VI SINH NÔNG NGHIỆP VI SINH vật cố ĐỊNH đạm tự DO

VI SINH NÔNG NGHIỆP VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO NHÓM 9: Lê Anh Tuấn – 19150236 Nguyễn Hồ Phú Lộc – 19150376 Lê Nguyễn Thảo Ngân – 19150389 GVHD: ThS Nguyễn Mỹ Phi Long VÒNG TUẦN HOÀN NITO TRONG TỰ NHIÊN  Ngược lại với trình nitrat hố q trình phản nitrat hố, tức trình khử nitrat thành nitơ phân tử Sau trình phản nitrat hố, nitrat chuyển thành nitơ phân tử bay vào khơng khí  Những tổn thất nitơ q trình phản nitrat hố gây nên bù đắp lại nhờ mợt q trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ, tức q trình chuyển hố nitơ phân tử thành hợp chất chứa nitơ Clostridium pausterianum Giống Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử phần lớn di đợng, thuỷ giải sacchoride prơtêin Nhiều lồi thuỷ giải prơtêin chuyển hố khơng hồn tồn axit amin tạo thành mùi rất khó chịu sản phẩm Lồi có hoạt tính cố định nitơ cao nhất Clostridium pasteurianum Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6 µm, thường có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm mợt đầu tế bào Bào tử có kích thước lớn rợng tế bào dinh dưỡng, mang bào tử tế bào có hình thoi Khuẩn lạc trắng, phẳng sáng Clostridium pausterianum  Clostridium đờng hố ng̀n thức ăn nitơ vơ hữu Về thức ăn cacbon, chúng sử dụng nhiều loại hợp chất khác So với Azotobacter chúng mẫn cảm K, P, Ca có tính ổn định cao pH thấp cao môi trường  Clostridium phát triển thích hợp đất có đợ ẩm vào khoảng 60-80% so với độ ẩm tuyệt đối Chúng phát triển tốt lớp đất cày có chất hữu phong phú  o Chỉ có loại Clostridium ưa ẩm có khả đồng cố định nitơ phân tử, chúng tốt nhất nhiệt độ 25 – 30 C  Vi khuẩn tḥc lồi Clostridium pasteurianum thường có hoạt tính cố định cao lồi Clostridium khác Khi đờng hố hết 1g thức ăn bon, chúng thường tích luỹ khoảng 5-10mg nitơ Khả cố định nitơ lồi chi Clostridium cịn phụ tḥc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy PHÂN LẬP Tiến hành phân lập theo quy trình sau: Cân xác thành phần môi trường Thu mẫu Đun sôi, điều chỉnh pH = Dùng dao vô trùng lấy kg đất độ sâu – 30cm thuộc chỗ khác theo phương pháp dựng đường chéo rồi trợn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đã khử trùng để đựng đất, loại bỏ rễ vật lạ Ghi nhận, bảo quản phân tích phịng thí nghiệm Cho vào 1/3 erlen Cho vào petri Cấy dịch đã pha lỏng nồng độ khác Dùng trang thủy tinh trang o Nuôi tủ ấm 30 C – ngày (khi có khuẩn lạc) Glucoza 20g K2HPO4 1g MgSO4 0,5g NaCl, FeSO4OMnSO4 Vi lượng Nước 1000ml Glucoza (saccaroza) 20g K2HPO4 0,3g CaHPO4 0,2g MgSO4 0,3g K2SO4 0,2g Hỗn hợp nguyên tố vi lượng H3PO3 5g NaCl 0,5g (NH4)MO7O24 5g FeC3 0,01-0,1g KI 0,5g CaCO3 5g NaBr 0,5g Hỗn hợp nguyên tô vi lượng 1ml ZnSO4 0,2g Nước cất 1000ml Al2(SO4)3 0,3g Nước 0,3g * Môi trường Phedorop * Môi trường vinogradxki Lấy mợt đất (clost gặp cả đất axit đất mềm) pha loãng - lần lấy một cặn CaCO từ đáy ống nghiệm cấy sang ống khác Nuôi -3 lần cấy chuyền vậy Khuẩn lạc xuất bên lớp thạch tròn sau vài ngày nuôi cấy Dùng trang thủy tinh phân phối huyền phù vi sinh vật lên bề mặt thạch Sau đặt vào tủ o ấm ni 30 C – ngày Khuẩn lạc xuất hiện, theo dõi thường xuyên Chọn khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác đứng riêng rẽ Dùng que cấy lấy mợt vi sinh vật khuẩn lạc vi sinh o vật cấy lên ống thạch nghiêng, đem nuôi nhiệt độ 30 – 35 C THEO DÕI SINH TRƯỞNG Khi biết tốc độ sinh trưởng ta tính số hệ dự đốn số lượng tế bào sau mợt thời gian ni cấy nhất định từ đưa vào ứng dụng sản xuất Nuôi đĩa petri, đo kích thước (micromet) khuẩn lạc thước đo palmer thời gian 24 48 72 Từ tốc đợ sinh trưởng theo Blachman (1981) P = (Wt-Wo)x100%/Wo Wo số đo lần đầu Wt số đo lần sau thời điểm t Đường cong sinh trưởng quần thể vi khuẩn nuôi cấy khơng liên tục XÁC ĐỊNH SỚ LƯỢNG VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP CFU (colony-forming unit) - Từ mẫu ban đầu sau pha loãng theo dãy thập phân Cấy vào môi trường thạch vô trùng o Nuôi 30 C – ngày Xác định số lượng khuẩn lạc đĩa petri Tính số lượng theo công thức                                                            N A  (CFU/g hay CFU/ml)   = ———————————–                                                 n1Vf1 +…+ n2Vf2 Trong đó: - A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu) - N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa đã chọn (25-250 khuẩn lạc theo FDA Food ang Drug Asministration) - ni: Số đĩa cấy đợ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng ỨNG DỤNG •Đã có rất nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum (dịch nuôi cấy dịch nuôi cấy trộn với đất đã khử trùng) để bón cho trờng •Mợt số trường hợp thu hiệu quả dương tính rõ rệt (nhất phối hợp với Azotobacterin) •Tuy nhiên hiệu quả thường không ổn định người ta chưa giải thích mợt cách dứt khốc trường hợp có tác đợng dương tính chủ yếu sự cố định nito tích lũy chất có hoạt tính sinh học cao Kết nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Azotobacter Từ 20 mẫu đất thu thập, đã phân lập 14 chủng vi khuẩn có khả Azotobacter mọc tạo khuẩn lạc môi trường phân lập đặc hiệu không chứa nguồn nitơ Trong số 14 chủng đã phân lập, có chủng sinh trưởng phát triển mạnh môi trường Ashby Kết quả nhận dạng chủng vi khuẩn đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào vi khuẩn, xác định một số đặc điểm sinh hóa (theo khóa phân loại Bergey, 1989) cho phép khẳng định chủng vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ, gram âm, tạo bào nang với thành dày, có khả di đợng, có hoạt tính catalase oxidase, có khả đờng hóa mannitol, glucose, lactose, fructose, sucrose (bảng 1) Bảng Phân lập nhận dạng chủng Azotobacter sau 72 nuôi cấy môi trường Ashby mannitol agar 30 0C Kết nghiên cứu Tuyển chọn chủng có khả cố định nitơ Kết quả nhận cho thấy cả chủng Azotobacter có khả cố định nitơ (vì chủng sinh trưởng môi trường Ashby agar không chứa nitơ → chúng có khả + cố định N2 thành NH4 ) Bảng Khả cố định nitơ chủng Azotobacter sau 72 giờ, nuôi lắc 125 vòng/phút, 30 C Kết nghiên cứu Tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp IAA Kết quả khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter cho thấy cả chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA Trong số chủng vi khuẩn đã phân lập, có chủng AZT1 AZT7 vừa có khả cố định nitơ, vừa sinh IAA với hàm lượng cao Bảng Khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter sau 72 nuôi lắc 125 vòng/phút 30 C Kết nghiên cứu Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy Bảng Ảnh hưởng pH môi trường nguồn carbon đến khả sinh trưởng, cố định nitơ sinh tổng hợp IAA chủng AZT1 AZT7 Beijerinckia indica Beijerinckia vi khuẩn dị dưỡng, hiếu khí, gram âm, khơng sinh bào tử, tế bào chúng có hình dạng thay đổi (hình que, hình cầu hình bầu dục), già tạo nên hình thái rất khác thường Chúng tiết nhiều enzyme nitrogenase có khả khử nitơ Vi khuẩn Beijerinckia chịu chua cao nhiều so với Azotobacter, phát triển cả mơi trường có pH = 3, phát triển mơi trường trung tính kiềm yếu Beijerinckia indica có tốc đợ cố định nito phân tử nhanh nhất nhóm Beijerinckia Tế bào có kích thước 0.5 – 1,5 x 1,7 – 3,0 µm, di đợng khơng di đợng, có khả sinh sắc tố già, sắc tố có màu từ đỏ đến nâu, sắc tố khơng khuếch tán vào mơi trường Khuẩn lạc có dạng lồi, mép phẳng, nhầy Beijerinckia indica • Vi khuẩn thuộc giống Beijerinckia thường cố định 16 – 20 mg nito phân tử đồng hóa hết 1g chất lượng Beijerinckia thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, chúng đồng hóa tốt loại monosaccharide, disaccharide tinh bột, đồng hóa acid hữu • pH thích hợp Beijerinckia 4,5 – 6,0 ; pH = 3,0 phát triển Và chúng phát o o triển nhiệt độ 16 – 37 C Ngồi chúng có khả giữ sức sống lâu C thấp PHÂN LẬP: 1) Lấy mẫu: Lấy mẫu đất xung quanh vùng rễ cây: lúa, ngơ, khoai nước,… nơi có độ ẩm cao đất có tính axit trung tính Độ sâu thu mẫu đất – 20 cm Dùng tay tách nhẹ phần đất bám quanh rễ lúa cho vào túi nylon vô trùng đưa phịng thí nghiệm để phân lập Nếu mẫu xa phải trữ lạnh đưa phịng thí nghiệm nhanh chóng 2) Tiên hanh phân lâp theo quy trinh sau: Cân xác thành phần mơi trường Đun sôi, điều chỉnh pH = 6,5 Cho 10 g mẫu đất, thêm 90 ml nước cất vô trùng vào erlen -1 -2 -3 -4 -10 Pha loảng mẫu nồng đ ô khác từ 10 , 10 , 10 , 10 ,…,10 Hút 50 µl mẫu (ở nồng độ) nhỏ lên đĩa thạch Dùng que thủy tinh vô trùng trải mẫu Ủ tủ ấm 30oC – ngày (khi có khuẩn lạc) Môi trường Beijerinckia Medium (DSMZ Medium 111) Xác định hàm lượng NH4 + vi khuẩn tạo phương pháp so màu (thuốc thử phenol - nitroprusside) Hút cẩn thận 0,5 ml phần dịch sau ly tâm dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn ml nước cất khử trùng cộng với 0,5 ml EDTA Thêm ml dung dịch Phenol nitroprusside ml dung dịch Sodium hypocloride vào mỗi ống, trộn dung dịch máy Vortex Để ổn định nhiệt đợ phịng khoảng 30 phút Sau tiến hành đo OD bước sóng 636 nm (OD636nm) Kết quả đo OD dòng vi khuẩn thay vào phương trình đờ thị đường chuẩn, từ suy hàm lượng ammonium sinh dung dịch Xác định hàm lượng nitrogenase được tạo phương pháp khử acetylene: _ Tiến hành bơm acetylene vào ống nghiệm có chứa vi khuẩn, lấy ml chạy sắc ký để xác định lượng khí ethylene sinh acetylene cịn lại quy hàm lượng nitrogenase (Tilak et al., 2006) Phương pháp nhận diện vi khuẩn Định danh vi khuẩn phương pháp giải trình tự gen 16S Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA theo phương pháp Sanger, sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 Sequence Analysis Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA mẫu so sánh với đoạn gen mã hóa 16S rRNA đã cơng bố Blast Search Sử dụng phần mềm Clustal X, Bioedit để phân loại chủng vi khuẩn Xử lý số liệu: Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excel 2010 Statistix 10.0 ỨNG DỤNG • Một số nghiên cứu cho biết lực cố định nito B indica B fluminensis tăng lên nhiều có mặt lồi nấm men Lipomyces starkey (Y Dommergues, 1965) • Ngồi Beijerinckia cịn ứng dụng trình ngâm chiết sinh học tuyển khoáng Lipomyces starkey Bảng Hiệu sử dụng số phân vi sinh cố định đạm trồng CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI ... rẽ Dùng que cấy lấy mợt vi sinh vật khuẩn lạc vi sinh o vật cấy lên ống thạch nghiêng, đem nuôi nhiệt độ 30 – 35 C THEO DO? ?I SINH TRƯỞNG Khi biết tốc độ sinh trưởng ta tính số hệ dự... khả cố định nitơ tự - Vi khuẩn Azotobacter quan tâm không khả cung cấp dinh dưỡng nitơ mà cịn có khả kích thích nảy mầm, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật Chủng vi sinh cố định đạm... sinh trưởng theo Blachman (1981) P = (Wt-Wo)x100%/Wo Wo số đo lần đầu Wt số đo lần sau thời điểm t Đường cong sinh trưởng quần thể vi khuẩn nuôi cấy khơng liên tục XÁC ĐỊNH SỚ LƯỢNG VI SINH