Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốt Cách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20% chất béo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37– 59%.Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Các phụ phẩm thêm vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa…….
4.2.2. Nuôi cấy
Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme
Cách tiến hành: Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với chiều dài 2 -3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 280C – 32oC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm.
Trong quá trình nuôi cấy ta không cần phải điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi trường
Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng mốc Asp. oryza, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật nuôi cấy
Thiết bị: Khay nuôi cấy bề mặt
Hình 4.1. Khay nuôi cấy
Thông số kĩ thuật: + Dày 4-5cm + Cao 1-1,2m
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi, khôi môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-500C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme prorease được tổng hợp mạnh, lượng O2 trong không khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-300C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi như sau. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng sẽ
giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống. Do đó cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất
4.2.3. Chế phẩm thô
Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước.
Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (Thường dùng là máy sấy chân không).Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-400C ,enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-760C, độ ẩm sau khi kết thúc sấy nhỏ hơn 10%.
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch. Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để bảo quan lâu hơn.
4.2.4. Trích ly
Mục đích: Tách enzyme enzyme ra khỏi khối môi trường.
Cách tiến hành: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như dung môi hòa tan. Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc.
Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay
Hình 4.2. Máy trích ly Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 250C
+ Thời gian 40-60 phút
4.2.5. Kết tủa enzyme
Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme
Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc sunfatmon. Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Cứ 1 phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5 phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và để trong điều kiện lạnh từ 4-70C trong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%). Người ta tiếp tục sấy kết tủa ở 400C và độ ẩm giảm xuống 5-8%.
Thiết bị: Thiết bị kết tủa
Hình 4.3. Thiết bị kết tủa
Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ:tiến hành ở nhiệt độ phòng + Muối:amoni sunfat 80%
+ Thời gian: 10-18 giờ + Hoạt độ riêng: 162 IU/mg + Hiệu suất: 74%
4.2.6. Ly tâm
Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường
Các biến đổi: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch, sự thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù ra thành 2 pha rắn-lỏng
Các yếu tố ảnh hưởng: Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn lỏng:chênh lệch nhiều thì quá trình diễn ra dễ dàng hơn, tốc độ quay của roto: Tốc độ càng nhanh quá trình diễn ra càng tốt.
Thiết bị: Thiết bị ly tâm lắng
Hình 4.4. Thiết bị ly tâm lắng Thông số công nghệ: + Tốc độ quay 10000 rpm
+Thời gian 10 phút + Nhiệt độ 40C
+ Hoạt độ riêng 80.1IU/mg + Độ tinh sạch: 1
4.2.7. Hệ thống sấy phun
Mục đích: Tách nước ra khỏi dung dich mà không làm thay đổi tính chất của enzyme nhằm bảo quản lâu hơn.
Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất khô của nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời gian bốc hơi, tăng độ nhớt của nguyên liệu gây khó khăn cho quá trình sấy phun. Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian và năng lượng cho quá trình. Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính của enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp.
Hình 4.5. Thiết bị sấy phun Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-3000C
+ Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống quá nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục
CHƯƠNG 5 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC
ASPERGILLUS. ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
NƯỚC MẮM 5.1. Giới thiệu chung về nước mắm
Nước mắm là dung dịch đạm mà chủ yếu là các acid amin được tạo thành do quá trình thủy phân protein có trong cá nhờ enzyme protease. Ngoài ra, nước mắm còn dùng điều trị một số bệnh như đau dạ dày, phỏng, cơ thể suy nhược, cung cấp năng lượng. Nước mắm được sản xuất trên tất cả hầu hết các nước châu Á.
Giá trị dinh dưỡng của nước mắm: Các chất đạm chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm, gồm 3 loại:
+ Đạm tổng số. + Đạm amin. + Đạm amon.
Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế: valin, bucin, methienin, isokucin, phenylalanin, alanin…Và cũng có những chất trung gian làm cho nước mắm bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật. Các chất bay hơi quyết định hương vị của nước mắm:
+ Các chất cacboxyl bay hơi: 407 – 512 mg/100g nước mắm. + Các acid bay hơi: 404 – 533 mg/100g nước mắm.
+ Các amin bay hơi: 9,5 – 11,3 mg/100g nước mắm.
+ Các chất trung tính bay hơi: 5,1 – 13,2 mg/100g nước mắm.
Mùi của nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của vi sinh vật yếm khí trong quá trình sản xuất tạo ra. Và một số chất khác:
+ Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250 – 280 g/l và một số các chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br.
5.2. Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm
Bản chất của quy trình sản xuất nước mắm là:
Cá + muối nước mắm.
Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ
Enzyme protease pepton polypeptid peptid acid amin
5.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm
5.3.1. Hệ enzyme Metalo-protease
Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm enzyme thủy phân trung tính pH tối thích từ 5-7, pI từ 4-5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+ và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+.
5.3.2. Hệ enzyme serin-protease
Điển hình là enzyme tripsin tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Hệ enzyme luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B. Nhưng nó lại dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao.Vì vậy để men cathepsin B hoạt động nguời ta thực hiện cho muối nhiều lần. Enzyme serin- protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH= 9.
5.3.3. Hệ enzyme acid-protease
Có trong thịt và nội tạng cá điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường tồn tại trong một thời gian ngắn ở thời kì đầu của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thiết yếu trong sản xuất nước mắm.
5.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm
Nguồn gốc:
+ Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí..) + Bổ sung hệ enzyme protease được sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae
+ Ngày nay với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học nói chung và ngành công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme nói riêng thì người ta thường sử dụng phương pháp bằng sinh vật bằng cách cho thêm một ít chế phẩm enzyme vào nguyên liệu trong quá trình ủ chượp sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân và rút ngắn thời gian sản xuất từ 6 – 12 tháng xuống còn 15 – 30 ngày [2]. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm lớn như không có hương vị thời gian sản xuất ngắn, bị chua do tinh bột lên men lactic hoặc do sinh ra acid dễ bay hơi khi cá bị ươn, đắng do xác vi sinh vật còn tồn tại hoặc do chất lượng của muối kém có nhiều ion Ca2+, Mg2+. Và một điều cần lưu ý khi cho thêm vào nguyên liệu một lượng enzyme thì đảm bảo môi trường không ức chế sự hoạt động của enzyme cho vào hoặc cấy vào một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease cao thì vi khuẩn đó phải chống chịu được với điều kiện bất lợi trong quá trình ủ chượp.
5.6. Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu
5.6.1. Hải sản
Nguyên liệu hải sản dùng trong sản xuất nước mắm: cá, tôm, phế thải đông lạnh… Nguyên liệu rửa sạch mùn, cát, chọn nguyên liệu càng tươi thì chất lượng nước mắm càng tốt, các loại hải sản quá to thì phải cắt nhỏ.
5.6.2. Nước
Để sản xuất thực phẩm nói chung và nước mắm nói riêng nước cần đạt các tiêu chuẩn sau:
+ Độ cứng trung bình đạt từ 8 – 17% nếu quá cứng sẽ làm ảnh hưởng tới sự thủy phân protein và tinh bột.
+ Các chất khoáng và chất hữu cơ không vượt quá mức 500 – 600 mg/l nước. + Số lượng vi sinh vật không quá 20 – 100 con/cm2 nước đặc biệt không chứa vi sinh vật gây bệnh.
+ Chỉ số E. coli có trong một lít nước không vượt quá 20 và độ chuẩn E. coli phải lớn hơn 50 .
+ Trong sản xuất nước mắm thì tỷ lệ nước cho vào là 5 – 10% là đủ.
5.6.3. Muối
Sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, không vón cục, không bị chát, lượng muối cho vào trong sản xuất nước mắm là 4 – 6% so với khối lượng cá.
Thành phần hóa học của muối cũng rất quan trọng. Nếu trong muối chứa hàm lượng Mg và Ca cao nó sẽ làm ức chế hoạt động của enzyme làm chất lượng nước mắm không tốt chính vì vậy cần phải lựa chọn loại muối tốt nhất.
5.6.4. Nấm mốc Asp.oryzae
Yêu cầu: Chế phẩm có thể sử dụng ở dạng thô hoặc đã được tinh sạch
Tỷ lệ giữa mốc và cá: từ 3 – 4% tính theo chế phẩm enzyme thô, cá xay nhỏ trộn với enzyme protease. Các thành phần nguyên liệu trên trộn đều với nhau theo tỷ lệ và tiên hành vỉ chượp và theo dõi đến khi dung dịch có màu nâu tươi nâu xám hoặc xám. Riêng
nước cốt có màu vàng rơm đến cánh gián. Có mùi thơm đặc trưng không có mùi chua, lạ là chướp đã chín hoặc lấy dung dịch đó phơi nắng hoặc sấy ở 500C nếu dung dịch không có biến đổi gì so với mẫu đối chứng là nước mắm đã chín. Nếu màu từ vàng rơm hoặc cánh gián chuyển sang vàng nhạt, mất hương vị đặc trưng vẫn đục thì chượp chưa chín. Hoặc ta có thể dùng một phương pháp nữa để kiểm tra độ chín của chượp: lắc mạnh mẫu nước mắm, lắc 30 – 40 lần sau đó để yên 20 phút nếu mẫu nước mắm đó không biến đổi gì so với mẫu đối chứng là chượp chín
5.7. Một số nguyên nhân dẫn đến nước mắm kém chất lường và cách phòng chữa
5.7.1. Chượp chua
Hiện tượng: chượp bốc mùi chua, màu xám đượm mùi tanh hôi khó chịu Nguyên nhân:
+ Chua vì mặn đầu: Do lượng muối lúc đầu quá nhiều, lượng muối này ngấm vào lớp thịt cá phía bên ngoài, bên trong và nội tang chưa kịp ngấm muối, làm cho thịt cá bị nhạt muối, xảy ra quá trình phân giải sinh ra nhiều acid bay hơi phức tạp như: glycogen, glucose bị phân giải yếm khí tạo ra acid lactic. Các chất này phân giải hiếu khí tạo acid acetic acd butytic. Ngoài ra các chất béo bị thủy phân tạo glycerin và acid béo hoặc chất đạm khứ amin thành acid béo
+ Chua vì nhạt đầu: Cá nhạt muối không đủ sức kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật phân giải tạo nhiều acid bay hơi phức tạp, làm phát sinh mùi chua, tanh thối nhanh chóng chuyển sang hư thối
Cách phòng chữa:
+ Cần phải cho muối đều đủ
+ Náo đảo, phơi nắng và kéo rút qua bã chượp tốt
+ Dùng rượu chuyển các acid sang dạng ester có mùi thơm hoặc trung hòa bằng NaHCO3
+ Dùng thính để hấp thụ mùi
+ Chua vì mặn đầu tiến hành cho thêm nước lã vào chượp và tiến hành chế biến chượp tiếp theo
5.7.2. Chượp đen
Hiện tượng: Nước bị xám đen, cá nhợt nhạt và ở mức độ cao hơn nữa là cá bị đen
Nguyên nhân:
+ Do cá có bùn đất tạp chất không những ở mang nhớt bên ngoài mà ngay ở nội tạng cá
+ Do các sắc tố có trong da, thịt và nội tạng của cá + Do sự phân hủy các chất khác
+ Do trộn muối không đều gây ngưng tụ nhóm amin và nhóm aldehyde + Sự oxy hóa các chất béo chưa bão hòa
Cách phòng chữa:
+ Xử lý nguyên liệu ban đầu tốt
+ Cần chọn lựa nguyên liệu ban đầu cho kỹ, tránh nhiễm bẩn
+ Cho một ít thíng rang kỹ và bã chượp tốt vào trong bã chượp đen tiến hành đánh