ĐHĐN giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II (NXB đà nẵng 2007) phan thị bích ngọc, 51 trang

ðẠI HỌC ðÀ NẴNG TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HỐ KỸ THUẬT BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM GIÁO TRÌNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM II THỜI LƯỢNG 45 TIẾT ðÀ NẴNG 2007 www.daykemquynhon.ucoz.com MỞ ðẦU Công nghệ sinh học ngành khoa học ñang ñược giới quan tâm Giá trị công nghệ sinh học chỗ cơng cụ áp dụng cho nhiều ngành kinh tế sản xuất lương thực thực phẩm, chăn nuôi thú y, công nghiệp dược cơng nghiệp hố học, chuyển hố sinh khối thành lượng, xử lý phế liệu phụ liệu cơng nơng nghiệp, phịng chống nhiễm vệ sinh mơi trường… - Cơng nghệ sinh học giúp cho chương trình cải thiện nơng nghiệp, nghề vườn nghề rừng tăng suất trồng, tăng chất lượng dinh dưỡng nông phẩm, chọn giống chống chịu với sâu bệnh với thời tiết đất đai khơng thuận lợi tạo giống thích nghi với ñiều kiện thổ nhưỡng khí hậu ñịnh ðồng thời tạo điều kiện để trì ña dạng di truyền ñủ rộng giống trồng giữ gìn nguồn gen tạo nên từ họ hàng hoang dại chúng Tính đa dạng di truyền thể thơng qua số lượng cực lớn kiểu kết hợp gen có số cá thể lồi thơng qua khác tính trạng giống lồi: kiểu sinh trưởng, tính kháng sâu bệnh, tính kháng với ngoại cảnh (sương muối, hạn, nóng…) suất Sau nghiên cứu kết nhiều tổ hợp lai cách cẩn thận nghiêm túc, nhà chọn giống dựa tính đa dạng di truyền để chọn dịng có tính trạng mong muốn ðể thành cơng, nhà chọn giống phải có tay vốn di truyền lớn tốt Vốn di truyền bao gồm giống trồng, giống chống chịu, giống ñịa phương (các giống thường bị bỏ quên suất thấp q có tính chống sâu bệnh điều kiện ngoại cảnh khơng thuận lợi) Trong vốn di truyền cịn phải kể đến hoang dại có tác dụng tăng sức sống cho giống trồng Tính đa đạng di truyền nhân tố bảo đảm trồng khơng bị tai biến khí hậu sâu bệnh tiêu diệt hồn tồn Cây trồng dễ bị hại có tai hoạ - Cơng nghệ sinh học ñược ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm dinh dưỡng Ngành công nghệ lên men phận cơng nghệ sinh học sản xuất nhiều sản phẩm thú vị cho ngành thực phẩm Hoặc việc sản xuất nấm men có ỹ nghĩa quan trọng Người ta sử dụng lượng nhỏ nấm men ñể bổ sung protein, vitamin chất khống cho thực phẩm Ngồi ra, sinh khối nấm men nguồn thức ăn bổ sung chăn ni có hiệu - Cơng nghệ sinh học giúp cho chăn nuôi thú y tạo giống ni mong muốn sản xuất loại vacxin để phịng chống bệnh tật cho vật ni Ví dụ: việc cấy chuyền hợp tử bị tạo giống bị tốt, có sức chịu ñựng cao Kỹ thuật cấy chuyền ñược thực sau: gây rụng trứng bò có đặc điểm mà ngành chăn ni cần ñến ñem thụ tinh nhân tạo tinh trùng bị đực có đặc điểm người ta mong muốn Các hợp tử hay phơi thu nhận cách rữa Làm đơng lạnh phơi nitơ lỏng www.daykemquynhon.ucoz.com -179oC vận chuyển trạng thái này: 1000 phơi đơng lạnh khơng nặng q 50kg Phơi cấy vào bị chữa ñẻ hộ Bê phát triễn lên từ phơi đời mơi trường sống sau chúng khơng phải đương đầu với bất lợi môi trường mà súc vật nhập hay gặp phải Sự bảo vệ kháng thể bò mẹ nhờ bú sữa bò mẹ mà sau đời bê sơ sinh chịu ñựng tốt ñối với loại bệnh tật thơng thường - Cơng nghệ sinh học cịn tích cực giúp ñỡ ngành y tế ñể bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Người ta nói y học dự phòng (và lâu dài y học dự báo dựa hiểu biết ñặc ñiểm di truyền cá thể) mang lại lợi ích nhiều phương pháp điều trị Một lĩnh vực cơng nghệ sinh học góp phần quan trọng giải vấn đề y tế, khn khổ sách ưu tiên cho y học dự phịng, ñó cải tiến vacxin có chế tạo vacxin ðồng thời cịn giúp ích việc sản xuất loại kháng sinh, vitamin thuốc chữa bệnh khác Những năm gần ñây, nhờ vào kỹ thuật di truyền người ta tìm cách tách chiết hoạt chất thực vật bậc cao ñể làm vật liệu xuất phát cho hàng loạt loại thuốc - Cơng nghệ sinh học cịn góp phần việc sản xuất lượng như: sản xuất cồn đường lên men, chương trình biogas…và nguồn lượng lại ñi phục vụ cho q trình sản xuất khác - Cơng nghệ sinh học cịn tham gia vào việc chuyển hố chất ngăn chặn ô nhiễm môi trường Sản phẩm phụ chất thải chứa hydratcacbon chuyển hoá cách lên men nhờ vi sinh vật thơng thường hay qui trình cơng nghệ sinh học Hoặc kỹ thuật tái tổ hợp AND góp phần tích cực để tách giống vi khuẩn thích hợp cho việc tối ưu hố chuyển hố Ví dụ: chuyển gen mã hoá enzym xenluloza hemixenluloza Clostridium thermocellum thành lồi Clostridium khác điều khiển chuyển hoá xenluloza hemixenluloza thành etanol, axeton, butanol, axít axetic axít lactic Dùng vài giống ưa nhiệt Clostridium (toop= 65-75oC) có lợi cắt giảm chi phí việc chưng cất hạ giá thành sản phẩm ðể ngăn chặn ô nhiễm mơi trường người ta dùng loại vi sinh vật khác Các kỹ thuật tái tổ hợp AND tạo chủng vi khuẩn phân huỷ hấp thụ số lớn chất cơng nghiệp hố chất thải Như cơng nghệ sinh học có liên quan đến nhiều lĩnh vực bao gồm ngành như: - Công nghệ di truyền - Công nghệ nuôi cấy mô tế bào - Công nghệ enzyme - Công nghệ vi sinh vật… Trong học phần nghiên cứu số phần cơng nghệ vi sinh vật Các q trình vi sinh ñược sử dụng rộng rãi lĩnh vực khác kinh tế Những thành tựu khoa học kỹ thuật sinh hoá cho phép tạo q trình sản xuất có suất cao dựa phương pháp cơng nghệ điều chỉnh để có số sản phẩm thực phẩm, chăn nuôi, thuốc chữa bệnh chất hữu www.daykemquynhon.ucoz.com CHƯƠNG I: NHỮNG NGUN TẮC HỐ SINH TRONG CƠNG NGHỆ VI SINH VẬT ðể tạo sản phẩm lên men ñều phải qua bước sau: - Chuẩn bị môi trường - Chuẩn bị giống - Lên men - Thu hồi tinh chế sản phẩm ðể tạo sản phẩm có chất lượng tốt suất cao cần hiểu rõ vấn đề sau 1.1 Phân loại sản phẩm công nghệ vi sinh vật Các sản phẩm lên men cơng nghiệp phân loại theo tiêu chuẩn sinh lí trao đổi chất Sự phân loại dựa vào sản phẩm trình lên men trình sản xuất nhờ vi sinh vật luôn tạo thành nhiều sản phẩm 1.1.1 Vật chế tế bào (sinh khối) Cơ chất tế bào Ví dụ: + protein đơn bào (trạng thái chết) + vi khuẩn cố ñịnh ñạm (sống): Rhizobium, Azotobacter, VK trừ sâu Bacillus thuringiensis… Việc tổng hợp sinh khối hay vật chất tế bào ñồng với sinh trưởng vi sinh vật Sinh trưởng sinh sản gắn liền với Sinh trưởng tăng khối lượng, sinh sản tăng số lượng 1.1.2 Các sản phẩm trao ñổi chất Cơ chất sản phẩm + tế bào Các sản phẩm cuối trao ñổi lượng (các sản phẩm lên men) Ví dụ: etanol, axít lactic, axeton-butanol… Lên men q trình yếm khí thu nhận lượng, hydro tách ñược chuyển ñến chất nhận hữu (nó khơng đồng nghĩa với lên men ngơn ngữ quốc tế - hiểu q trình sản xuất cơng nghiệp nhờ vi sinh vật) Một số thể tiến hành lên men khơng có oxy làm chất nhận hydro cuối (kỵ khí tuỳ tiện), nhóm thể lên men bắt buộc không chứa enzym hô hấp Các hợp chất hữu nhận hydro hợp chất ñược hinh thành q trình trao đổi chất dị hố Sau nhận hydro, hợp chất thải tế bào giống sản phẩm cuối hơ hấp Từ nảy vấn đề sản xuất cần chọn điều kiện ni cho nhiều chất ñược chuyển thành sản phẩm lên men tốt Ví dụ: sản xuất rượu ñể tăng hàm lượng rượu cần tăng hàm lượng ñường giảm yếu tố quan trọng cho sinh trưởng www.daykemquynhon.ucoz.com Các chất trao đổi bậc Ví dụ: axít amin, nucleotit, vitamin, axít xitric Các chất trao ñổi bậc viên gạch cấu trúc có trọng lượng phân tử thấp cao phân tử sinh học tế bào chất: axít amin, nucleotit, nucleozit, đường, axít béo, vitamin… Ngồi sản phẩm trung gian q trình trao đổi chất (các axít hữu chu trình ATC) chất trao ñổi bậc Các chế ñiều hoà phát triễn q trình tiến hố bảo đảm cho chất trao ñổi bậc ñược tổng hợp ñến mức ñộ cần thiết Các chất trao ñổi bậc Ví dụ: kháng sinh, alcaloit Các chất trao đổi bậc chất trao đổi có trọng lượng phân tử thấp, không gặp thể, phân bố chúng giới hạn ñơn vị phân loại định Chúng khơng có chức chung trao ñổi chất tế bào tế bào tồn mà khơng cần đến chúng Tuy nhiên, chất trao đổi bậc có ý nghĩa với sinh trưởng thể sản sinh chúng Chẳng hạn số chất trao đổi bậc có vai trị hấp thụ sắt thiếu nguyên tố Thường chất bậc ñược tạo thành sinh trưởng ñã kết thúc Các chủng tồn tự nhiên thường tạo thành chất trao đổi bậc 2, chất tích luỹ tế bào thải ngồi 4.Các enzym Ví dụ: enzym ngoại bào: proteaza, amylaza enzym nội bào : asparaginaza, penixilinaza Tế bào vi sinh vật chứa khoảng 1000 enzym khác Một số enzyme có mặt với số lượng vài phân tử nhiều enzym có mặt với số lượng lớn Chỉ enzym chịu trách nhiệm phân huỷ chất khơng hồ tan tinh bột, xenlulo, protein…mới ñược tiết từ tế bào vào môi trường Vi sinh vật có khả sử dụng chất khác cho sinh trưởng thích ứng với điều kiện sinh trưởng khác Trong giới hạn thể tích tế bào tổng hợp enzym mà cần Trong cơng nghệ sản xuất enzym cần phải ñiều khiển trao ñổi chất cho enzym mà ta mong muốn ñược tổng hợp nhiều tốt 1.1.3 Các sản phẩm chuyển hố chất Ví dụ: oxy hố khơng hồn tồn để tạo thành axit axetic soboza Trong q trình chuyển hố tế bào hoạt ñộng hệ thống xúc tác cho nhiều bước chuyển hố chất Về mặt lí thuyết phản ứng xảy nhờ enzym lập, nhiên đường khơng thể thực khơng kinh tế (ví dụ với phản ứng enzym phụ thuộc lượng) Các enzym chuyển hố chất theo cách đặc hiệu Ví dụ: www.daykemquynhon.ucoz.com chuyển hoá tách hydro xảy nhờ phân tử steroid khơng có ý nghĩa tế bào (cũng phản ứng khử độc) Trong chuyển hố để tạo axít axetic gắn liền với sinh trưởng, gắn liền với thu nhận lượng 1.2 ðộng học sinh trưởng tạo thành sản phẩm Sinh trưởng quần thể vi sinh vật diễn qua giai ñoạn khác Sự sinh sản tế bào bắt ñầu sau giai ñoạn tiềm phát Trong giai ñoạn log xảy sinh sản theo hàm số mũ Sau thời gian sinh trưởng ngừng lại thiếu chất dinh dưỡng tích luỹ chất ức chế Các tế bào chuyển vào giai đoạn cân Trong giai đoạn khơng diễn sinh trưởng tế bào hoạt động trao đổi chất Tồn q trình ni gắn liền với thay ñổi kéo dài ñiều kiện nuôi Chất dinh dưỡng giảm ñi, số lượng tế bào tăng lên ðồng thời hoạt tính trao đổi chất thay ñổi Về phương diện chức sản phẩm trao ñổi chất ñối với tế bào phân biệt nhóm: - Các sản phẩm mà hình thành chúng gắn liền với sinh trưởng Ví dụ: sản phẩm lên men, chất trao ñổi bậc 1, enzym Sự tổng hợp sản phẩm xảy thời gian sinh trưởng cịn tiếp diễn sau sinh trưởng ñã kết thúc - Các sản phẩm mà hình thành chúng xảy sau sinh trưởng ñã kết thúc; ví dụ sản phẩm trao ñổi chất bậc ðồng thời Thời gian Khơng đồng thời Thời gian Hình 1: ðộng học trình sinh trưởng tạo thành sản phẩm Nhiều sản phẩm chiếm vị trí trung gian Ví dụ tổng hợp axít amin diễn thời gian sinh trưởng tiếp diễn sau sinh trưởng ñã kết thúc, trình tổng hợp tiếp diễn sở sai hỏng www.daykemquynhon.ucoz.com di truyền Sự tổng hợp nhiều enzym xảy không song song với sinh trưởng mà gắn liền với trạng thái sinh lí định tế bào lên men cơng nghiệp cần phải tìm trạng thái sinh lí suất cao trì thời gian dài 1.3 Sự tổng hợp thừa Vi sinh vật tồn tự nhiên sinh sản phẩm trao ñổi chất thành phần tế bào mức ñộ cần thiết cho sinh sản tối ưu cho trì lồi Sự trao ñổi chất ñược bảo ñảm nhờ chế điều hồ Ví dụ: chế cần hoạt động cho axit amin khơng ñược tổng hợp nhu cầu tổng hợp protein Như vậy, điều kiện tự nhiên khơng có sản sinh dư thừa sản phẩm trao ñổi chất bậc 1, bậc enzym Nếu tự nhiên chế điều hồ bị rối loạn, ví dụ kết đột biến thể ñột biến sai hỏng trao ñổi chất thường có hại ñốt với chủng ban ñầu 1.3.1 Những nguyên tắc ñiều hồ trao đổi chất Có chế chịu trách nhiệm điều hồ trao đổi chất: ðiều hồ hoạt tính enzym nhờ ức chế sản phẩm cuối hay cịn gọi kìm hãm theo liên kết ngược ðiều hoà tổng hợp enzym nhờ kiềm chế sản phẩm cuối giải kiềm chế ðiều hoà tổng hợp enzym nhờ kiềm chế dị hoá Các enzym cấu trúc Glucoza Kiềm chế dị hoá Kiềm chế sản phẩm cuối A E.1 B E.2 C E.3 D E.4 S.phẩm cuối Ức chế sản phẩm cuối Sơ ñồ1: Các nguyên tắc ñiều hoà enzyme * Trong chế sản phẩm cuối trình sinh tổng hợp gây ức chế q trình tổng hợp Ở đây, sản phẩm cuối dù hình thành tế bào hay thu nhận từ mơi trường dinh dưỡng, điều ý nghĩa Trong chế này, sản phẩm cuối nói chung ảnh hưởng đến enzyme chuỗi sinh tổng hợp Enzym có tính định protein dị lập thể Nó có đặc điểm thay đổi cấu hình khơng gian www.daykemquynhon.ucoz.com có mặt sản phẩm cuối nhằm giảm bớt hoạt tính xúc tác Sự ức chế xảy nhanh có hiệu * Trong chế 2, sản phẩm cuối ức chế tổng hợp enzym cần cho tạo thành sản phẩm ấy, việc đọc thơng tin di truyền cần cho tổng hợp enzym (sự phiên âm) bị phong toả Ở nồng ñộ cao sản phẩm cuối tổng hợp enzym tham gia vào chuỗi phản ứng bị ngừng bị kéo dài cách ñáng kể Nếu nồng ñộ sản phẩm cuối giảm xuống mức xảy giải kiềm chế, nghĩa enzym ñược tạo thành với tốc độ cao Sự điều hồ theo kiểu xảy từ từ gắn liền với tổng hợp enzym Hoạt ñộng Chất ảnh hưởng dị lập thể Chất ảnh hưởng dị lập thể Thể đột biến Khơng hoạt động Dạng hoang dại Hình 2: Mơ hình ức chế sản phẩm cuối *Sự kiềm chế dị hố điều hồ q trình tổng hợp enzym dị hoá xúc tác phân huỷ chất Các enzym ñược tổng hợp nhờ cảm ứng enzym Cơ chế tương tự chế kiềm chế tức xảy mức ñộ phiên âm Trong cảm ứng enzym, chất dinh dưỡng đóng vai trị chất cảm ứng kích thích tổng hợp enzym xúc tác cho phân huỷ nó, nghĩa chất cảm ứng tổng hợp Do đó, việc tổng hợp enzym cảm ứng xảy có mặt chất tương ứng mơi trường www.daykemquynhon.ucoz.com * Sự kiềm chế dị hố điều hồ q trình tổng hợp enzym dị hố xúc tác phân huỷ chất Các enzym ñược tổng hợp nhờ cảm ứng enzym Cơ chế tương tự chế kiềm chế tức xảy mức ñộ phiên âm Trong cảm ứng enzym, chất dinh dưỡng đóng vai trị chất cảm ứng kích thích tổng hợp enzym xúc tác cho phân huỷ nó, nghĩa chất cảm ứng tổng hợp Do đó, việc tổng hợp enzym cảm ứng xảy có mặt chất tương ứng mơi trường Gen điều khiển chất kiềm chế khơng hoạt động khơng có sản phẩm cuối không phong toả truyền thông tin tổng hợp enzym Các gen cấu trúc chất kiềm chế hoạt động chất kiềm chế khơng hoạt động bị sai hỏng (ngay khơng có sản phẩm cuối ) không phong tỏa truyền thông tin tổng hợp enzym chất kiềm chế khơng hoạt động Sản phẩm cuối Chất kiềm chế hoạt động Khơng có truyền thông tin không tổng hợp enzym Dạng hoang dại không phong tỏa truyền thông tin tổng hợp enzym Thể đột biến Hình 3: Mơ hình kiềm chế sản phẩm cuối www.daykemquynhon.ucoz.com Nếu mơi trường có mặt nhiều chất trước hết xảy tổng hợp enzym xúc tác phân huỷ chất dễ sử dụng Sự tổng hợp enzym khác bị ức chế kiềm chế dị hố Thơng thường glucoza chất thích hợp 1.3.2 Những sai hỏng di truyền điều hồ trao đổi chất Các chế điều hồ trao đổi chất bị thay đổi đột biến dẫn tới tổng hợp thừa chất trao ñổi chất Những enzyme dị lập thể ngồi vị trí phản ứng với chất, chúng cịn vị trí khác sản phẩm cuối (hình 2) Vị trí thứ gọi trung tâm dị lập thể Hai vị trí tách biệt khơng gian khác cấu trúc Một đột biến dẫn ñến kết làm protein enzyme dị lập thể bị thay ñổi cách ñi khả phản ứng với chất hiệu ứng hoạt tính xúc tác Một protein bị biến đổi cịn hoạt động có mặt sản phẩm cuối dẫn đến tổng hợp thừa sản phẩm cuối tương ứng (hình phía bên phải) Trong kiềm chế tổng hợp enzym xảy phản ứng liệt phạm vi thông tin di truyền, phiên âm (hình 3) Sự điều hồ tổng hợp enzym bị rối loạn đột biến khác Những đột biến ñụng chạm ñến gen kiềm chế dẫn tới sai hỏng chất kiềm chế làm biến nó; hay đụng chạm đến gen điều khiển làm cho gen khả tác dụng với chất kiềm chế (bên phải hình 3) Tồn sai hỏng tương ứng biểu cảm ứng enzyme Nhờ sai hỏng mà enzyme cảm ứng trở thành enzyme cấu trúc, nghĩa chúng tồn tế bào không phụ thuộc vào chất kiềm chế dị hoá bị ñi CHƯƠNG II: NHỮNG VẤN ðỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT Sản xuất sinh khối sản phẩm trao ñổi chất q trình lên men có nhiều điểm giống phương pháp kỹ thuật Việc áp dụng kỹ thuật phương pháp tuỳ ñối tượng vi sinh vật mục tiêu sản phẩm cuối Trên sở áp dụng mục tiêu phương pháp riêng Chính khơng thể có phương pháp chung cho tất sản phẩm Việc áp dụng kỹ thuật phương pháp sở nguyên tắc chung kỹ thuật phương pháp trình bày Vì thế, chương giới thiệu nguyên tắc chung kỹ thuật phương pháp ñược áp dụng rộng rãi ngành vi sinh công nghiệp Các nguyên tắc chung bao gồm việc tuyển chọn giống vi sinh vật, giữ giống vi sinh vật, trình thiết bị www.daykemquynhon.ucoz.com hợp vài ba enzym có hoạt tính cao so với chủng ngun thuỷ ban đầu 5.3.2 Ni vi sinh vật: 5.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới tổng hợp enzym: Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng: Là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến phát triển tổng hợp enzym vi sinh vật Cùng loại vi sinh vật nuôi cấy mơi trường có thành phần dinh dưỡng khác mức độ tạo thành enzym thành phần enzym tạo thành khác Ví dụ: ni Asp.oryzae phương pháp bề mặt mơi trường cám đại mạch tạo nhiều enzym, có loại enzym có hoạt tính cao amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza Nhưng nuôi môi trường Kzapek cải tiến với nitrat tinh bột tạo thành chủ yếu α-amylaza, enzym khác tạo thành với lượng khơng đáng kể Hiện tượng giải thích lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng enzym Hiện tượng cảm ứng thấy vi sinh vật khơng thấy động thực vật Khi mơi trường có chất khó đồng hố vi sinh vật phải tiết vào mơi trường enzym tương ứng để phân huỷ thành chất đồng hố Cho nên thêm chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường ðịnh nghĩa: Một trình sinh tổng hợp ñược gọi cảm ứng xảy mức độ đáng kể mơi trường có chất đặc hiệu enzym chất trao đổi có cấu trúc tương tự chất Các enzym thuộc loại gọi enzym cảm ứng, chất kích thích q trình tổng hợp gọi chất cảm ứng Muốn tổng hợp enzym cảm ứng cần có điều kiện: - Thứ nhất: Có gen tương ứng nhiễm sắc thể - Thứ hai: Có ngun liệu đầy đủ để xây dựng phân tử enzyme (các axit amin, hợp phần coenzyme) -Thứ ba: Có lượng cần thiết cho việc tổng hợp enzyme - Thứ tư: Có chất cảm ứng Nếu có đủ điều kiện thiếu chất cảm ứng enzyme khơng tạo thành Trong công nghệ sản xuất enzyme cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp xác định nồng độ tối ưu mơi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao Ảnh hưởng độ ẩm: Trong phương pháp ni cấy bề mặt, độ ẩm mơi trường có vị trí đặc biệt quan trọng Khi ñộ ẩm thấp vi sinh vật bị rơi vào tình trạng bất lợi cho hoạt www.daykemquynhon.ucoz.com ñộng sống nên có khuynh hướng tạo bào tử hạn chế tổng hợp enzyme Khi ñộ ẩm cao độ tơi xốp thống khí canh trường bị giảm, tổng hợp enzyme khó khăn ðộ ẩm cho phép vi sinh vật tổng hợp enzyme tốt thường từ 53÷65%, phụ thuộc vào đặc điểm sinh lí vi sinh vật, vào cấu trúc học mơi trường điều kiện ẩm môi trường nuôi cấy pH môi trường: So với phương pháp ni chìm phương pháp bề mặt chịu ảnh hưởng pH mơi trường đến q trình sinh tổng hợp enzyme q trình ni pH mơi trường ổn định Với phương pháp ni cấy chìm pH mơi trường biến đổi rõ rệt q trình ni gây ảnh hưởng lớn tới tổng hợp enzyme Do đó, người ta thường ñiều chỉnh pH ñể thu ñược enzyme với hiệu suất cao Mỗi loại enzyme thường ñược tổng hợp mạnh vùng pH xác ñịnh ñối với loại vi sinh vật Ví dụ: amylaza pectinaza nấm mốc tổng hợp mạnh mơi trường có pH=4,5÷5, cịn proteaza mơi trường có pH=6÷6,5 Nhiệt độ: Phần lớn vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh enzyme thuộc loại ưa nhiệt trung bình, có nhiệt độ tối thích 22÷320C Với vi khuẩn có loại thích nhiệt độ cao (35÷550C) chúng có khả tổng hợp enzyme có độ bền nhiệt cao Khi nâng nhiệt độ mơi trường tới q mức thích hợp khả sinh tổng hợp enzyme bị giảm rõ rệt Oxy: ðể vi sinh vật sinh trưởng phát triển phải có oxy Do đó, thời kỳ tích luỹ sinh khối phải cung cấp đầy đủ oxy cho mơi trường Thời gian ni: Thời gian ni cấy thích hợp loại vi sinh vật ñược xác ñịnh thời gian cho phép tích tụ enzyme tối đa Thời gian phụ thuộc vào chủng vi sinh vật phụ thuộc vào enzyme chúng tổng hợp 5.3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường dinh dưỡng yếu tố có ảnh hưởng định ñến hoạt ñộng sống vi sinh vật khả sinh tổng hợp enzyme chúng ðể bảo ñảm yêu cầu tối thiểu cho vi sinh vật phát triển tổng hợp enzyme mơi trường cần có chất chứa cacbon, nitơ, hydro, oxy chất khoáng Mg, Ca, P,Sự, Fe, K v.v - Nguồn cung cấp cacbon thường dùng gluxit Khi sử dụng đường cần nhớ số đường có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp số enzyme www.daykemquynhon.ucoz.com thuỷ phân Ví dụ: đường glucose kìm hãm sinh tổng hợp số enzyme hệ amylaza Ngồi gluxit sử dụng nguồn cacbon khác mỡ, dầu, axit hữu cơ, rượu Trong số axit hữư axit lactic vi sinh vật hấp thụ dễ dàng Axit có nhiều nước chiết ngơ Cho nên cao ngơ dùng vừa nguồn bổ sung ñạm vừa nguồn cung cấp cacbon cho vi sinh vật phát triển - Nguồn cung cấp nitơ hợp chất hữu vô Các hợp chất hữu hợp chất giàu đạm cao ngơ, bột đậu tương, khơ đậu, khơ lạc… Nguồn nitơ vơ urê, NH3, muối amơn Ngồi ra, số axit amin, bazơ purin (adenine, guanine…), pyrimidin ñược bổ sung vào mơi trường ni cấy Các axit amin có tác dụng khác ñối với vi sinh vật việc sinh tổng hợp enzyme Nhiều axit amin có khả tăng cường sinh tổng hợp enzyme, số khác lại kìm hãm khơng có ảnh hưởng rõ rệt - Các ngun tố khống có ảnh hưởng rõ rệt đến q trình sinh tổng hợp enzyme Các ngun tố bao gồm nguyên tố ña lượng vi lượng Vi lượng sắt, kẽm, ñồng, coban Các nguyên tố thường có nước thành phần hữu khác môi trường (bột, cao ngơ) khơng cần bổ sung bổ sung dạng vết Nồng ñộ nguyên tố tăng kìm hãm mạnh phát triển vi sinh vật Các nguyên tố ña lượng ñược ñưa vào dạng muối vơ cần tính hàm lượng chúng có sẵn thành phần môi trường Trong nguyên tố cần lưu ý đến P S ngun tố thành phần cấu tạo nhiều chất quan trọng, nucleotit, lipit, vitamin… - Các yếu tố sinh trưởng: vitamin chủ yếu dùng để kích thích sinh trưởng vi sinh vật Tuy nhiên cần nhớ rằng, nhiều trường hợp mơi trường thích hợp cho sinh trưởng vi sinh vật chưa hẳn ñã thích hợp để sinh tổng hợp enzyme Có mơi trường kìm hãm tích luỹ sinh khối tế bào tăng cường sing tổng hợp enzyme ðể xác định thành phần mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật tiến hành lựa chọn sở kinh nghiệm dùng phương pháp toán học qui hoạch thực nghiệm Khi lựa chọn ngun liệu để chuẩn bị mơi trường cần ý rằng, nguyên liệu tự nhiên có chứa nhiều chất khác nhau, kể ngun tố khống đa lượng vi lượng có yếu tố sinh trưởng Do vậy, nhiều trường hợp không cần bổ sung thêm loại muối vô Mặt khác, nguyên liệu rẻ tiền thường dùng cơng nghiệp để sản xuất chế phẩm enzyme từ vi sinh vật www.daykemquynhon.ucoz.com Các nguyên liệu tự nhiên thường dùng để chuẩn bị mơi trường cám gạo, bột ngơ, bột đậu tương, khơ lạc phế liệu men bia, rỉ ñường… Trong nguyên liệu cám gạo bột ngơ nguồn cacbon tốt Cịn nấm men bia tự phân, khơ lạc nguồn nitơ tốt Khi chuẩn bị môi trường cịn cần phải ý đến chất có tác dụng điều hồ sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt chất cảm ứng ðối với loại enzyme có nhiều chất cảm ứng phải lựa chọn chất cảm ứng có hiệu Ví dụ chất cảm ứng sinh tổng hợp amylaza tinh bột, dextrin; proteaza protein có trọng lượng phân tử nhỏ Sử dụng chất cảm ứng thường làm tăng ñáng kể lượng enzyme ñược tổng hợp Tuy nhiên, lựa chọn chất cảm ứng cần tính tốn cẩn thận giá thành 5.3.2.3 Các phương pháp ni cấy vi sinh vật: Có nhiều phương pháp khác để ni vi sinh vật tổng hợp enzyme Phương pháp bề mặt: Phương pháp thích hợp để ni loại nấm mốc khả phát triển nhanh, mạnh nên tạp nhiễm • Qui trinh cơng nghệ: Mơi trường phối trộn làm ẩm hấp ñánh tơi làm nguội gieo mốc giống vào thiết bị ni vào phịng ni ni mốc canh trường Các chất dinh dưỡng thường nguyên liệu tự nhiên chất thải công nghệ thực phẩm hỗn hợp nhiều chất Trong môi trường cần thêm chất cảm ứng cần thiết cho tổng hợp enzym bổ sung thêm chất dinh dưỡng nguồn nitơ, photpho nước chiết ngô, khoai tây, dịch tự phân nấm men…ðể bảo đảm độ xốp mơi trường cần có chất làm xốp trấu (10÷20%) Trước gieo cấy cần trùng mơi trường để đảm bảo khơng bị nhiễm vi sinh vật lạ Q trình ni cấy kéo dài từ 33÷48h Có tượng: - Thải nhiệt, cần giữ to=28÷32oC - Giảm ẩm, giữ ϕphịng=96÷100% - Cung cấp O2: q trình mốc phát triển lấy O2 thải CO2 cần cung cấp không khí vơ trùng • Ưu nhược điểm phương pháp: Ưu: - Cho nồng ñộ enzym cao so với phương pháp bề mặt - Có thể sấy khơ nhanh chóng mơi trường (dạng thơ) mà khơng ảnh hưởng đến hoạt lực enzym - Tránh nhiễm trùng toàn khối canh trường - Tốn điện www.daykemquynhon.ucoz.com Nhược: - Khó giới hố, tự động hố - Năng suất thấp - Tốn nhiều lao ñộng - Tốn nhiều mặt Phương pháp ni cấy chìm: • Với phương pháp vi sinh vật phát triển môi trường lỏng có sục khí khuấy đảo liên tục Nguồn cacbon sử dụng phương pháp tinh bột, chất thải có đường rỉ đường nguyên liệu khác Nguồn nitơ hay dùng chất hữu cao ngô, dịch men bia, dịch thuỷ phân, khơ lạc…Ngồi thành phần mơi trường cần bổ sung thêm chất khống Mơi trường cần ñược trùng cách sục trực tiếp to=121÷125oC thời gian 60÷90 phút mơi trường chứa ngun liệu bột, đạm thơ 20÷30 phút với loại mơi trường có chứa đường Trong q trình ni cấy chìm cần phải sục khí vơ trùng khuấy đảo liên tục Nếu có bọt phải dùng dầu phá bọt Thời gian từ 1÷4 ngày tuỳ chủng Phải ý điều chỉnh pH • Ưu, nhược: + Ưu: - Tiết kiệm diện tích - Dể giới hố, tự động hố - Sử dụng hợp lí chất dinh dưỡng, tránh lãng phí - Thu enzym tạp chất - ðảm bảo vệ sinh, vơ trùng nên nhiễm vi sinh vật lạ + Nhược: - Nồng ñộ enzym thấp, cần làm ñặc canh trường trước tách nên giá thàcao - Tốn điện sục khí - Nếu khơng đảm bảo vơ trùng nhiễm hàng loạt Phương pháp ni chìm bước: - Bước 1: vi sinh vật ni thiết bị để phát triển tối ña - Bước 2: chuyển sinh khối sang thiết bị khác ñể sinh tổng hợp enzym 5.3.3 Tách tinh chế enzym: Trong thực tế enzym ñược sử dụng nhiều dạng khác Một số lĩnh vực sử dụng dạng canh trường khô mà chất lượng sản phẩm khơng thay đổi (như sản xuất rượu, cơng nghệ thuộc da) ða số ngành công nghiệp (chủ yếu thực phẩm cơng nghiệp nhẹ) địi hỏi phải sử dụng chế phẩm enzym (gọi chế phẩm kỹ thuật) Còn y học phải sử dụng chế phẩm enzym tinh khiết Tuy nhiên, cho ñến chưa tìm ñược phương www.daykemquynhon.ucoz.com pháp chung ñể tách enzym ñó mà phải phối hợp nhiều phương pháp khác Quá trình làm enzym gồm giai ñoạn chiết enzym tách enzym 5.3.3.1 Chiết enzym: Mục đích cơng đoạn tách enzym khỏi canh trường sau lên men Quá trình phụ thuộc vào loại enzym (ngoại bào hay nội bào) môi trường lên men (lỏng rắn) mà tiến hành khác ðối với enzym ngoại bào nằm canh trường lỏng tiến hành tách sinh khối để thu dung dịch có chứa enzyme Nếu enzym ngoại bào nằm canh trường rắn (xốp) dùng nước vơ trùng dung dịch đệm thích hợp ñể chiết enzym ðể thu enzym nội bào phải tiến hành phá vỡ tế bào phương pháp sau: - Phương pháp đồng hố (nghiền máy đồng hố) - Nghiền với bột thuỷ tinh, cát… - Tự phân - Làm lạnh đơng tan giá lặp ñi lặp lại nhiều lần - Nhờ tác ñộng siêu âm - Dùng áp suất thẩm thấu cao - Phương pháp khuyếch tán Sau phá vỡ tế bào dùng nước cất dung dịch muối lỗng dung dịch đệm thích hợp để chiết enzym 5.3.3.2 Tách enzym: Mục đích giai đoạn làm tách enzym khỏi hỗn hợp phụ thuộc vào mức ñộ tinh chế phẩm enzym mà trình tách khác Thu nhận chế phẩm kỹ thuật: Chế phẩm enzym kỹ thuật chế phẩm enzym ñược tinh chế sơ chứa vài enzym chủ yếu ðể thu chế phẩm enzym kỹ thuật ñầu tiên phải cô ñặc dung dịch enzym nhiệt ñộ 30oC cho ñến ñạt nồng ñộ 20g/lit Sau tiếp tục nhiệt độ 40oC cho đạt nồng độ 30÷50g/lit Khi cho thêm chất bảo quản chất ổn ñịnh Tiếp theo ñem sấy phun với nhiệt độ khơng vượt q 70oC Ngồi ñể thu chế phẩm enzym kỹ thuật người ta kết tủa dung mơi hữu muối trung tính sau cho chất ổn định vào sấy khô nghiền Dung môi hữu thường dùng rượu etylic, izopropylic, axeton…kết tủa dung môi hữu dựa nguyên tắc thêm dung môi vào dung dịch enzym lực hút phân tử protein-enzym tích điện phân tử www.daykemquynhon.ucoz.com nước bao quanh chúng bị giảm Khi nồng độ dung mơi thêm vào ñạt ñến mức làm cho lượng hydrat hoá phân tử nước protein nhỏ lượng liên hợp phân tử protein-enzym lúc phân tử proteinenzym liên hợp lại tạo kết tủa Tuỳ theo tính chất enzym dung mơi hữu mà loại enzym kết tủa nồng độ dung mơi khác Ví dụ proteaza kết tủa etanol 76÷78%, α-amylaza kết tủa etanol 70%, glucoamylaza kết tủa etanol 45% axeton 70% Dùng dung mơi hữu có ưu ñiểm cất thu hồi ñược Nhưng dung môi dễ làm cho enzym bị vô hoạt ðể khắc phục nhược điểm phải tiến hành kết tủa enzym nhiệt ñộ thấp (5oC) thời gian ngắn Các muối trung tính thường dùng để kết tủa enzym là: (NH4)2SO4, NaCl…tuỳ theo tính chất loại enzym mà người ta dùng nồng độ muối khác Ví dụ amylaza thường kết tủa (NH4)2SO4 nồng ñộ 0,75% ñộ bão hồ; glucoamylaza nồng độ 0,8÷0,9% độ bão hồ Phương pháp dùng muối trung tính kết tủa cịn gọi diêm tích Phương pháp dựa nguyên tắc ion muối có tác dụng phá vỡ lớp hydrat bao quanh phân tử protein hút phân tử trái dấu phía Kết làm phân tử protein bị nước đơng tụ Sau kết tủa phải loại muối trung tính khỏi enzym phương pháp thẩm tích ðể thực người ta cho enzym vào màng bán thấm (xenlofan) cho vào dung dịch đệm thích hợp ngâm 24 sau thử lại loại hết muối đưa xử lí tiếp Thu nhận chế phẩm tinh khiết: ðể thu nhận chế phẩm tinh khiết phải kết hợp nhiều phương pháp qua nhiều giai ñoạn ðầu tiên phải tiến hành loại bỏ protein khơng hoạt động phương pháp biến tính chọn lọc Các protein biến tính tách cách lọc ly tâm Sau enzym kết tủa dung môi hữu muối trung tính Tiếp theo dùng sắc kí (sắc kí trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, gel phân tử v.v ) ñể thu phân ñoạn enzym có hoạt lực cao Sau tinh chế xong phải dùng phương pháp ñiện di ñể kiểm tra mức ñộ ñồng enzym 5.4 ðánh giá chất lượng enzym: 5.4.1 Phương pháp ñánh giá: Chất lượng enzym ñược ñánh giá mức độ hoạt động tức hoạt độ enzyme Thực tế người ta ño hoạt ñộ enzym thơng qua việc xác định lượng chất ñi hay lượng sản phẩm ñược tạo thành phản ứng Về nguyên tắc chia làm nhóm phương pháp xác định hoạt độ enzym: www.daykemquynhon.ucoz.com ðo lượng chất bị ñi hay lượng sản phẩm ñược tạo thành thời gian ñịnh với nồng ñộ enzym xác ñịnh ðo thời gian cần thiết ñể thu ñược lượng biến thiên ñịnh chất hay sản phẩm ứng với nồng ñộ enzym ñịnh ðo nồng ñộ enzym cần thiết ñể làm biến ñổi lượng chất hay thu nhận lượng sản phẩm ñịnh thời gian ñịnh 5.4.2 ðơn vị: ðể ño hoạt ñộ enzym người ta dùng ñơn vị hoạt độ - ðơn vị enzym quốc tế (kí hiệu UI): lượng enzym có khả xúc tác làm chuyển hóa micromol chất sau phút ñiều kiện tiêu chuẩn (ở pHopt, toopt ñối với enzym cần xác ñịnh) - ðơn vị Katal (Kat): lượng enzym có khả xúc tác làm chuyển hố mol chất giây ñiều kiện tiêu chuẩn 1UI= -6 × 10 Kat=16,67 nKat (nanoKat) 60 - Hoạt ñộ riêng chế phẩm enzym: số ñơn vị UI số ñơn vị Kat ứng với 1ml chế phẩm (nếu dung dịch) 1mg chế phẩm (nếu bột) Nếu enzym tinh hoạt ñộ ñược biểu thị số UI số Kat 1mg enzym - Hoạt ñộ phân tử: số phân tử chất chuyển hố phân tử enzym ñơn vị thời gian 5.4.3 Những ý ñánh giá chất lượng enzym: ðể ñánh giá xác độ hoạt động enzym xác định hoạt độ cần ý: - Nồng ñộ chất phản ứng phải giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hồ enzym khơng q cao đến mức kìm hãm enzym - Với enzym cần có chất hoạt hố chất làm bền phải cho chất vào enzym trước cho chất vào phản ứng - Xác ñịnh hoạt ñộ cần tiến hành pHopt cố ñịnh pH thường thay ñổi phụ thuộc vào chất thành phần dung dịch ñệm - Nhiệt ñộ dùng xác ñịnh hoạt ñộ phải nhỏ nhiệt ñộ tối ưu enzym để đề phịng kìm hãm enzym nhiệt ñộ cao - Thời gian xác ñịnh hoạt độ thường 5÷30 phút Nhưng có trường hợp kéo dài ñến 24 hoạt ñộ enzym thấp Trong thời gian dài phải cho thêm chất diệt khuẩn ñể tránh tượng tạp nhiễm 5.5 Enzym khơng tan: Enzym khơng tan hay cịn gọi enzym cố định enzym nằm khơng gian bị giới hạn Sự giới hạn linh hoạt enzym ñạt ñược cách ñưa vào pha cách li, tách rời khỏi pha dung dịch tự www.daykemquynhon.ucoz.com có khả tiếp xúc ñược với phân tử chất Pha chứa enzym thường khơng tan nước polymer cao phân tử ưa nước 5.5.1 Ưu nhược ñiểm enzym khơng tan: Ưu điểm: - Giảm giá thành sử dụng lặp lại nhiều lần lượng enzym xác định - Enzym khơng lẫn sản phẩm tránh ảnh hưởng khơng tốt sản phẩm - Có thể làm ngừng nhanh chóng phản ứng cần thiết - Enzym khơng tan bền enzym tan kết hợp tận dụng yếu tố nhiệt ñộ, pH… - Dùng enzym cố định dễ dàng thay trình lên men phản ứng enzym ngồi tế bào Nhược điểm: Enzym khơng tan có hoạt ñộ riêng nhỏ enzym tan 5.5.2 Phương pháp sản xuất enzym khơng tan: Gồm có phương pháp: 5.5.2.1 Gắn liên kết đồng hố trị: ða số enzym khơng tan sản xuất phương pháp Nó chia làm hai phương pháp gắn enzym vào chất khơng hồ tan gắn phân tử enzym với để tạo thành đại phân tử khơng hoà tan Gắn phân tử enzym vào chất mang khơng hồ tan: • u cầu chất mang: - Có độ hồ tan thấp bền vững với tác động cơ, nhiệt hố học - Các chất mang khơng gây tác động kìm hãm enzym - Khơng hấp phụ phi chọn lọc ñối với protein - Nên háo nước chất mang kỵ nước gây ức chế với enzym ñược mang - Việc gắn có hiệu chất mang enzym có điện tích trái dấu • Những chất mang thường dùng: + Chất mang hữu cơ: polypeptit, polysaccarit, dẫn xuất xenlulo (DEAE-xenlulo: dietyl animoetyl xenlulo, CM-xenlulo: cacboxyl metyl xenlulo), dẫn xuất dextran (DEAE-sephadex, CM-sephadex) agaroza (aga khác với agaroza, thành phần agaroza có gốc sunfat) Chất mang thông dụng detran có liên kết ngang gọi sephadex agaroza dạng hạt gọi sepharoza Nói chung loại có cấu trúc lỗ xốp làm cho phân tử lớn xâm nhập vào gel cách dễ dàng www.daykemquynhon.ucoz.com Ngồi cịn có polymer tổng hợp khác polyacrylamit, polysterol, polyamit + Chất mang vơ cơ: so với chất mang hữu chất mang vô bền nhiệt, học, hố học, vi sinh vật khơng thay đổi cấu hình khn thay đổi tính chất môi trường xung quanh Các chất mang vô như: silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt … Gắn enzyme với Người ta gắn enzyme lại với nhờ tác nhân ña hay lưỡng chức để tạo thành đại phân tử enzyme khơng hồ tan Với phương pháp thu ñược nhiều dẫn xuất enzyme khơng tan, ví dụ thu dẫn xuất tripxin khơng tan cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% ñể liên kết phân tử enzyme Phương pháp có ưu điểm: - Ít tổn thất enzyme giải phóng môi trường - Tăng khả chống chịu enzyme ñối với yếu tố biến tính nên ñưa vào sản xuất ñược Nhược ñiểm phương pháp số enzyme cố định 5.5.2.2 “Gói”enzyme khn gel Phải tiến hành trùng hợp hố gel đồng thời với có mặt enzyme Sau enzyme giữ lại gel gel có enzyme làm nhỏ cách nghiền máy đồng hố ép qua lỗ rây đem sấy khơ nhiệt độ khơng q 400C Có thể “gói” enzyme phương pháp sau: - Các gel hình thành polymer hoá tổng hợp - Các enzyme bị nhốt lỗ nhỏ sợi tổng hợp - Gói bao vi thể - Phương pơháp tiền polymer 5.5.2.3 Phương pháp hấp phụ vật lí Phương pháp hấp phụ vật lí khơng thơng qua liên kết hố trị gắn enzyme chất mang Q trình thực hấp phụ ñơn giản: chất hấp phụ enzyme ñược trộn lẫn với khoảng thời gian cho phép hấp phụ xảy nhờ tương tác liên kết ion, kị nước, hydrogen lực Van der Wals Phương pháp có nhược ñiểm trình giải hấp phụ enzyme dễ dàng xảy thay ñổi pH, nhiệt ñộ thành phần ion 5.5.3 Một số tính chất enzyme khơng tan: - Enzyme khơng tan có hoạt đọ riêng nhỏ enzyme tan - Enzyme không tan tuân theo ñịnh luật Michaelis Menten (sự ảnh hưởng nồng ñộ chất ñến hoạt tính enzyme) Tuy nhiên có tượng cạnh tranh chất chất mang, tượng khuyếch tán nên có www.daykemquynhon.ucoz.com sai khác ñáng kể tốc ñộ phản ứng enzyme: chất mang chất tích điện cùnh dấu Khơngm khơng tan > Km tan, tích điện trái dấu ngược lại (Km - Hằng số Michaielis) - Enzyme khơng tan có tính bền nhiệt cao enzyme tan - Enzyme khơng tan có dịch chuyển pH tối ưu sang miền kiềm axit so với enzyme tan - Enzyme khơng tan có thời gian bảo quản lâu bền với chất kìm hãm tác nhân gây biến tính CHƯƠNG VI: SẢN XUẤT AXIT HỮU CƠ Axit hữu ñược sử dụng rộng rãi chế biến bảo quản thực phẩm công nghệ vi sinh vật Chính mà axit hữu ñược nghiên cứu sả xuất rộng rãi 6.1 Các phương pháp sản xuất axít hữu cơ: ðể sản xuất axít hữu người ta dùng nhiều phương pháp khác như: - Phương pháp tổng hợp hoá học - Phương pháp chiết tách từ nguyên liệu thực vật - Phương pháp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật Trong phương pháp phương pháp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật có ý nghĩa trình sản xuất nhanh, sử dụng nguyên liệu sẵn có rẻ tiền tạo nhiều loại axít hữu khác 6.2 Kỹ thuật sản xuất số axít hữu nhờ vi sinh vật: 6.2.1 Sản xuất axít axetic: Axit axetic thu nhận cách lên men đường oxy hố rượu etylic Sau xét q trình sản xuất axit axetic từ rượu etylic Chủng vi sinh vật: ðể oxy hố rượu etylic thành axít axetic người ta sử dụng nhiều loại vi khuẩn khác Nhưng sử dụng nhiều chủng vi khuẩn: Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum Các loại vi khuẩn có khả oxy hóa lớn Phương trình lên men: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q Kỹ thuật lên men: Có thể sử dụng phương pháp lên men liên tục gián đoạn ðể q trình lên men tiến triển tốt cần ý ñiểm sau: - Nguyên liệu hỗn hợp dinh dưỡng: sử dụng cồn thơ cồn tinh chế để làm mơi trường Theo kinh nghiệm cho thấy sản xuất từ cồn thơ www.daykemquynhon.ucoz.com axit có mùi mạnh hơn, nhiên cồn thơ có chứa nhiều dầu fuzen nên ảnh hưởng xấu đến q trình lên men ðể cho vi khuẩn hoạt động tốt mơi trường ngồi nước, rượu, axit axetic cịn phải có muối khoáng, hydrat cacbon hợp chất chứa nitơ dễ hấp thụ - Nồng ñộ rượu axit axetic: nồng độ rượu thích hợp phụ thuộc vào dạnh vi khuẩn sử dụng Nói chung giới hạn cao nồng độ rượu 15% Khi mơi trường lên men hết rượu vi khuẩn sử dụng axit Do đó, để tránh tượng thiết bị lên men ln để lại rượu (0,3÷0,5%) Mơi trường có phản ứng axit thích hợp cho hoạt ñộng vi khuẩn axetic Tuy nhiên axit tich luỹ nhiều ảnh hưởng ñến hoạt ñộng vi khuẩn ðể bảo tồn tính khiết vi khuẩn chống phát triển vi sinh vật lạ, ñồng thời bảo ñảm cho trình lên men tiến triển bình thường nên tiến hành lên men nồng độ axit axetic khoảng 10% - Sự thơng khí: oxy hoá rượu xảy vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxy khơng khí Do ñó, có mặt nhiều oxy tạo ñiều kiện thuận lợi cho q trình lên men Theo lí thuyết để lên men kg rượu khan cần 2,3 m3 khơng khí - Nhiệt độ: nhiệt độ có ý nghĩa lớn q trình lên men axetic Nhiệt độ 6÷100C mức tối thiểu vi khuẩn axetic, nhiệt độ thấp hoạt ñộng sống vi khuẩn bị ngừng Ở nhiệt độ nhổ 12÷150C vi khuẩn sinh sản chậm, cịn khoảng 15÷340C chúng phát triển bình thường sinh sản nhanh chóng Khi nhiệt độ thấp trình lên men diễn chậm chạp, ngược lại, nhiệt độ q cao rượu axit axetic bốc nhiều gây tổn thất lớn sản xuất Nhiệt độ thích hợp lồi vi khuẩn khác khơng giống ðối với Bacterium schuzenbachi thích hợp nhiệt độ 280C Cịn Bacterium curvum 35÷370C Ở nhiệt ñộ cao cường ñộ sinh sản tạo axit bắt ñầu giảm Thu nhận sản phẩm: Sau lên men xong dung dịch axit phải ñược làm lọc ðể làm thường sử dụng số chất gelatin, than hoạt tính Sau xử lí chất để n vài ba ngày cho lắng cặn ñưa hỗn hợp ñi lọc Sau lọc dung dịch axit nồng nên phải tang trử tháng đem sử dụng Muốn làm dấm pha lỗng ñến nồng ñộ yêu cầu ñem lọc lần ðể giữ chất lượng dấm trùng sử dụng chất bảo quản Ngoài ra, số trường hợp ñể nâng cao nồng ñộ axit người ta tiến hành chưng cất hỗn hợp sau lên men để thu hồi axít axetic www.daykemquynhon.ucoz.com 6.2.2 Sản xuất axít lactic: Chủng vi sinh vật: Sử dụng vi khuẩn lactic lên men ñiển hình thích nghi nhiệt độ cao Thường hay sử dụng chủng Lactobacillus Delbruckii Phương trình lên men: C6H12O6 2C3H6O3 + Q E C6H12O6 2NAD+ 2NADH2 2CH3COCOOH 2CH3CHOHCOOH E Sơ ñồ 6: Cơ chế tổng hợp axit lactic tế bào vi sinh vật Kỹ thuật lên men: ðể chuẩn bị mơi trường lên men sử dụng rỉ ñường loại nguyên liệu khác ðể vi khuẩn phát triển cần bổ sung thêm vào môi trường số chất dinh dưỡng khác Có thể tiến hành lên men phương pháp liên tục gián ñoạn Lên men nhiệt ñộ 500C phải ổn ñịnh cách nghiêm ngặt Giảm nhiệt ñộ lên men làm cho hoạt lực lên men yếu làm phát triển vi sinh vật lạ Ngược lại, tăng nhiệt độ làm vơ hoạt enzyme làm chậm trình lên men Quá trình sinh tổng hợp axít lactic thích nghi pH axít yếu (6,3÷6,5) Tuy nhiên, lên men tích luỹ axit nên làm cho nồng độ axit mơi trường tăng lên Nếu độ pH q thấp kìm hãm tạo thành axít lactic q trình lên men ngừng trước tất ñường chuyển thành axit lactic Do q trình lên men phải ln ln giữ pH mức thích hợp Người ta thường dùng muối canxi (CaCO3) để trung hồ tạo canxilactat (Ca(C3H5O3)2) Thu nhận sản phẩm: Sau lên men người ta tiến hành xử lí để thu hồi dung dịch canxilactat ñem kết tinh Tiếp theo làm nóng chảy tinh thể canxilactat dùng H2SO4 ñể chuyển thành CaSO4 C3H6O3 nhiệt ñộ 60÷700C: Ca(C3H5O3)2 + H2SO4 = CaSO4 + 2C3H6O3 Tiếp theo tiến hành tách dung dịch axit khỏi hỗn hợp Sau phải tách sắt làm dung dịch than hoạt tính li tâm tách tạp chất www.daykemquynhon.ucoz.com Muốn nâng cao nồng độ axít đem dung dịch làm sấy chân khơng Bằng cách nâng cao nồng độ axit lên đến 70% 6.2.3 Sản xuất axít citric: Axit citric có nhiều số loại cam, chanh, dâu tây.v.v Lần ñầu tiên axit citric ñược sản xuất cách từ dịch chanh Hiện axit citric ñược sản xuất phương pháp lên men nhờ tác dụng nấm mốc Axit citric ñược sử dụng rộng rãi cơng nghệ thực phẩm để sản xuất nước giải khát, đồ hộp, sử dụng cơng nghiệp dệt, ñiện ảnh, y dược… Chủng vi sinh vật: Thường sử dụng Asperillus niger ñể sinh tổng hợp axít citric Cơ chế tổng hợp: C6H12O6 ↓ CH3COCOOH CH3CHO + CO2 ↓ -2H HO CH3COOH -2H CH2COOH -2H CHCOOH + →CH2COOH   CH2COOH CHCOOH CHOHCOOH Axit xuxinic ax.fumaric ax.malic oxalacetat CH2COOH  COCOOH  COCOOH + CH3COOH COOH HOOCCH2C–CH2COOH OH Axit citric Sơ ñồ 7: Cơ chế tổng hợp axit citric tế bào vi sinh vật Phương trình lên men tổng quát: C6H12O6 + 3O2 = 2C6H8O7 + 4H2O Kỹ thuật lên men: Ngun liệu dùng để chuẩn bị mơi trường rỉ đường, dịch thuỷ phân tinh bột loại nguyên liệu khác Trong môi trường ngồi đường cịn cần phải có chất cung cấp nitơ, photpho, kali, kẽm số nguyên tố vi lượng khác www.daykemquynhon.ucoz.com Q trình tích luỹ axit citric thích nghi mơi trường có pH axit Tuy nhiên tích luỹ nhiều axit pH mơi trường giảm nhiều Do cần có biện pháp đẻ giữ pH mức thích hợp Sự thơng khí cho mơi trường quan trọng tất mixen nấm mốc loại hiếu khí điển hình Trong q trình phát triển nấm mốc địi hỏi lượng oxy lớn Nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc Aspergillus niger 31÷370C Ở nhiệt độ 34÷370C sinh khối nấm mốc phát triển mạnh, cịn 31÷320C axit tạo nhiều Nếu nhiệt độ thấp phát triển sinh khối bị chậm tạo thành axit citric bị giảm mà tích luỹ axit gluconic lại tăng Cịn nhiệt độ cao sinh khối phát triển nhanh trình tạo axit bị kìm hãm Thu nhận sản phẩm: Dung dịch sau lên men hỗn hợp gồm nhiều axit, ñó chủ yếu axit citric, gluconic oxalic Quá trình tách axit citric gồm bước: - Trung hoà dung dịch sau lên men: C6H8O7 + 3Ca(OH)2 = Ca3(C6H5O7)2 + 6H2O Axit citric Canxi citrate 2C6H12O7 + Ca(OH)2 = Ca(C6H11O7)2 + 2H2O Axit gluconic Canxi gluconat C2H2O4 + Ca(OH)2 = CaC2O4 + 2H2O Axit oxalic Can xxi oxalate - Tách rửa kết tủa thiết bị lọc chân không - Chuyển canxi citrate thành axit citric: Ca3(C6H5O7)2 + 3H2SO4 = 2C6H8O7 + 3CaSO4 Chú ý: phải sử dụng dư axit sunfuric - Tách dung dịch axit thiết bị lọc chân không - Sấy dung dịch axit thiết bị sấy chân khơng - Kết tinh để thu nhận tinh thể axit - Li tâm ñể tách tinh thể Sau li tâm thu nhận tinh thể axit citric có độ ẩm 2÷3% đem sấy khơ nước có chứa axit sử dụng vào mục đích khác - Sấy tinh thể: dùng thiết bị sấy thùng quay sấy băng tải Sấy nhiệt độ khơng vượt q 350C Nếu sấy nhiệt độ cao tinh thể axit bị phá huỷ Trước đưa đóng gói cần phải cho axit qua sàn ñể loại bỏ tạp chất tình cờ rơi vào www.daykemquynhon.ucoz.com ... tai hoạ - Cơng nghệ sinh học ñược ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm dinh dưỡng Ngành công nghệ lên men phận công nghệ sinh học ñã sản xuất nhiều sản phẩm thú vị cho ngành thực phẩm Hoặc việc... sinh học có liên quan ñến nhiều lĩnh vực bao gồm ngành như: - Công nghệ di truyền - Công nghệ nuôi cấy mô tế bào - Công nghệ enzyme - Công nghệ vi sinh vật… Trong học phần nghiên cứu số phần công. ..MỞ ðẦU Công nghệ sinh học ngành khoa học ñang ñược giới quan tâm Giá trị cơng nghệ sinh học chỗ cơng cụ áp dụng cho nhiều ngành kinh tế sản xuất lương thực thực phẩm, chăn nuôi thú