Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất Protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu sản xuất Protease từ chủng nấm mốc Aspergillus. oryzae ứng dụng trong sản xuất nước mắm tài...

Đồ án chuyên môn GVHD: MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.1 Tình hình nghiên cứu 1.2 Cấu tạo hoá học 1.2.1 Phân loại 1.3 Tính chất 1.4 Cơ chế tác dụng 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng .9 1.5.1 Ảnh hưởng nồng độ 1.5.2 Ảnh hưởng nồng độ chất 10 1.5.3 Ảnh hưởng chất kiềm hãm 11 1.5.4 Ảnh hưởng chất hoạt hóa 13 1.5.5 Ảnh hưởng cuả nhiệt độ 13 1.5.6 Ảnh hưởng pH 13 1.5.7 Các yếu tố khác 14 1.6 Nguồn thu nhận 14 1.7 Ứng dụng 14 1.7.1 Trong thực phẩm .14 1.7.2 Trong nông nghiệp 14 1.7.3 Trong y học 15 CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 16 2.1 Tình hình nghiên cứu 16 2.2 Cấu tạo 16 2.3 Cơ chế tác dụng 18 2.4 Nguồn thu nhận 18 CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ ASPERGILLUS OZYZAE 19 3.1 Đặc điểm cấu tạo 19 3.2 Vai trò giống 20 3.3 Yêu cầu giống 20 3.4 Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae 21 SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: 3.4.1 Nuôi cấy bề mặt .21 3.4.2 Nuôi cấy chìm 22 3.5 Nguyên liệu sản xuất 22 3.5.1 Nguồn cacbon 23 3.5.2 Nguồn nitơ .23 3.6 Phương pháp phân lập 23 3.6.1 Phân lập giống điều kiện tự nhiên .23 3.6.2 Phân lập giống điều kiện sản xuất 24 3.6.3 Phân lập giống điều kiện hư hỏng .24 3.7 Phương pháp phân lập nấm mốc Asp oryzae 24 3.8 Phương pháp bảo quản 25 3.8.1 Phương pháp cấy chuyền 25 3.8.2 Phương pháp làm khô 26 3.8.3 Phương pháp đông khô 26 3.8.4 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 26 CHƯƠNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE 27 4.1 Sơ đồ quy trình 27 4.2 Thuyết minh qui trình 28 4.2.1 Môi trường .28 4.2.2 Nuôi cấy 28 4.2.3 Chế phẩm thô 30 4.2.4 Trích ly .30 4.2.5 Kết tủa enzyme 31 4.2.6 Ly tâm 32 4.2.7 Hệ thống sấy phun 33 CHƯƠNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 35 5.1 Giới thiệu chung nước mắm 35 5.2 Bản chất trình sản xuất nước mắm 36 SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: 5.3 Các hệ enzyme sản xuất nước mắm 36 5.3.1 Hệ enzyme Metalo-protease 36 5.3.2 Hệ enzyme serin-protease 36 5.3.3 Hệ enzyme acid-protease 36 5.4 Vi sinh vật sản xuất nước mắm .37 5.5 Qui trình sản nước mắm 38 5.6 Nguyên liệu xử lý nguyên liệu .39 5.6.1 Hải sản .39 5.6.2 Nước 39 5.6.3 Muối 39 5.6.4 Nấm mốc Asp.oryzae .39 5.7 Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm chất lường cách phòng chữa 40 5.7.1 Chượp chua 40 5.7.2 Chượp đen 41 5.7.3 Chượp thối .41 5.7.4 Nước mắm thối 42 5.8 Bảo quản .42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: MỞ ĐẦU Một thành tựu to lớn khoa học công nghệ thơi gian gần nghiên cứu enzyme, đặt trưng cho phát triển khoa học tự nhiên chục năm qua, khám phá cấu trúc hóa học chế tác dụng kỳ diệu enzyme- xúc tác sinh học Enzyme đóng vai trò quan trọng nghành công nghiệp đại Trước enzyme enzyme dùng nghiên cứu áp dụng sản xuất thường thu nhận từ động vật, thực vật Trong năm gần người ta bắt đầu ý đến nguồn enzyme vô phong phú rẻ tiền Đó nguồn enzyme tách chiết từ vi sinh vật Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh tạo lượng enzyme vô lớn thời gian ngắn, đồng thời enzyme có hoạt lực xúc tác cao Do đó, chúng ứng dụng cho sản xuất enzyme Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease cao (giá trị buôn bán 187.2 triệu USD) Do đó, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme sản xuất Các chế phẩm thu sau trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm 20 – 30% Với để tài: “Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ứng dụng sản xuất nước mắm” nhằm thu chế phẩm có độ tinh khiết cao ứng dụng lĩnh vực khác đời sống xã hội cần thiết SVTH: Trang Đồ án chuyên môn CHƯƠNG GVHD: TỔNG QUAN VỀ ENZYME Enzyme protein có khả xúc tác cho phản ứng hoá học với mức độ đặc hiệu khác nhiệt độ tương đối thấp Enzyme có tất tế bào sống chất xúc tác sinh học Enzyme có đầy đủ tính chất chất xúc tác, enzyme có hiệu suất xúc tác lớn tất chất xúc tác hữu vô khác Enzyme xúc tác cho phản ứng thể sống mà sau tách khỏi hệ thống sống, điều kiện định chúng giữ hoạt tính xúc tác Các chất tham gia phản ứng enzyme xúc tác gọi chất enzyme, ký hiệu S.E có tính đặt hiệu cao nghĩa emzyme tác dụng chất định Từ thập kỉ trước enzyme sử dụng công nghiệp chế biến có tính chất kinh nghiệm tuý Công nghệ enzyme đời bước bước phát triển ứng dụng enzyme Ngày việc nghiên cứu enzyme bước vào giai đoạn mới, giai đoạn tích hợp nhiều ngành khác hoá học protein, sinh học phân tử… Do đó, có hiểu biết đầy đủ tính chất hóc học, cấu trúc, động học….Tạo điều kiện để sản xuất enzyme qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệu ứng dụng ngày cao Sử dụng enzyme sản xuất nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường Cùng với phát triển khoa học enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày mở rộng, phát triển tầm cao hơn, không lĩnh vực truyền thống mà vực tạo sản phẩm 1.1 Tình hình nghiên cứu Trước kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm tuý người xưa biết dùng vi sinh vật nguồn enzyme trình lên men sản xuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang… Thế kỉ XVII đến nửa đầu kỉ XVIII đề khái niệm lên men Vanhemom người Hà Lan lần quan sát tượng tạo thành chất khí khác không khí trình lên men SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: Năm 1659, Silvius lần nêu lên rằng, bản, tất trình sống trình hóc học Nửa cuối kỉ XVIII có thí nghiệm enzyme chẳng hạn công trình nghiên cứu khả tiêu hoá thịt dày Công trình Reaumur (người Pháp) bắt đầu sau Sapallanzani (người Ý) mở rộng Các tác giả cho thịt vào ống kim loại đưa vào nhiều động vật khác thấy thịt bị tiêu hoá Năm 1836, Schwann gọi chất tiêu hoá thịt pepsin (pepxin) Từ năm 1800 người ta thấy ruột có enzyme phân giải protein khác Sau Kuhne đặt tên enzyme trypsin Nửa đầu kỉ XIX người ta đá tách số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác có tách dụng thuỷ phân chất tương ứng bắt đầu tách chất tạo nên trình lên men Nửa cuối kỷ XIX tinh số enzyme nghiên cứu số tính chất enzyme Nửa đầu kỉ XX phát CoE (Harden Young, 1906) xác định ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng enzyme (Bayliss, 1919) kết tinh enzyme xác định chất hoá học enzyme protein… Đã áp dụng thành công phương pháp nghiên cứu enzyme hoàn thiện phương pháp xác định cấu trúc bậc phân tử enzyme 1.2 Cấu tạo hoá học Các enzyme protein cấu tạo từ 20L – amino acid (Các amino acid kết hợp với qua liên kết peptid (-CO-NH-) tạo thành phản ứng kết hợp nhóm α - carboxyl amino acid đứng trước, với nhóm amoha-amin amino acid tiếp theo, loại phân tử nước Theo cách kết hợp liên kết peptid nằm mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu tận gọi “đầu N” (có nhóm α - amin tự amino acid thứ nhất), kí hiệu dấu “+” “đầu C” (có nhóm α - carboxyl tự amino acid cuối cùng, kí hiệu dấu “-” Đánh dấu thứ tự gốc amino acid phân tử “đầu N” Trong số trường hợp đầu N đầu C kết hợp với nhau, phân tử có cấu trúc vòng SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: Giống protein khác, enzyme protein đơn giản, gọi enzyme thành phần protein phức tạp, gọi protein hai thành phần hay holoenzyme Phân tử holoenzyme bao gồm thành phần: phần protein gọi apoenzyme, phần prorein gọi coenzyme Coenzyme có vai trò quan trọng để thực chức xúc tác, loại bỏ coenzyme làm khả xúc tác Trong số trường hợp, riêng coenzyme chất xúc tác không hiệu kết hợp với apoenzyme Cùng coenzyme kết hợp với apoenzyme khác tạo thành holoenzyme khác nhau, xúc tác cho phản ứng chuyển hoá khác giống kiểu phản ứng Coenzyme có vai trò làm bền enzyme Apoenzyme có vai trò quan trọng với tính đặc hiệu enzyme tăng hiệu xúc tác coenzyme.Coenzyme thường chất dẫn xuất vitamin hoà tan nước Vì thiếu vitamin ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme tương ứng tế bào, vi phạm trình trao đổi chất thể, gây nên bệnh đặt trưng 1.2.1 Phân loại Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế trình bày báo cáo, có đề nghị nguyên tắc định tên phân loại enzyme Người ta chia enzyme làm lớp Oxydoreductase: enzyme xúc tác cho phản ứng oxi hoá-khử Transferase: enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Hydrolase: enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Lyase: enzyme xúc tác cho phản ưng phân cắt không cần nước Isomerase: enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá Ligase (synthetase): enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu lượng ATP… Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp) Tên enzyme thường gọi: Tên chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng thêm tiếp vĩ ngữ ase SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: 1.3 Tính chất Enzym có chất protein nên có tất thuộc tính lý hóa protein Đa số enzym có dạng hình cầu không qua màng bán thấm có kích thước lớn Tan nước dung môi hữu phân cực khác, không tan ete dung môi không phân cực Không bền tác dụng nhiệt độ, nhiệt độ cao enzym bị biến tính Môi trường axít hay bazơ làm enzym khả hoạt động Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH môi trường mà tồn dạng: cation, anion hay trung hòa điện Enzym chia làm hai nhóm: enzym cấu tử (chỉ chứa protein) pepsin, amylase enzym hai cấu tử (trong phân tử có nhóm protein) 1.4 Cơ chế tác dụng ([5]) Trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ tạo thành phức hợp trung gian enzyme chất mà chất hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm Nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy trình tạo thành phức hợp enzyme chất biến đổi phức hợp thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau E + S → ES → P + E Hình 1.1 Cơ chế tác dụngcủa enzyme SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: Trong đó: E Enzyme, S chất (Substrate), ES phức hợp enzyme - chất, P sản phẩm (Product) Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với chất liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - chất (ES) không bền, phản ứng xảy nhanh đòi hỏi lượng hoạt hóa thấp Giai đoạn thứ hai: xảy biến đổi chất dẫn tới kéo căng phá vỡ liên kết đồng hóa trị phân tử chất Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, enzyme giải phóng trở lại trạng thái tự ban đầu để quay vòng xúc tác Hình 1.2 Một ví dụ minh họa tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tốc độ đến phản ứng ([5]) Phản ứng enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, đặc tính nồng độ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, ion kim loại, chất vô hữu khác (có tác dụng kiềm hãm hay hoạt hoá enzyme) Các yếu tố hoá lý không ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu phản ứng hoá học bình thường mà ảnh hưởng đến cấu trúc không gian, độ bền cấu trúc không gian, độ tích điện phân tử enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác 1.5.1 Ảnh hưởng nồng độ ([E]) Nói chung, điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào E]:v = k[E] SVTH: Trang Đồ án chuyên môn GVHD: V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme [E]1 [E]2 v [E]3 20 40 60 80 Hình 1.3 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng Nồng độ E lớn, sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc phản ứng thay đổi theo thời gian Theo sơ đồ nên chọn nồng độ [E]3 có phụ thuộc tuyến tính V vào thời gian khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định vo Do nên tiến hành lựa chọn nồng độ enzyme trước xác định hoạt độ enzyme nghiên cứu động học phản ứng enzyme 1.5.2 Ảnh hưởng nồng độ chất Tốc độ phản ứng đơn giản phương trình hóa học biểu diễn theo phương trình động học Michaelis – Menten Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ chất Nếu điểm đó, tất phân tử enzyme thực chức xúc tác gọi tốc độ phản ứng tối đa với lượng enzyme xác định, tăng dần lượng chất dung dịch đầu hoạt tính enzyme tăng dần đến lúc gia tăng nồng độ chất không làm tăng hoạt tính Enzyme Đó tất trung tâm hoạt động enzyme bão hoà chất SVTH: Trang 10 Đồ án chuyên môn GVHD: giảm lại, nhiệt độ môi trường giảm, lượng enzyme tạo giảm xuống Do cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu 4.2.3 Chế phẩm thô Mục đích: Thu chế phẩm enzyme protease, chế phẩm gọi enzyme thô thành phần enzyme chúng chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường nước Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến độ ẩm thấp (Thường dùng máy sấy chân không).Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-400C ,enzyme protease bị hoạt tính 60-760C, độ ẩm sau kết thúc sấy nhỏ 10% Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta sử dụng enzyme mà không cần phải tinh Trong trường hợp khác ta phải tiến hành tinh enzyme để bảo quan lâu 4.2.4 Trích ly Mục đích: Tách enzyme enzyme khỏi khối môi trường Cách tiến hành: Sau nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme Các loại enzyme thủy phân có khả tan nước nên người ta sử dụng chúng dung môi hòa tan Cứ phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ lọc lấy dịch, phần bã loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc SVTH: Trang 30 Đồ án chuyên môn GVHD: Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay Hình 4.2 Máy trích ly Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 250C + Thời gian 40-60 phút 4.2.5 Kết tủa enzyme Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn sunfatmon Trong trình người ta làm lạnh dung dịch thô tác nhân kết tủa để tránh làm hoạt tính enzyme Cứ phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5 phần cồn sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh tượng biến tính, khuấy nhẹ để điều kiện lạnh từ 4-70C thời gian, enzyme tạo thành kết tủa lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%) Người ta tiếp tục sấy kết tủa 400C độ ẩm giảm xuống 5-8% SVTH: Trang 31 Đồ án chuyên môn GVHD: Thiết bị: Thiết bị kết tủa Hình 4.3 Thiết bị kết tủa Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ:tiến hành nhiệt độ phòng + Muối:amoni sunfat 80% + Thời gian: 10-18 + Hoạt độ riêng: 162 IU/mg + Hiệu suất: 74% 4.2.6 Ly tâm Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật bã canh trường Các biến đổi: Sự thay đổi thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ dung dịch, thay đổi hàm lượng chất khô chất hòa tan pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù thành pha rắn-lỏng Các yếu tố ảnh hưởng: Sự chênh lệch khối lượng riêng pha rắn lỏng:chênh lệch nhiều trình diễn dễ dàng hơn, tốc độ quay roto: Tốc độ nhanh trình diễn tốt SVTH: Trang 32 Đồ án chuyên môn GVHD: Thiết bị: Thiết bị ly tâm lắng Hình 4.4 Thiết bị ly tâm lắng Thông số công nghệ: + Tốc độ quay 10000 rpm +Thời gian 10 phút + Nhiệt độ 40C + Hoạt độ riêng 80.1IU/mg + Độ tinh sạch: 4.2.7 Hệ thống sấy phun Mục đích: Tách nước khỏi dung dich mà không làm thay đổi tính chất enzyme nhằm bảo quản lâu Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất khô nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời gian bốc hơi, tăng độ nhớt nguyên liệu gây khó khăn cho trình sấy phun Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian lượng cho trình Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp SVTH: Trang 33 Đồ án chuyên môn GVHD: Hình 4.5 Thiết bị sấy phun Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-3000C + Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục SVTH: Trang 34 Đồ án chuyên môn CHƯƠNG GVHD: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 5.1 Giới thiệu chung nước mắm Nước mắm dung dịch đạm mà chủ yếu acid amin tạo thành trình thủy phân protein có cá nhờ enzyme protease Ngoài ra, nước mắm dùng điều trị số bệnh đau dày, phỏng, thể suy nhược, cung cấp lượng Nước mắm sản xuất tất hầu châu Á Giá trị dinh dưỡng nước mắm: Các chất đạm chiếm chủ yếu định giá trị dinh dưỡng nước mắm, gồm loại: + Đạm tổng số + Đạm amin + Đạm amon Ngoài nước mắm chứa đầy đủ acid amin, đặc biệt acid amin không thay thế: valin, bucin, methienin, isokucin, phenylalanin, alanin…Và có chất trung gian làm cho nước mắm bị hư hỏng hoạt động vi sinh vật Các chất bay định hương vị nước mắm: + Các chất cacboxyl bay hơi: 407 – 512 mg/100g nước mắm + Các acid bay hơi: 404 – 533 mg/100g nước mắm + Các amin bay hơi: 9,5 – 11,3 mg/100g nước mắm + Các chất trung tính bay hơi: 5,1 – 13,2 mg/100g nước mắm Mùi nước mắm hình thành chủ yếu hoạt động vi sinh vật yếm khí trình sản xuất tạo Và số chất khác: + Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250 – 280 g/l số chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br + Vitamin: B1, B12, B2, PP SVTH: Trang 35 Đồ án chuyên môn GVHD: 5.2 Bản chất trình sản xuất nước mắm Bản chất quy trình sản xuất nước mắm là: Cá + muối Ủ nước mắm Bản chất trình trình thủy phân protein cá nhờ hệ Enzyme protease pepton polypeptid peptid acid amin 5.3 Các hệ enzyme sản xuất nước mắm 5.3.1 Hệ enzyme Metalo-protease Hệ enzyme tồn nội tạng cá chịu nồng độ muối cao nên từ đầu hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ trở sau Loại enzyme có hoạt tính mạnh, có khả thủy phân rộng rãi loại peptid Đây nhóm enzyme thủy phân trung tính pH tối thích từ 5-7, pI từ 4-5, ổn định với ion Mg2+, Ca2+ hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+ 5.3.2 Hệ enzyme serin-protease Điển hình enzyme tripsin tồn nhiều nội tạng cá Hệ enzyme bị ức chế chuỗi acid amin cấu trúc enzyme Để tháo gỡ chuỗi phải nhờ đến hoạt động men cathepsin B Nhưng lại dễ bị ức chế nồng độ muối cao.Vì để men cathepsin B hoạt động nguời ta thực cho muối nhiều lần Enzyme serinprotease hoạt động mạnh pH từ 5-10, mạnh pH= 5.3.3 Hệ enzyme acid-protease Có thịt nội tạng cá điển hình enzyme cathepsin D Hệ enzyme bị ức chế nồng độ muối khoảng 15% nên thường tồn thời gian ngắn thời kì đầu trình thủy phân Loại men đóng vai trò thiết yếu sản xuất nước mắm SVTH: Trang 36 Đồ án chuyên môn GVHD: 5.4 Vi sinh vật sản xuất nước mắm Nguồn gốc: + Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí ) + Bổ sung hệ enzyme protease sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae + Ngày với phát triển ngành công nghệ sinh học nói chung ngành công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme nói riêng người ta thường sử dụng phương pháp sinh vật cách cho thêm chế phẩm enzyme vào nguyên liệu trình ủ chượp làm tăng rõ rệt trình thủy phân rút ngắn thời gian sản xuất từ – 12 tháng xuống 15 – 30 ngày [2] Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm lớn hương vị thời gian sản xuất ngắn, bị chua tinh bột lên men lactic sinh acid dễ bay cá bị ươn, đắng xác vi sinh vật tồn chất lượng muối có nhiều ion Ca2+, Mg2+ Và điều cần lưu ý cho thêm vào nguyên liệu lượng enzyme đảm bảo môi trường không ức chế hoạt động enzyme cho vào cấy vào lượng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp protease cao vi khuẩn phải chống chịu với điều kiện bất lợi trình ủ chượp SVTH: Trang 37 Đồ án chuyên môn GVHD: 5.5 Qui trình sản nước mắm SVTH: Trang 38 Đồ án chuyên môn GVHD: 5.6 Nguyên liệu xử lý nguyên liệu 5.6.1 Hải sản Nguyên liệu hải sản dùng sản xuất nước mắm: cá, tôm, phế thải đông lạnh… Nguyên liệu rửa mùn, cát, chọn nguyên liệu tươi chất lượng nước mắm tốt, loại hải sản to phải cắt nhỏ 5.6.2 Nước Để sản xuất thực phẩm nói chung nước mắm nói riêng nước cần đạt tiêu chuẩn sau: + Độ cứng trung bình đạt từ – 17% cứng làm ảnh hưởng tới thủy phân protein tinh bột + Các chất khoáng chất hữu không vượt mức 500 – 600 mg/l nước + Số lượng vi sinh vật không 20 – 100 con/cm2 nước đặc biệt không chứa vi sinh vật gây bệnh + Chỉ số E coli có lít nước không vượt 20 độ chuẩn E coli phải lớn 50 + Trong sản xuất nước mắm tỷ lệ nước cho vào – 10% đủ 5.6.3 Muối Sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào sản xuất nước mắm – 6% so với khối lượng cá Thành phần hóa học muối quan trọng Nếu muối chứa hàm lượng Mg Ca cao làm ức chế hoạt động enzyme làm chất lượng nước mắm không tốt cần phải lựa chọn loại muối tốt 5.6.4 Nấm mốc Asp.oryzae Yêu cầu: Chế phẩm sử dụng dạng thô tinh Tỷ lệ mốc cá: từ – 4% tính theo chế phẩm enzyme thô, cá xay nhỏ trộn với enzyme protease Các thành phần nguyên liệu trộn với theo tỷ lệ tiên hành vỉ chượp theo dõi đến dung dịch có màu nâu tươi nâu xám xám Riêng SVTH: Trang 39 Đồ án chuyên môn GVHD: nước cốt có màu vàng rơm đến cánh gián Có mùi thơm đặc trưng mùi chua, lạ chướp chín lấy dung dịch phơi nắng sấy 500C dung dịch biến đổi so với mẫu đối chứng nước mắm chín Nếu màu từ vàng rơm cánh gián chuyển sang vàng nhạt, hương vị đặc trưng đục chượp chưa chín Hoặc ta dùng phương pháp để kiểm tra độ chín chượp: lắc mạnh mẫu nước mắm, lắc 30 – 40 lần sau để yên 20 phút mẫu nước mắm không biến đổi so với mẫu đối chứng chượp chín 5.7 Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm chất lường cách phòng chữa 5.7.1 Chượp chua Hiện tượng: chượp bốc mùi chua, màu xám đượm mùi hôi khó chịu Nguyên nhân: + Chua mặn đầu: Do lượng muối lúc đầu nhiều, lượng muối ngấm vào lớp thịt cá phía bên ngoài, bên nội tang chưa kịp ngấm muối, làm cho thịt cá bị nhạt muối, xảy trình phân giải sinh nhiều acid bay phức tạp như: glycogen, glucose bị phân giải yếm khí tạo acid lactic Các chất phân giải hiếu khí tạo acid acetic acd butytic Ngoài chất béo bị thủy phân tạo glycerin acid béo chất đạm khứ amin thành acid béo + Chua nhạt đầu: Cá nhạt muối không đủ sức kìm hãm phát triển vi sinh vật phân giải tạo nhiều acid bay phức tạp, làm phát sinh mùi chua, thối nhanh chóng chuyển sang hư thối Cách phòng chữa: + Cần phải cho muối đủ + Náo đảo, phơi nắng kéo rút qua bã chượp tốt + Dùng rượu chuyển acid sang dạng ester có mùi thơm trung hòa NaHCO3 + Dùng thính để hấp thụ mùi + Chua mặn đầu tiến hành cho thêm nước lã vào chượp tiến hành chế biến chượp SVTH: Trang 40 Đồ án chuyên môn GVHD: 5.7.2 Chượp đen Hiện tượng: Nước bị xám đen, cá nhợt nhạt mức độ cao cá bị đen Nguyên nhân: + Do cá có bùn đất tạp chất mang nhớt bên mà nội tạng cá + Do sắc tố có da, thịt nội tạng cá + Do phân hủy chất khác + Do trộn muối không gây ngưng tụ nhóm amin nhóm aldehyde + Sự oxy hóa chất béo chưa bão hòa Cách phòng chữa: + Xử lý nguyên liệu ban đầu tốt + Cần chọn lựa nguyên liệu ban đầu cho kỹ, tránh nhiễm bẩn + Cho thíng rang kỹ bã chượp tốt vào bã chượp đen tiến hành đánh khuấy tăng cường phơi nắng + Dùng chất chống oxy hóa KMnO4, KClO3, H2O2 để oxy hóa chất đen + Khi chượp trở mùi kịp thời cho muối vào để ngăn chặn phát triển vi sinh vật + Đun sôi nước bổi, màu đen bị phá hủy bay hơi, vi sinh vật bị tiêu diệt 5.7.3 Chượp thối Hiện tượng: chượp thối đen có mùi hôi thối chượp đen chưa thối Nguyên nhân: chủ yếu muối nhạt sau có đòi muối ta không kịp thời cho muối vào Khi vi sinh vật hoạt động phân hủy chất có đạm chủ yếu acid amin thành sản vật cấp thấp làm chượp bị thối Cách phòng chữa: + Cần xử lý nguyên liệu cho tốt, tránh nước mưa vào + Dụng cụ chế biến phải sẽ, không để chượp nơi ẩm thấp, bẩn thỉu + Cần áp dụng kỹ thuật chế biến, đồng thời cần nắm vững tượng cá đòi muối muối đủ kịp thời SVTH: Trang 41 Đồ án chuyên môn GVHD: + Có thể trộn với chượp khác đem nấu + Chượp bị nước mưa nhiểu vào múc riêng phần cho muối vào, tăng cường phơi nắng náo đảo 5.7.4 Nước mắm thối Hiện tượng: Nước mắm thối lên bọt nhỏ nước bị đục, cá màu nâu xám đến xanh xông lên mùi hôi thối Nguyên nhân: + Chượp chưa chín phân giải đến sản vật trung gian, dễ bị đóng von keo tụ mà ta đem kéo rút + Do nước mắm lọc không + Do nước hâm bị nhạt muối hay nóng tạo nhiệt độ môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển + Do bể thùng lọc dụng cụ chứa không có lẫn chượp sống + Do nước mắm bị nước mưa hay nước lã đổ vào Cách phòng chữa: + Cần tránh nguyên nhân + Cách chữa dùng nhiệt độ làm bay mùi hôi thối 5.8 Bảo quản Bảo quản: Nhờ muối hàm lượng đạm cao tạo áp suất thẩm thấu lớn ức chế hoạt động vi sinh vật Hàm lượng đạm cao, thời gian bảo quản dài từ hàng năm đến hàng chục năm hương vị dần Dụng cụ chứa phải vệ sinh SVTH: Trang 42 Đồ án chuyên môn GVHD: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ Kết luận Công nghệ sinh học nuớc ta phát triển, tiếp thu thành tựu công nghệ sinh học giới Do việc sâu tìm hiểu enzyme protease, nguồn thu nhận protease từ vi sinh vật nói chung chủng nấm mốc Asp Oryzae ứng dụng mang lại nhiệm vụ cấp thiết từ làm tiền đề để tìm enzyme nâng cao hoạt lực chúng góp phần đưa kinh tế Việt Nam hội nhập với kinh tế giới Kiến nghị Với khả kì diệu mà enzyme mang lại cho người, mong muốn thời gian tới nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu để tìm nhiều loại enzyme mới, có tính đặt hiệu độ tinh cao, tận dụng lợi ích mà vi sinh vật mang lại để thay cho loại enzyme lấy từ động vật, thực vật nhằm thiết lập sản xuất sinh thái bền vững, hòa hợp với thiên nhiên, bảo vệ loài đông vật, giảm ô nhiễm môi trường SVTH: Trang 43 Đồ án chuyên môn GVHD: TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Thị Diệu Bích (2007), Chế biến thức ăn từ đậu nành lạc, NXB Thanh Hóa [2] Nguyễn Đức Lương (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia Hà Nội [3] Trần Thị Ngạch (2007), Công nghệ enzyme, Trường đại học bách khoa Đà Nẵng [4] Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, NXB nông nghiệp Hà Nội [5] PGS TS Đặng Thị Thu (2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội II TÀI LIỆU INTERNET [6] http://dethhttp://idoc.vn/tai-lieu/san-xuat-enzyme-protease-tu-vi-sinh-vat.html [7] http://luanvan.net.vn/luan-van/nguon-thu-nhan-va-ung-dung-protease-47430/ [8] thuvien.violet.vn/present/show?entry_id=7748438 [9] http://www.scribd.com SVTH: Trang 44 [...]... thích hợp SVTH: Trang 33 Đồ án chuyên môn GVHD: Hình 4.5 Thiết bị sấy phun Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-3000C + Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống quá nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục SVTH: Trang 34 Đồ án chuyên môn CHƯƠNG 5 GVHD: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 5.1 Giới thiệu chung về nước mắm Nước mắm là dung dịch đạm mà... đổi từ xanh vôi sang màu xanh thẩm dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an gia súc Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt… Cellulose: ứng dụng trong. .. phân protein có trong cá nhờ enzyme protease Ngoài ra, nước mắm còn dùng điều trị một số bệnh như đau dạ dày, phỏng, cơ thể suy nhược, cung cấp năng lượng Nước mắm được sản xuất trên tất cả hầu hết các nước châu Á Giá trị dinh dưỡng của nước mắm: Các chất đạm chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm, gồm 3 loại: + Đạm tổng số + Đạm amin + Đạm amon Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy... đường, acid amin Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất tương Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng Nấm Aspergillus oryzae có hình... bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut SVTH: Trang 26 Đồ án chuyên môn GVHD: CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE 4.1 Sơ đồ quy trình Môi trường Asp .oryzae Nuôi cấy Chế phẩm thô Trích ly Sử dụng enzyme thô Bã Thức ăn chăn nuôi... làm cho nước mắm bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật Các chất bay hơi quyết định hương vị của nước mắm: + Các chất cacboxyl bay hơi: 407 – 512 mg/100g nước mắm + Các acid bay hơi: 404 – 533 mg/100g nước mắm + Các amin bay hơi: 9,5 – 11,3 mg/100g nước mắm + Các chất trung tính bay hơi: 5,1 – 13,2 mg/100g nước mắm Mùi của nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của vi sinh vật yếm khí trong quá... trình sản xuất tạo ra Và một số chất khác: + Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250 – 280 g/l và một số các chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br + Vitamin: B1, B12, B2, PP SVTH: Trang 35 Đồ án chuyên môn GVHD: 5.2 Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm Bản chất của quy trình sản xuất nước mắm là: Cá + muối Ủ nước mắm Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ Enzyme protease. .. ngoại bào như sản xuất sữa, bánh mì, bia, công nghệ dệt, sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa…… 1.7.2 Trong nông nghiệp Tăng hiệu suất sử dụng thức ăn, sản xuất thức ăn dễ tiêu hoá cho động vật, đặc biệt là động vật còn non để tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, sản xuất các loại chế phẩm để chuyển hóa phế thải nông nghiệp cải tạo đất SVTH: Trang 14 Đồ án chuyên môn GVHD: 1.7.3 Trong y học Dùng trong chuẩn... phú và đa dạng có thể thu từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật + Động vật: có mặt trong tuyến tụy và nước bọt của động vật + Thực vật: có nhiều trong cây dứa, đu đủ xanh, trong dịch ép thân cây sung + Vi sinh vật: Bacillus, Penicillium, Pseudomonas, Rhizopus… 1.7 Ứng dụng 1.7.1 Trong thực phẩm Từ năm 1970, tách enzyme ra khỏi tế bàovà sử dụng trong sản xuất công nghiệp,hiện tại... lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết SVTH: Trang 20 Đồ án chuyên môn GVHD: 3.4 Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp .oryzae [9] 3.4.1 Nuôi cấy bề mặt Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc phát triển ... CHƯƠNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 35 5.1 Giới thiệu chung nước mắm 35 5.2 Bản chất trình sản xuất nước mắm ... án chuyên môn CHƯƠNG GVHD: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 5.1 Giới thiệu chung nước mắm Nước mắm dung dịch đạm mà chủ yếu acid... “Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae ứng dụng sản xuất nước mắm nhằm thu chế phẩm có độ tinh khiết cao ứng dụng lĩnh vực khác đời sống xã hội cần thiết SVTH: Trang Đồ