VI SINH NÔNG NGHIỆP VI SINH vật cố ĐỊNH đạm tự DO

VI SINH NÔNG NGHIỆP VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO NHÓM 9: GVHD: ThS Nguyễn Mỹ Phi Long Lê Anh Tuấn – 19150236 Nguyễn Hồ Phú Lộc – 19150376 Lê Nguyễn Thảo Ngân – 19150389 VÒNG TUẦN HOÀN NITO TRONG TỰ NHIÊN  Ngược lại với trình nitrat hố q trình phản nitrat hố, tức trình khử nitrat thành nitơ phân tử Sau trình phản nitrat hố, nitrat chuyển thành nitơ phân tử bay vào khơng khí  Những tổn thất nitơ q trình phản nitrat hố gây nên bù đắp lại nhờ trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ, tức q trình chuyển hố nitơ phân tử thành hợp chất chứa nitơ Clostridium pausterianum Giống Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử phần lớn di động, thuỷ giải sacchoride prơtêin Nhiều lồi thuỷ giải prơtêin chuyển hố khơng hồn tồn axit amin tạo thành mùi khó chịu sản phẩm Lồi có hoạt tính cố định nitơ cao Clostridium pasteurianum Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6 µm, thường có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm đầu tế bào Bào tử có kích thước lớn rộng tế bào dinh dưỡng, mang bào tử tế bào có hình thoi Khuẩn lạc trắng, phẳng sáng Clostridium pausterianum  Clostridium đồng hố nguồn thức ăn nitơ vơ hữu Về thức ăn cacbon, chúng sử dụng nhiều loại hợp chất khác So với Azotobacter chúng mẫn cảm K, P, Ca có tính ổn định cao pH thấp cao môi trường  Clostridium phát triển thích hợp đất có độ ẩm vào khoảng 60-80% so với độ ẩm tuyệt đối Chúng phát triển tốt lớp đất cày có chất hữu phong phú  Chỉ có loại Clostridium ưa ẩm có khả đồng cố định nitơ phân tử, chúng tốt nhiệt độ 25 – 30oC  Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thường có hoạt tính cố định cao lồi Clostridium khác Khi đồng hố hết 1g thức ăn bon, chúng thường tích luỹ khoảng 5-10mg nitơ Khả cố định nitơ loài chi Clostridium phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy PHÂN LẬP Thu mẫu Dùng dao vô trùng lấy kg đất ở độ sâu – 30cm thuộc chỗ khác theo phương pháp dựng đường chéo rồi trộn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đã khử trùng để đựng đất, loại bỏ rễ và vật lạ Ghi nhận, bảo quản và phân tích tại phòng thí nghiệm Tiến hành phân lập theo quy trình sau: Cân chính xác các thành phần của môi trường Đun sôi, điều chỉnh pH = Cho vào 1/3 erlen Cho vào petri Cấy dịch đã pha lỏng ở các nồng độ khác Dùng trang thủy tinh trang đều Nuôi ở tủ ấm 30oC – ngày (khi có khuẩn lạc) Glucoza (saccaroza) 20g 0,3g K2HPO4 0,2g CaHPO4 0,3g MgSO4 0,2g K2SO4 NaCl 0,5g 0,01-0,1g FeC3 5g CaCO3 Hỗn hợp nguyên tô vi 1ml lượng Nước cất * Môi trường1000ml Phedorop Glucoza K2HPO4 MgSO4 NaCl, FeSO4OMnSO4 Nước Hỗn hợp nguyên tố vi lượng H3PO3 20g 1g 0,5g Vi lượng 1000ml 5g 5g (NH4)MO7O24 KI 0,5g NaBr 0,5g 0,2g ZnSO4 0,3g Al2(SO4)3 Nước 0,3g * Môi trường vinogradxki Lấy một ít đất (clost gặp ở cả đất axit và đất mềm) pha loãng - lần lấy một ít cặn CaCO3 từ đáy ống nghiệm cấy sang ống khác Nuôi -3 lần cấy chuyền vậy Khuẩn lạc sẽ xuất hiện bên lớp thạch tròn sau vài ngày nuôi cấy Dùng trang thủy tinh phân phối đều huyền phù vi sinh vật lên bề mặt thạch Sau đó đặt vào tủ ấm nuôi 30oC – ngày Khuẩn lạc xuất hiện, theo dõi thường xuyên Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác đứng riêng rẽ Dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc vi sinh vật đó cấy lên ống thạch nghiêng, đem nuôi ở nhiệt độ 30 – 35oC THEO DÕI SINH TRƯỞNG Khi biết tốc độ sinh trưởng ta tính số hệ dự đoán số lượng tế bào sau thời gian ni cấy định từ đưa vào ứng dụng sản xuất Nuôi đĩa petri, đo kích thước (micromet) của khuẩn lạc bằng thước đo palmer thời gian 24 giờ hoặc 48 giờ hoặc 72 giờ Từ đó tốc độ sinh trưởng theo Blachman (1981) P = (Wt-Wo)x100%/Wo Wo là số đo lần đầu Wt là số đo lần sau tại thời điểm t Đường cong sinh trưởng của quần thể vi khuẩn nuôi cấy khơng liên tục XÁC ĐỊNH SỚ LƯỢNG VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP CFU (colony-forming unit) - Từ mẫu ban đầu sau đó pha loãng theo dãy thập phân Cấy vào môi trường thạch vô trùng Nuôi ở 30oC – ngày Xác định số lượng khuẩn lạc đĩa petri Tính số lượng theo công thức                                                            N A  (CFU/g hay CFU/ml)   = ———————————– Trong đó: -                                                 n1Vf1 +…+ n2Vf2 - A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu) N: tổng số khuẩn lạc đếm được các đĩa đã chọn (25-250 khuẩn lạc theo FDA Food ang Drug Asministration) ni: Số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng ỨNG DỤNG •Đã có rất nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum (dịch nuôi cấy hoặc dịch nuôi cấy trộn với đất đã khử trùng) để bón cho trờng •Mợt sớ trường hợp thu được những hiệu quả dương tính khá rõ rệt (nhất là phối hợp với Azotobacterin) •Tuy nhiên hiệu quả thường khơng ởn định và cho đến người ta vẫn chưa giải thích được một cách dứt khoác là trường hợp có tác động dương tính thì chủ yếu là sự cố định nito hoặc là tích lũy những chất có hoạt tính sinh học cao Kết nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Azotobacter Từ 20 mẫu đất thu thập, phân lập 14 chủng vi khuẩn có khả Azotobacter mọc tạo khuẩn lạc môi trường phân lập đặc hiệu không chứa nguồn nitơ Trong số 14 chủng phân lập, có chủng sinh trưởng phát triển mạnh môi trường Ashby Kết nhận dạng chủng vi khuẩn đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào vi khuẩn, xác định số đặc điểm sinh hóa (theo khóa phân loại Bergey, 1989) cho phép khẳng định chủng vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ, gram âm, tạo bào nang với thành dày, có khả di động, có hoạt tính catalase oxidase, có khả đồng hóa mannitol, glucose, lactose, fructose, sucrose (bảng 1) Bảng Phân lập nhận dạng chủng Azotobacter sau 72 nuôi cấy môi trường Ashby mannitol agar 300C Kết nghiên cứu Tuyển chọn chủng có khả cố định nitơ Kết nhận cho thấy chủng Azotobacter có khả cố định nitơ (vì chủng sinh trưởng mơi trường Ashby agar khơng chứa nitơ → chúng có khả cố định N2 thành NH4+) Bảng Khả cố định nitơ chủng Azotobacter sau 72 giờ, ni lắc 125 vịng/phút, 300C Kết nghiên cứu Tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp IAA Kết khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter cho thấy chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA Trong số chủng vi khuẩn phân lập, có chủng AZT1 AZT7 vừa có khả cố định nitơ, vừa sinh IAA với hàm lượng cao Bảng Khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter sau 72 ni lắc 125 vịng/phút 300C Kết nghiên cứu Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy Bảng Ảnh hưởng pH môi trường nguồn carbon đến khả sinh trưởng, cố định nitơ sinh tổng hợp IAA chủng AZT1 AZT7 Beijerinckia indica Beijerinckia vi khuẩn dị dưỡng, hiếu khí, gram âm, khơng sinh bào tử, tế bào chúng có hình dạng thay đổi (hình que, hình cầu hình bầu dục), già tạo nên hình thái khác thường Chúng tiết nhiều enzyme nitrogenase có khả khử nitơ Vi khuẩn Beijerinckia chịu chua cao nhiều so với Azotobacter, phát triển mơi trường có pH = 3, phát triển mơi trường trung tính kiềm yếu Beijerinckia indica có tốc độ cố định nito phân tử nhanh nhóm Beijerinckia Tế bào có kích thước 0.5 – 1,5 x 1,7 – 3,0 µm, di động khơng di động, có khả sinh sắc tố già, sắc tố có màu từ đỏ đến nâu, sắc tố khơng khuếch tán vào mơi trường Khuẩn lạc có dạng lồi, mép phẳng, nhầy Beijerinckia indica • Vi khuẩn thuộc giống Beijerinckia thường cố định 16 – 20 mg nito phân tử đồng hóa hết 1g chất lượng Beijerinckia thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, chúng đồng hóa tốt loại monosaccharide, disaccharide tinh bột, đồng hóa acid hữu • pH thích hợp Beijerinckia 4,5 – 6,0 ; pH = 3,0 phát triển Và chúng phát triển nhiệt độ 16 – 37oC Ngoài chúng có khả giữ sức sống lâu 0oC thấp PHÂN LẬP: 1) Lấy mẫu: Lấy mẫu đất xung quanh vùng rễ cây: lúa, ngô, khoai nước,… nơi có độ ẩm cao đất có tính axit trung tính Độ sâu thu mẫu đất – 20 cm Dùng tay tách nhẹ phần đất bám quanh rễ lúa cho vào túi nylon vơ trùng đưa phịng thí nghiệm để phân lập Nếu mẫu xa phải trữ lạnh đưa phịng thí nghiệm nhanh chóng 2) Tiến hành phân lập theo quy trình sau: Cân chính xác các thành phần của môi trường Đun sôi, điều chỉnh pH = 6,5 Cho 10 g mẫu đất, thêm 90 ml nước cất vô trùng vào erlen Pha loảng mẫu ở các nồng độ khác từ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,…,10-10 Hút 50 µl mẫu (ở nồng độ) nhỏ lên đĩa thạch Dùng que thủy tinh vô trùng trải mẫu Ủ tủ ấm 30oC – ngày (khi có khuẩn lạc) Hợp chất Số lượng Đơn vị Đường Glucose 10.0 K2HPO4 0.8 KH2PO4 0.2 MgSO4 x H2O 0.1 FeSO4 x H2O 20.0 MnSO4 x H2O 2.0 ZnSO4 x H2O 5.0 CuSO4 x H2O 4.0 Na2MoO4 x H2O 5.0 Thạch 15.0 Nước cất 950.0 Lưu ý: Điều chỉnh pH đến 6,5 Khử trùng riêng glucose (10g phẩm 50 ml H2O) trộn sau để nguội Môi trường Beijerinckia Medium (DSMZ Medium 111) g g g g mg mg mg mg mg g ml chế Xác định hàm lượng NH4 + vi khuẩn tạo phương pháp so màu (thuốc thử phenol nitroprusside) Hút cẩn thận 0,5 ml phần dịch sau ly tâm dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa sẵn ml nước cất khử trùng cộng với 0,5 ml EDTA Thêm ml dung dịch Phenol nitroprusside ml dung dịch Sodium hypocloride vào ống, trộn dung dịch máy Vortex Để ổn định nhiệt độ phịng khoảng 30 phút Sau tiến hành đo OD bước sóng 636 nm (OD636nm) Kết đo OD dòng vi khuẩn thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ suy hàm lượng ammonium sinh dung dịch Xác định hàm lượng nitrogenase tạo phương pháp khử acetylene: _ Tiến hành bơm acetylene vào ống nghiệm có chứa vi khuẩn, lấy ml chạy sắc ký để xác định lượng khí ethylene sinh acetylene lại quy hàm lượng nitrogenase (Tilak et al., 2006) Phương pháp nhận diện vi khuẩn Định danh vi khuẩn phương pháp giải trình tự gen 16S Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA theo phương pháp Sanger, sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 Sequence Analysis Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA mẫu so sánh với đoạn gen mã hóa 16S rRNA cơng bố Blast Search Sử dụng phần mềm Clustal X, Bioedit để phân loại chủng vi khuẩn Xử lý số liệu: Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excel 2010 Statistix 10.0 ỨNG DỤNG • Một số nghiên cứu cho biết lực cố định nito B indica B fluminensis tăng lên nhiều có mặt lồi nấm men Lipomyces starkey (Y Dommergues, 1965) • Ngồi Beijerinckia cịn ứng dụng trình ngâm chiết sinh học tuyển khoáng Lipomyces starkey Bảng Hiệu sử dụng số phân vi sinh cố định đạm trồng CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI ... que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc vi sinh vật đó cấy lên ống thạch nghiêng, đem nuôi ở nhiệt độ 30 – 35oC THEO DO? ?I SINH TRƯỞNG Khi biết tốc độ sinh trưởng ta tính số... khả sinh tổng hợp IAA Kết khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter cho thấy chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA Trong số chủng vi khuẩn phân lập, có chủng AZT1 AZT7 vừa có khả cố định nitơ, vừa sinh. .. cố định nitơ tự - Vi khuẩn Azotobacter quan tâm không khả cung cấp dinh dưỡng nitơ mà cịn có khả kích thích nảy mầm, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật SƠ LƯỢC Chủng vi sinh cố định đạm