Đồ án chuyên môn: Nghiên cứu sản xuất Protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm

Đồ án chuyên môn: Nghiên cứu sản xuất Protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 5

1.1 Tình hình nghiên cứu 5

1.2 Cấu tạo hoá học 6

1.2.1 Phân loại 7

1.3 Tính chất 8

1.4 Cơ chế tác dụng 8

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng 9

1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ 9

1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 10

1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm 11

1.5.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa 13

1.5.5 Ảnh hưởng cuả nhiệt độ 13

1.5.6 Ảnh hưởng của pH 13

1.5.7 Các yếu tố khác 14

1.6 Nguồn thu nhận 14

1.7 Ứng dụng 14

1.7.1 Trong thực phẩm 14

1.7.2 Trong nông nghiệp 14

1.7.3 Trong y học 15

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 16

2.1 Tình hình nghiên cứu 16

2.2 Cấu tạo 16

2.3 Cơ chế tác dụng 18

2.4 Nguồn thu nhận 18

CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN VỀ ASPERGILLUS OZYZAE 19

3.1 Đặc điểm cấu tạo 19

3.2 Vai trò của giống 20

3.3 Yêu cầu của giống 20

3.4 Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae 21

3.4.1 Nuôi cấy bề mặt 21

3.4.2 Nuôi cấy chìm 22

3.5 Nguyên liệu sản xuất 22

3.5.1 Nguồn cacbon 23

3.5.2 Nguồn nitơ 23

3.6 Phương pháp phân lập 23

3.6.1 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên 23

3.6.2 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất 24

3.6.3 Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng 24

3.7 Phương pháp phân lập nấm mốc Asp oryzae 24

3.8 Phương pháp bảo quản 25

3.8.1 Phương pháp cấy chuyền 25

3.8.2 Phương pháp làm khô 26

3.8.3 Phương pháp đông khô 26

3.8.4 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 26

CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE 27

4.1 Sơ đồ quy trình 27

4.2 Thuyết minh qui trình 28

4.2.1 Môi trường 28

4.2.2 Nuôi cấy 28

4.2.3 Chế phẩm thô 30

4.2.4 Trích ly 30

4.2.5 Kết tủa enzyme 31

4.2.6 Ly tâm 32

4.2.7 Hệ thống sấy phun 33

CHƯƠNG 5 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 35

5.1 Giới thiệu chung về nước mắm 35

5.3 Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm 36

5.3.1 Hệ enzyme Metalo-protease 36

5.3.2 Hệ enzyme serin-protease 36

5.3.3 Hệ enzyme acid-protease 36

5.4 Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm 37

5.5 Qui trình sản nước mắm 38

5.6 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 39

5.6.1 Hải sản 39

5.6.2 Nước 39

5.6.3 Muối 39

5.6.4 Nấm mốc Asp.oryzae 39

5.7 Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm kém chất lường và cách phòng chữa 40

5.7.1 Chượp chua 40

5.7.2 Chượp đen 41

5.7.3 Chượp thối 41

5.7.4 Nước mắm thối 42

5.8 Bảo quản 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

MỞ ĐẦU

Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thơi gian gần đây lànghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấychục năm qua, đó là những khám phá về cấu trúc hóa học và các cơ chế tác dụng kỳ diệucủa enzyme- xúc tác sinh học Enzyme đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong nghành côngnghiệp hiện đại

Trước đây enzyme enzyme được dùng trong nghiên cứu và áp dụng trong sản xuấtthường được thu nhận từ động vật, thực vật Trong những năm gần đây người ta bắt đầuchú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền Đó là nguồn enzyme đượctách chiết từ vi sinh vật Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh do đó có thể tạo ra mộtlượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme này có hoạt lựcxúc tác rất cao Do đó, chúng được ứng dụng cho nền sản xuất enzyme

Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease

đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Tuy nhiên giáthành chế phẩm protease còn khá cao (giá trị buôn bán 187.2 triệu USD) Do đó, cũng hạnchế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Các chế phẩm thu được sau quá trìnhnuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm

20 – 30% Với để tài: “Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm” nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết

cao và ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống xã hội là rất cần thiết

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức độđặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp Enzyme có trong tất cả các tế bào sống và

là chất xúc tác sinh học Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme

có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác Enzyme khôngnhững có thể xúc tác cho phản ứng trong cơ thể sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sống,

ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác.Các chất tham gia trongphản ứng do enzyme xúc tác gọi là cơ chất của enzyme, ký hiệu là S.E có tính đặt hiệucao nghĩa là một emzyme chỉ tác dụng trên một hoặc một số cơ chất nhất định

Từ thập kỉ trước enzyme đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến nhưng mới chỉ

có tính chất kinh nghiệm thuần tuý Công nghệ enzyme ra đời là một bước bước phát triểnứng dụng của enzyme Ngày nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới,một giai đoạn của sự tích hợp của nhiều ngành khác nhau như hoá học protein, sinh họcphân tử….Do đó, có được những hiểu biết đầy đủ hơn về tính chất hóc học, cấu trúc, độnghọc….Tạo điều kiện để sản xuất enzyme ở qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệuquả ứng dụng ngày càng cao

Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cảithiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường Cùng với sự phát triển của khoa học cũng nhưenzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày càng mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, khôngchỉ trong lĩnh vực truyền thống mà còn cả trong những vực mới tạo ra sản phẩm mới

1.1 Tình hình nghiên cứu

Trước thế kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm thuần tuý ngườixưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn enzyme trong các quá trình lên men như sảnxuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang…

Thế kỉ XVII đến nửa đầu thế kỉ XVIII đã đề ra được khái niệm lên men Vanhemomngười Hà Lan lần đầu tiên quan sát được hiện tượng tạo thành chất khí khác không khítrong quá trình lên men

Năm 1659, Silvius lần đầu tiên nêu lên rằng, về cơ bản, tất cả các quá trình sống đều

là những quá trình hóc học

Nửa cuối thế kỉ XVIII đã có thí nghiệm đầu tiên về enzyme chẳng hạn như côngtrình nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày Công trình này do Reaumur (ngườiPháp) bắt đầu và sau đó được Sapallanzani (người Ý) mở rộng Các tác giả đã cho thịt vàoống kim loại và đưa vào trong nhiều động vật khác nhau và thấy rằng thịt bị tiêu hoá.Năm 1836, Schwann đã gọi chất tiêu hoá thịt này là pepsin (pepxin)

Từ năm 1800 người ta còn thấy rằng trong ruột còn có một enzyme phân giải proteinkhác Sau đó Kuhne đặt tên enzyme đó là trypsin

Nửa đầu thế kỉ XIX người ta đá tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyênliệu khác nhau có tách dụng thuỷ phân các chất tương ứng và bắt đầu tách được các chấttạo nên quá trình lên men

Nửa cuối thế kỷ XIX đã tinh sạch được một số enzyme và nghiên cứu một số tínhchất cơ bản của enzyme

Nửa đầu thế kỉ XX đã phát hiện được CoE (Harden và Young, 1906) xác định ảnhhưởng của pH đến hoạt độ của enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứngenzyme (Bayliss, 1919) kết tinh được enzyme và xác định được bản chất hoá học củaenzyme là protein….Đã áp dụng thành công các phương pháp hiện đại để nghiên cứuenzyme hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc 1 phân tử enzyme

1.2 Cấu tạo hoá học

Các enzyme là những protein được cấu tạo từ 20L – amino acid (Các amino acidkết hợp với nhau qua liên kết peptid (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữanhóm α - carboxyl của amino acid đứng trước, với nhóm amoha-amin của amino acidtiếp theo, loại đi một phân tử nước Theo cách kết hợp này các liên kết peptid nằm trên

một mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu tận cùng gọi là “đầu N” (có nhóm α - amin

tự do và amino acid thứ nhất), kí hiệu bằng dấu “+”và “đầu C” (có nhóm α - carboxyl tự

do của amino acid cuối cùng, kí hiệu bằng dấu “-“ Đánh dấu thứ tự các gốc amino acidtrong phân tử bắt đầu từ “đầu N” Trong một số trường hợp đầu N và đầu C có thể kết hợp

Giống như các protein khác, các enzyme có thể là protein đơn giản, gọi là enzymemột thành phần hoặc protein phức tạp, gọi là protein hai thành phần hay holoenzyme.Phân tử holoenzyme bao gồm 2 thành phần: phần protein gọi là apoenzyme, phần khôngphải prorein gọi là coenzyme Coenzyme có vai trò quan trọng để thực hiện chức năngxúc tác, loại bỏ coenzyme sẽ làm mất khả năng xúc tác Trong một số trường hợp, chỉriêng coenzyme cũng là chất xúc tác nhưng không hiệu quả bằng khi kết hợp vớiapoenzyme Cùng một coenzyme khi kết hợp với apoenzyme khác nhau tạo thành cácholoenzyme khác nhau, xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá khác nhau nhưng giốngnhau về kiểu phản ứng Coenzyme còn có vai trò làm bền enzyme.

Apoenzyme có vai trò quan trọng với tính đặc hiệu của enzyme và tăng hiệu quả xúctác của coenzyme.Coenzyme thường là các chất dẫn xuất của các vitamin hoà tan trongnước Vì vậy khi thiếu một vitamin nào đó sẽ ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme tươngứng trong tế bào, vi phạm quá trình trao đổi chất trong cơ thể, gây nên các bệnh đặt trưng

1.2.1 Phân loại

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế

đã trình bày một báo cáo, trong đó có đề nghị những nguyên tắc định tên và phân loạienzyme Người ta chia enzyme ra làm 6 lớp

1 Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng oxi hoá-khử.

2 Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị.

3 Hydrolase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân.

4 Lyase: các enzyme xúc tác cho các phản ưng phân cắt không cần nước.

5 Isomerase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng đồng phân hoá.

6 Ligase (synthetase): các enzyme xúc tác cho các phản ứng tổng hợp có sử dụng

liên kết giàu năng lượng của ATP…

Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), mỗi tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp)

Tên enzyme thường được gọi: Tên cơ chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng

thêm tiếp vĩ ngữ ase

1.3 Tính chất

Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein Đa số

enzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn

Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete và cácdung môi không phân cực

Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính Môitrường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động

Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các dạng: cation,anion hay trung hòa điện

Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin,amylase và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein)

E + S → ES → P + E

Trong đó: E là Enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là

sản phẩm (Product)

Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức

hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi nănglượng hoạt hóa thấp

Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên

kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất

Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng trở lại trạng thái

tự do ban đầu để quay vòng xúc tác

Hình 1.2 Một ví dụ minh họa sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất

độ tích điện của phân tử enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác của nó

1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ ([E])

Nói chung, trong điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vàoE]:v = k[E]

V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme

v

Hình 1.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc của phản ứng

Nồng độ E quá lớn, chỉ sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc của phản ứng đã thay đổitheo thời gian Theo sơ đồ này nên chọn nồng độ [E]3 sẽ có được sự phụ thuộc tuyến tínhgiữa V vào thời gian trong khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định vo Do đó nên tiếnhành lựa chọn nồng độ enzyme trước khi xác định hoạt độ enzyme hoặc nghiên cứu độnghọc phản ứng enzyme

1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Tốc độ của các phản ứng đơn giản trong ở phương trình hóa học biểu diễn theophương trình động học Michaelis – Menten

[E]1[E]2[E]3

1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kiềm hãm

Các chất kiềm hãm (I), cũng gọi là chất ức chế, là những chất làm giảm tốc độ phảnứng do enzyme xúc tác

1/v = (aKm/Vmax) 1/S +1/Vmax a = 1+[I]/KI

Hình 1.5 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất có kiềm hãm cạnh tranh

Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xảy ra giữa chất kìm hãm và cơ chất có

sự tương đồng về mặt hoá học chẳng hạn như malic acid có cấu trúc gần giống vớisuccinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme succinatedehydrogenase, là enzyme xúc táccho sự biến đổi succinic acid thành acid fumaric acid

Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một điểm là1/Vmax

Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzmye tự do mà còn liên kết với

cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P

1.5.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm Thôngthường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các vitamin tan trongnước như Mg2+ hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl hóa nhưpyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate), adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP).Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vàonồng độ

1.5.5 Ảnh hưởng cuả nhiệt độ

Có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ môi trừơng,hiện tượng này tuân theo quy luật Vant’- Hoff Điều này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên

100C thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 2 lần

Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưngchỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzyme là protein Khi ta tăng nhiệt độ lêntrên 40-500C xảy ra quá trình phá huỷ chất xúc tác Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng doenzyme xúc tác sẽ giảm Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinhvới các phản ứng vô cơ thông thường

Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung cấpenzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600C , cũng có enzyme có nhiệt độ tối ưu rấtcao như các enzyme của những chủng ưa nhiệt Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đặc biệtcác vi khuẩn chịu nhiệt có chứa enzyme chịu nhiệt cao

1.5.6 Ảnh hưởng của pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thayđổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất hoạt động của phân tửenzyme Điều này dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Như đã biếtmỗi enzyme có một pH tối ưu, mỗi enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốcphản ứng do chúng xúc tác

1.5.7 Các yếu tố khác

Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau

có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ cótác động yếu nhất

Ánh sáng vùng tử ngoại: có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung

dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càngthấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ

Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá huỷ càng mạnh.

Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp Có thể do tạo thành nhữnggốc tự do, từ đó tấn công vào phản ứng enzyme

Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loai enzyme, có enzyme bị mất

hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng

1.7 Ứng dụng

1.7.1 Trong thực phẩm

Từ năm 1970, tách enzyme ra khỏi tế bàovà sử dụng trong sản xuất công nghiệp,hiệntại có it nhất 60 enzyme đã được thương mại hoá, đa số là các enzyme ngoại bào như sản xuất sữa, bánh mì, bia, công nghệ dệt, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa……

1.7.2 Trong nông nghiệp

Tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt

là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để chuyển hóa phế thải nông nghiệp cải tạo đất

1.7.3 Trong y học

Dùng trong chuẩn đoán bệnh, điều trị bệnh…

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE

2.1 Tình hình nghiên cứu

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ởnhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn Enzyme là chất xúc tác sinh học khôngchỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rấtquan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong côngnghệ gen và bảo vệ môi trường Trong những năm gần đây giá trị của enzyme côngnghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD trong đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân(75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp(59%)

2.2 Cấu tạo

Nhóm enzyme protease (peptitd – hidrolase) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kếtpeptitd (-CO-NH-) trong phân tử protein, từ poly peptitd đến sản phẩm cuối cùng là acidamind Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyểnacid amin

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của protease

Protease được phân thành 2 loại: endopeptitlase và exopeptidase ([7])

Dựa vào vị trí tác động trên mạch poly peptid, exopeptidase được phân thành 2 loại:

Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly

peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid

Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly

peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti

Dựa vào động lực hcọ của cơ chế xúc tác, endo peptidase được chia thành 4 nhóm:

Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung

tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin Nhóm chymotripsin bao gồmcác enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm 2 loạienzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thườnghoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.

Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vàiproteinase động vật và proteinase ký sinh trùng Các Cystein proteinase thường hoạt động

ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm

pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin… Cácasportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạtđộng mạnh ở PH trung tính

Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi

khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thườnghoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, proteinase được phân loại đơn giản hơn thành 3 nhóm Proteinase acid:

pH từ 2 – 4, Proteinase trung tính: pH từ 7 – 8, Proteinase kiềm: pH từ 9 – 10

2.3 Cơ chế tác dụng

Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học củaenzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trìnhxúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian

E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian)

2.4 Nguồn thu nhận

Hiện chúng ta sử dụng 3 nguồn sinh học cơ bản để thu nhận protease chẳng hạn nhưcác mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật…

Động vật: Thông thường protease động vật có ở tuyến tiêu hóa (niêm mạc dạ dày

niêm mạc ruột non, tuyến tụy)… Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật bậccao, Chymosin “ rennin” có trong ngăn thứ tư dạ cỏ bê non dưới 5 tháng tuổi

Thực vật: Papain từ mủ thu đủ xanh, Bromelin từ thân cây dứa, Ficin tách từ dịch ép

thân cây sung

Vi sinh vật: phân bố chủ yếu ở nấm mốc vi khuẩn và xạ khuẩn…gồm các loại thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clostridium…

CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN VỀ ASPERGILLUS OZYZAE

3.1 Đặc điểm cấu tạo([3])

Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân

gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme Trong số

này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor,

Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,

protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin

Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương

theo phương pháp vi sinh vật Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này đểsản xuất tương

Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có

nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanhlợt có ít vàng

Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang

màu xanh thẩm dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia

Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.

Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức

an gia súc

Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ

sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt…

Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi

trường…

3.2 Vai trò của giống ([3])

Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến: Năngsuất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu

tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinhvật

3.3 Yêu cầu của giống ([3])

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sảnxuất theo qui mô công nghiệp Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệenzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định Giống vi sinh vật phải cho ra sảnphẩm mà ta mong muốn Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá trìnhtrao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mìnhtrong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất

+ Giống phải cho năng suất sinh học cao

+ Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sảnxuất công nghiệp

+ Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếmtại địa phương

+ Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuầnkhiết, có tốc độ sinh sản nhanh

+ Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng táchchiết, tinh sạch

Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên mencông nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.

3.4 Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [9]

3.4.1 Nuôi cấy bề mặt

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng pháttriển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạtchất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã đượctiệt trùng, làm ẩm Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… Có chất phụ gia

là trấu Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có nhữngchất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảmbảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể

bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH4)2 SO4, (NH4)2 10, phospho, nitơ hữu cơ và các chấtkích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu Với phương pháp nàynồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào visinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chếphẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cầnkhâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, cóthể thực hiện quy mô gia đình Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quátrình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trườngphần đó Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tíchnuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều

3.4.2 Nuôi cấy chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa sốtrường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon làđường glucoza, saccharoza Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùngtuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôicấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy Các giai đoạn của quá trình nuôi cấychìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy

nấm mốc sản xuất Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suấtcao, dễ tổ chức sản xuất Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khảnăng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiệnnuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên

do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giáthành cao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàngloạt, toàn bộ gây tổn thương lớn

3.5 Nguyên liệu sản xuất

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng

trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môitrường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật vàtổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vàohiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thìchất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm củachất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chấtcảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng củaenzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, H, ON Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P,

S, Fe, K và các chất vi lượng khác như

3.5.1 Nguồn cacbon ([8])

Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit

arabinoza glactoza

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease

Chảng hạn như: vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường

tinh bột lớn hơn 8%

Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh

tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5%