.3.3 Ph n ng PCR
Thi t b , hóa ch t:
Thi t b : Máy PCR (Bio Rad) Hoá ch t: Mastermix 2X (Taq pol) M i (IDT)
N c c t hai l n.
Các b c ti n hƠnh:
Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th tích β5µl v i c p m i HBB1-F và
HBB1-R, thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c a ph n ng PCR nh B ng II.1 vƠ B ng II.β.
B ng II.1. Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và HBB1-R ThƠnh ph n Th tích (µl) Mastermix 2X 12,5 M i HBB1-F (10 µM) 0,5 M i HBB1-R (10 µM) 0,5 DNA (ng/µl) 3 - 6 H2O 5 ậ 8 T ng 25
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 22
B ng II.2. Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB1-F và HBB1-R B c Nhi t đ (0C) Th i gian S chu k 1 95 6 phút 1 2 95 30 giây X 30 giây 72 35 giây 40 3 72 10 phút 1 Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th tích β5µl v i c p m i HBBβ-F và HBB2-R, thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c a ph n ng PCR nh B ng II.γ vƠ B ng II.4.
B ng II.3. Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và HBB2-R ThƠnh ph n Th tích (µl) Mastermix 2X 12,5 M i HBBβ-F (10 µM) 0,75 M i HBBβ-R (10 µM) 0,75 DNA (ng/µl) 3 - 6 H2O 5 - 8 T ng 25
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 23
B ng II.4. Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i HBB2-F và HBB2-R B c Nhi t đ (0C) Th i gian S chu k 1 95 6 phút 1 2 95 30 giây Y 30 giây 72 35 giây 40 3 72 10 phút 1
X, Y lƠ nhi t đ lai đ c xác đ nh d a vƠo kho ng nhi t đ nóng ch y c a các c p m i nêu trên.
II.2.3.4 Ph ng pháp đi n di Nguyên t c:
Các acid nucleic lƠ các đ i phơn t tích đi n ơm, trong đi n tr ng các phơn t DNA s di chuy n v phía c c d ng c a đi n tr ng. T c đ di chuy n ph thu c vƠo kh i l ng vƠ c u trúc c a phơn t DNA. Các acid nucleic trong gel agarose s đ c ghi l i d i tia t ngo i (UV) nh ethidium bromide. Ch t nƠy có kh n ng g n xen vƠo gi a các base c a acid nucleic vƠ phát quang d i tác d ng c a tia t ngo i ( =γ00 nm). Kích th c c a các acid nucleic s đ c xác đ nh khi so sánh v i kích th c đƣ bi t tr c c a thang chu n.
Thi t b , hóa ch t:
Thi t b : Bu ng đi n di (Bio Rad)
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 24 Hoá ch t: Gel agarose (Bio Basic)
TAE Buffer 25X (Bio Basic)
Ethidium bromide (Bio Rad)
Các b c ti n hƠnh:
S d ng kho ng 5 - 10 µl s n ph m PCR ho c l ng DNA b gen sau tách chi t đ ti n hƠnh đi n di trên gel agarose 1,5% hi u đi n th 70V trong 75 phút. K t qu đi n di đ c th hi n b ng các v ch s n ph m, v i ch t nhu m lƠ ethidium
bromide.
II.2.3.5 Ph ng pháp gi i trình t
Các m u sau khi đi n di ra v ch s n ph m có kích th c trên 500 bp ho c trên β00 bp thì ti n hƠnh g i m u gi i trình t Cơng ty Nam Khoa Biotek v i l ng s n ph m (β0µl) v i các c p m i phù h p.
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479
Sinh viên th c hi n: Nguy n Th Thu Ngân - 1053012479 Trang 26
III.1 KHAI THÁC D LI U