do an chuyen mon pdf

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên vòm lá với hàng nghìn quả đó là các loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y học, năng lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán và điều kiện nghèo phân bón. Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và khắc phục được sự tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian. Kỹ thuật tái tổ hợp AND và các kỹ thuật in vitro mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền. Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt. Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành khoa học hiện đại này, chúng tôi xin giới thiệu quyển sách công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các cơ quan có liên quan. Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn. Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế nuôi cấy mô tế bào SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 1 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp. Từ những thực tế nêu trên tôi chọn đề tài: “Tìm hiểu về tổng quan các phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống cho cây thân gỗ” SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 2 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ 1.1. Khái niệm nuôi cấy mô và nhân giống cây thân gỗ Nuôi cấy mô là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo ở điều kiện môi trường. Nhân giống in vitro hay còn gọi vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác. Thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ cho mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro. Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture). Vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây thân gỗ. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm. Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng mà không đề cập các nội dung khác. Nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ: cây mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 3 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp. Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau 4- 8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ như cây mọc từ hạt. 1.2. Lịch sử phát triển Năm 1838, nhà thực vật học Matthias Jacob Schleiden và năm 1839 nhà động vật học Theodor Schwann mới chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết khẳng định rằng: Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào. Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thể của tế bào. Theo ông mỗi tế bào bất kì của một thể sinh vật đa bào đều có tiềm tàng để phát triển nhanh thành một cá thể hoàn chỉnh. Năm 1898 Ông bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn tách từ nhu mô lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật nhưng không thu được kết quả nào. Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sự sinh trưởng này chỉ diễn ra trong một thời gian rồi chậm dần và ngừng hẳn mặc dù đã chuyển sang môi trường mới. Cùng trong thời gian này, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hormone thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công . Năm 1955, Miller và cs đã phát minh SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 4 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin- một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng khác nhau. Năm 1952, Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phương pháp vô tính khác nhau, đặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh. Năm 1960, Morel đã thực hiện kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật. Năm 1960, Cocking tách được tế bào trần. Năm 1971, Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần đầu tiên thực hiện lai tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo được cây lai soma "Cà chua Thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x), cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai). SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 5 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20,000 lít. Năm 1978, Tabata và cs đã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. Họ đã chọn lọc được dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985, Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn đã được thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất sinh dược. 1.3. Nguyên lý thực hiện 1.3.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genome). Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. 1.3.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào sự phân hoá. Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hoá có thể diễn như sau: SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 6 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năngcủa tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4- SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 7 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus). 1.2. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau: 1.2.1. Môi trường nuôi cấy Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể. Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau: + Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994). SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 8 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG + Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH 4 + và NO 3 - (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO 3 - của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH 4 + . Nhưng đôi khi NO 3 - gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất. + Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg, Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường được thuận lợi. Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựachọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình thànhchồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn. Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l). Việc lựa chọn thành phầnvà hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng. + Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóngvai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994). + Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, cà rốt, chối, khoai tây được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 9 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy. 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy. + Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6- Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 10 [...]... môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ + Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 11 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình... trên cơ sở thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử nghiệm môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh chồi bằng cách thay đổi thành phần chất khoáng và sự có mặt của Cytokynin (BAP, Kinetin) riêng rẽ hay phối hợp SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 29 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG + Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để có thể hoàn... qua hai con đường nuôi cấy cơ quan và nuôi cấy phôi Thông dụng là nuôi cấy cơ quan nuôi cấy cơ quan và nuôi cấy phôi khác nhau ở chỗ phát sinh chồi ngọn hay chồi bên đầu tiên và sau đó phát triển rễ, cây hoàn chỉnh được tái tạo Trong nuôi cấy phôi thì phôi phát sinh đầu tiên sau đó hình thành lá mấm và rễ, là giai đoạn nảy mầm thành cây hoàn chỉnh 2.2.1.1 Nuôi cấy cơ quan Các bước nhân giống và môi trường... thấp - Tỷ lệ sống cao - Tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ… Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh 2.2.2.3 Nhân nhanh chồi - Thành phần và điều kiện môi trường... và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích nhân nhanh - Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1- 2 tháng tùy loại cây Hệ số nhân nhanh là 2 - 8 lần/ 1 lần cấy chuyển Nhìn chung giai đoạn 3 thường yêu cầu 1036 tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu Ví dụ từ đỉnh sinh trưởng của 1 cây chuối chọn lọc ban đầu, người ta chỉ nên nhân khoảng 2000 - 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy... dị sôma Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ 1 cây mẹ ban đầu  Những khả năng tạo cây đó là: - Phát triển chồi nách - Tạo phôi vô tính - Tạo đỉnh sinh trưởng mới  Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như: - Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng cytokinin giảm auxin) Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin... Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo bệ trước những yếu tố bất lợi sau: - Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô - Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn - Cháy lá do nắng 2.3 Một số quy trình cụ thể 2.3.1 Qui trình nhân giống cây keo lai Keo lai là loài cây trồng quan trọng và rất có triển vọng trong nhiều chương trình trồng rừng... nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ 1.3.2 Hạn chế của vi nhân giống Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay,... người ta khảo sát tốn rất nhiều thời gian, vì vậy việc đưa cây ra vườn để thích nghi vơi điều kiện bên ngoài phải hết sức chú trọng SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 30 ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG KẾT LUẬN Ở các nước trong khu vực nói chung và nước ta nói riêng, xu hướng phát triển trồng rừng lấy gỗ đang được khuyến khích vì diện tích rừng tự nhiên đang bị thu hẹp, trong khi nhu cầu dùng... Khả,2006, Cẩm nang ngành lâm nghiệp [3]Nguyễn Thị Duy Khoa, 2010,Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật [4]http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/nghien-cuu-khoa-hoc-nuoi-cay-mo-mot-so-giong-keolai-moi-chon-tao-.1100536.html [5]http://vst.vista.gov.vn/home/database /an_ pham_dien_tu/nong_thon_doi_moi/2006/ 2006_00028/MItem.2006-07-11.1417/MArticle.2006-07-11.1603/marticle_view [6]http://vi.scribd.com/doc/69081048/QUY-TRINH-NHAN-GI%E1%BB%90NGKEO-LAI-B%E1%BA%B0NG-PH%C6%AF%C6%A0NG-PHAP-NUOI-C%E1%BA . gian rồi chậm dần và ngừng hẳn mặc dù đã chuyển sang môi trường mới. Cùng trong thời gian này, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hormone. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế. Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian