PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN ppt

Phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển mẫu • Các khái niệm ▫ Mẫu ban đầu: Mẫu ban đầu được lấy từ các bao bì chứa đựng hay đơn vị chứa khác nhau, ở các vị trí khác nhau để đảm bảo t

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN

Chương VI

YÊU CẦU TRONG LẤY MẪU, XỬ LÝ MẪU, TIẾP NHẬN MẪU TẠI PHÒNG

THÍ NGHIỆM

Phương pháp thu, bảo quản và vận

chuyển mẫu

• Các khái niệm

▫ Mẫu ban đầu: Mẫu ban đầu được lấy từ các bao bì chứa

đựng (hay đơn vị chứa) khác nhau, ở các vị trí khác nhau

để đảm bảo tính chất đại diện trung bình cho lô hàng Số lượng của mẫu ban đầu tuỳ thuộc vào số lượng đơn vị

chứa của lô hàng

▫ Mẫu trung bình: Mẫu trung bình là lượng mẫu cần thiết

lấy ra từ mẫu ban đầu sau khi đã trộn đều mẫu ban đầu Nó phụ thuộc vào loại và dạng sản phẩm ban đầu

▫ Mẫu phân tích: Mẫu phân tích là lượng mẫu cần thiết

dùng cho quá trình phân tích được lấy ra từ mẫu trung bình Các loại mẫu đều được dán nhãn

• Phải đảm bảo 2 điều kiện:

- Mẫu có tính đại diện cho lô hàng, lượng mẫu đủ để phân

tích

- Thành phần & số lượng VSV ko được biến đổi kể từ khi lấy mẫu đến khi phân tích

Cách tiến hành lấy mẫu

• Mẫu dạng hạt: ngũ cốc, cà phê,… trong lô hàng có số lượng bao dưới 5 thì bao nào cũng lấy một ít ở vị trí khác nhau Trong lô hàng từ 6 - 100 bao thì lấy ít nhất

5 bao, trong lô có số bao lớn hơn 101 trở lên thì lấy ít nhất 5% số bao v.v Dụng cụ lấy mẫu là xiên lấy mẫu

• Lô hàng sắp theo hình vuông, gạch 2 đường chéo lấy mẫu ở 2 tam giác đối diện bất kỳ

• Mẫu ban đầu phải có khối lượng 3 – 5 kg

Mẫu dạng lỏng: rượu, nước mắm

• Sản phẩm trong phy hay bồn lớn thì dùng ống xi phông, ống hút có độ dài khác nhau để lấy mẫu ở các vị trí khác nhau: trên, giữa và ở đáy, rồi trộn đều Lượng mẫu tối

thiểu là 2 lít mẫu trung bình

• Nếu sản phẩm lỏng chứa trong chai lọ, can và lô hàng

có ít hơn 1000 đơn vị chứa thì lấy 2% số đơn vị chứa, nếu

lô hàng có trên 1000 đơn vị chứa thì lấy từ 0,3 - 1% số

đơn vị chứa Sau đó trộn đều tất cả số mẫu ban đầu đã lấy được, để lấy ra mẫu trung bình khoảng 2 lít

• Phần còn lại của mẫu phân tích là mẫu lưu

Các sản phẩm khác dạng sánh hoặc bán rắn

lấy lượng lớn hơn

• Lưu ý đối với dầu thực vật, bơ phải trách sự oxy hoá của không khí

Nhà máy CBTS: mẫu (kiểm tra vệ sinh công nghiệp) lấy với khối lượng nhỏ, nhiều thời điểm & công đoạn khác nhau trong qt cbiến

Thịt, cá: nơi nhiễm chủ yếu là bề mặt, sd các dụng cụ lấy mẫu để quét trên bề mặt sp hay cắt mẫu với độ

dày từ 2-3 mm

Dụng cụ lấy và chứa mẫu

Từ các chất liệu khác nhau: phải thanh trùng

Bình (có mẫu) được niêm phong, ghi số thứ tự mẫu, người lấy mẫu

Thông tin hồ sơ mẫu

Người yêu cầu PTN phân tích mẫu: Tên, địa chỉ, điện thoại Nơi lấy mẫu (cửa hàng, khách hàng ), ngày, địa điểm, thời gian lấy mẫu

Miêu tả hoàn cảnh, môi trường nơi lấy mẫu

Bản chất mẫu

1 nhãn dễ đọc ghi rõ tên mẫu

T0 mẫu, kho chứa khi lấy mẫu

Nguyên nhân lấy mẫu

Thông tin thực phẩm được lấy mẫu: chế biến, thời gian sản xuất, dạng bao bì, điều kiện bảo quản

Tên nhà sx, nhà nhập khẩu

Ngày sx, ngày đóng gói, thời hạn sử dụng, số sx

Phương pháp lấy mẫu

Người lấy mẫu: tên, địa chỉ, điện thoại

PTN: tên, địa chỉ, điện thoại

Các chỉ tiêu phân tích

TIẾP NHẬN MẪU TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM

Ghi nhãn

Kiểm tra: nhãn trên mẫu có phù hợp số của hồ sơ mẫu

T0 mẫu, tgian mẫu đến: ghi trong hồ sơ mẫu

T 0 mẫu khi đến

Đo T0 = 1 phần mẫu hay 1 mẫu phụ xlý giống mẫu chính

Đk bao gói

Mẫu giữ ở bao bì gốc (tốt nhất) Nếu chuyển bao bì, mẫu giữ ở

túi vô trùng & bằng các vật liệu không ảnh hưởng tình trạng ban đầu của mẫu

- Mẫu lỏng: kiểm tra bình chứa (rò rĩ, nắp đậy kín, bị nứt

/thủng) có gây nhiễm bẩn vào mẫu

- Mẫu rắn: kiểm tra bao bì (tình trạng chân không- có khí bên

trong?, bị nứt/ lõm?), đk lý tính bên trong ( màu sắc, cơ cấu, mất chất lỏng)

Bao bì/ lớp bọc bị hư hỏng: ghi nhận, báo cáo phân tích

Bảo quản mẫu trước & sau khi phân tích

Với mẫu thực phẩm: sau khi lấy- bquản tách biệt nhau, giữ ở

T0 thấp nước đá),vận chuyển ngay về PTN Mẫu mau hư

hỏng: bảo quản đông, đặc biệt trữ dài hạn, giữ mẫu ở tủ đông (-20oC) Ko thể bquản đông, phân tích mẫu trong 36h giữ

Xử lý mẫu

Tiền xử lý mẫu theo phương pháp chuẩn:

• Rã đông thực phẩm đông lạnh: ở T0 tủ lạnh (40C) 18h Mẫu thực phẩm nhỏ: đặt nơi ổn định nhiệt (không >370C) 15’

• Đồng nhất mẫu cần duy trì t0 lạnh

• Khối lượng mẫu phân tích 10/ 25gram

• Mẫu thực phẩm hàm lượng muối cao, nồng độ muối dung dịch pha loãng phù hợp nồng độ muối trong mẫu

• Mẫu thưc phẩm hàm lượng đường cao: bổ sung đường

sucrose

Mẫu thực phẩm mau hỏng: bảo quản lạnh ngay sau lấy mẫu (T0 0-4oC) ở thùng nước đá, mẫu tránh tx trực tiếp với nước

đá

Mẫu dạng đông (block) không để tan đá trước khi đến PTN Mẫu khó hư hỏng: dùng bao, túi kín; T0 vận chuyển, bảo

quản không vượt 45oC

Mẫu kiểm nghiệm phải đạt các yêu cầu:

Dụng cụ chứa mẫu không rò rỉ, có nắp đậy kín, không bị

nứt /thủng gây nhiễm bẩn vào mẫu

Mẫu dạng hút chân không: không có khí bên trong

Mẫu dạng block hay mẫu nguyên con: còn nguyên vẹn

không bị biến dạng, giập nát

Mẫu nước: phân tích ngay sau khi thu Mẫu bảo quản lạnh

<10oC (>1h), vận chuyển tối đa 6h và bảo quản ở PTN tối

đa 2h

Thời gian, T0 bảo quản và vận chuyển ghi trong hồ sơ mẫu

Phương pháp kiểm nghiệm VSV sử dụng kỹ thuật truyền thống

• Ưu điểm: chi phí thấp (ko cần trang bị thiết bị hiện đại)

• Nhược điểm: tgian cho kquả chậm, ko đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm thực tế

Tiệt trùng không gian làm việc

Khử trùng dụng cụ như dao, kéo, nhíp, que cấy, que trải,…

Pha loãng

• Dung dịch pha loãng thường dùng

Nước muối sinh lý hoặc dung dịch peptone

• Thường pha loãng theo dãy thập phân

1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml

Tách ròng

Trữ vi khuẩn

• Trên môi trường đặc

• Trên môi trường loãng (BHI, TSB… + glycerol, 1:1)

• Trữ khô ở - 80oCA

Loại môi trường, chỉ tiêu sinh hoá dùng trong kiểm nghiệm vi sinh sp thuỷ sản

Phân loại môi trường

Hình Các loại môi trường theo trạng thái vật lý

Theo công dụng

• Môi trường tiền tăng sinh: giàu dinh dưỡng, ko có chất ức chế đặc hiệu tạo đk hầu hết các loại VSV ptriển

• Môi trường tăng sinh: có kn ức chế sự sinh trưởng 1 số nhóm VSV

nhưng tạo đk ptriển VSV khác

• Môi trường chung: ko chứa các chất ức chế, dùng phân lập hầu hết

các loại VSV (là mt lỏng hoặc mt đặc)

• Môi trường phân biệt (mt đặc trưng) (mt đặc): chứa các thành phần

thuận lợi cho sự phát hiện các giống hay loài VSV từ một mẻ cấy

thuần chủng hoặc hổn hợp

• Môi trường thử phản ứng sinh hoá: dùng để xđịnh 1 vài tính chất

sinh hoá các dòng VK được phân lập Yêu cầu phải sd dòng thuần,

nếu ko kquả dễ cho hiện tượng dương tính giả (kquả sai)

Những điều cần lưu ý trong sử dụng môi trường

• Phòng kiểm nghiệm: sd mt nhập khẩu có sẵn (dạng khan)

Ưu điểm: giảm đáng kể sự sai lệch giữa các lần pha chế mt

• Bảo quản: Mt khô bquản nơi khô thoáng,T0 (15 – 25oC), đậy kín (tránh bị hút ẩm do hơi nước trong ko khí), nếu

không mt xhiện hiện tượng: thay đổi pH, vón cục Lưu ý:

Ko dùng mt bị vón cục, quá hạn sd

• Pha chế: Nước pha mt khô là nước cất (các mt có hướng

dẫn lượng mt và lượng nước) Các mt nhạy cảm với T0 (ko

đun mt quá tgian cần thiết)

• Điều chỉnh pH: MT khô khi hoà tan, đun và khử trùng

đúng cách có pH phù hợp cho ptriển VSV 1 số trường hợp cần điều chỉnh pH phù hợp (sd NaOH / HCl)

Lưu ý: MT đặc, điều chỉnh pH khi T0 mt ở khoảng 45oC và dụng cụ đo pH có chế độ bù nhiệt MT lỏng đo pH ở T0

phòng

• Khử trùng môi trường: Thiết bị dùng khử trùng mt - nồi

hấp tiệt trùng (Autoclave), ở T0 (121oC) với tgian 15’ ko kể thời gian nâng nhiệt

Chỉ tiêu sinh hoá trong kiểm nghiệm vi sinh

a Nhuộm Gram

• 1884 Hans Christian Gram (nhà khoa học Đan mạch)

(1853 – 1938) phát hiện pp

• Dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào

▫ Vi khuẩn Gram dương: lớp peptidoglycan dầy 20 – 80 nm, chiếm 90% khối lượng

▫ Vi khuẩn Gram âm: lớp peptidoglycan dầy 7 - 8

nm, chiếm 10% khối lượng và có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài

Phương pháp nhuộm Gram

Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm

Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn

Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể nhuộm trong 1 phút

Rửa nước tối đa 5 giây

Thêm dung dịch Lugol (1% I, 2% KI) trong 1 phút

Rửa nước

Phủ lên mẫu với ethanol 95% hoặc hỗn hợp aceton:ethanol 95% 5:95

Rửa nước

Nhuộm tiếp với Sanfranin hoặc fuchsin 1 phút

Rửa nước và để khô

Kết quả: quan sát lame dưới KHV

▫ Vi khuẩn Gram dương: xanh đen hay tím

▫ Vi khuẩn Gram âm: đỏ vàng hay đỏ tía

Thử nghiệm khả năng lên men nguồn Carbohydrate

Loài VK khác nhau  khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau

Ví dụ

• Loài VSV lên men kỵ khí glucose

• Loài VSV sd glucose = con đường oxy hoá

• Loài VSV sd glucose = cả 2 pp

• Loài VSV ko có kn sd glucose

Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men 1 nguồn carbohydrate

đặc hiệu (có trong môi trường nuôi cấy) tạo acid (hay acid & sinh hơi) của VSV làm đổi màu chất chỉ thị

Các sp cùng đặc trưng trong lên men:

•Acid lactic

•Acid formic và acid acetic

•Acid lactic và ethanol

•Ethanol

Sd thuốc thử phenol red (pH 6.4 – 8)có màu vàng trong mt acid & màu đỏ trong mt kiềm

• H2O2 (hydro peroxide) (sp cuối mang tính oxh của quá trình biến

dưỡng đường kiểu hiếu khí) khi tích tụ nhiều  gây độc tế bào

• Men catalase có trong VSV hiếu khí/ kị khí tuỳ nghi (ngoại trừ

Streptococcus spp) Men catalase xtác pứng oxh - khử của 2 phân

tử hydro peroxide (H2O2)

• Trong pứng phân giải: 1 phân tử H2O2 hđộng như 1 cơ chất, 1

phân tử H2O2 hđộng như chất cho  cơ chất bị khử bởi nguyên

tử hydro chất cho => cơ chất bị khử và chất cho bị oxy hoá

• H2O2 + H – O – O – H catalase  2 H2O + O2

Thử nghiệm Catalase

Nguyên tắc: Xác định sự có mặt của enzyme catalase ở VSV

• Hoá chất sd là ddịch H2O2 30% (Superoxal) giữ lạnh trong chai sẫm màu, tránh ánh sáng (Do H2O2 rất dễ bị phân huỷ nên cần phải kiểm tra chất lượng của H2O2 trước sd)

• Ktra = các chủng VK (+) tính và (-) tính với pứng catalase /hoặc sd mt thạch máu & mt chocolate agar (hồng cầu đã

bị phân huỷ)

• PP thử pứng catalase của VSV: sd lame, cho trực tiếp ddịch

H2O2 vào ống nghiệm chứa VSV cần thử (VSV đã thuần) hoặc sd ống mao dẫn để thử kn phân giải H2O2 của VSV

Phương pháp thử

Phản ứng catalase dương tính

Thử nghiệm Citrate

Xác định khả năng sd citrate như 1 nguồn carbon duy I cho hđộng trao đổi chất của VSV

Hình 3 Phân tử Citric

Cơ sở sinh hóa: NL ccấp cho VSV trong mt

ko có nguồn ng liệu sd cho qt lên men hay tạo

sp lactic VSV sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất

Thử nghiệm Decarboxylase (LDC, ODC) và dehydrolase (ADH) của các a.amin

Nguyên tắc: Xác định khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các a.amin: lysine, ornithin

và arginine, qua đó làm kiềm mt nuôi cấy

Cơ sở sinh hóa: khử nhóm carboxyl(-COOH) của 1 a.amin để giải phóng các amin hay diamin & CO2

Mỗi loại men decarboxylase tác động lên 1 cơ chất

3 nhóm enzyme decarboxylase quan trọng thường sử dụng lysine, ornithin và arginine

 Là các enzyme cảm ứng

 Chúng chỉ được tổng hợp khi mt nuôi cấy có pH acid và có

cơ chất đặc hiệu

 Các sản phẩm của chúng làm môi trường chuyển sang kiềm

 Phản ứng tách carboxyl xãy ra điều kiện kị khí, là phản ứng không

thuận nghịch và cần coenzyme chung pyridoxal phosphate (vitamin B6)

Sử dụng chất chỉ thị Bromcresol purple (pH 5.2-6.8) hoặc cresol

red

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của VK có thể tạo Indol

trong mt canh trypton

Tryptophan là a.amin bị oxy hoá bởi VSV nhờ hệ thống

enzyme - tryptophanase tạo 3 sp biến dưỡng

 Indol

 Skatol (methyl indol)

 Indolacetic acid (IAA)

Sp trung gian: indolpyruvic acid (IPA)

▫ Tryptophan  IPA

▫ IPA (tách amin)  Indol

▫ IPA (tách carboxyl)  Skatol

Thuốc thử Kovac

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Hình Phản ứng Indol

Thử nghiệm Methyl red

sản phẩm acid bền trong môi trường từ quá trình lên men glucose

Sử dụng methyl red (4.4-6.2 đỏ sang vàng) làm chất chỉ thị để xác định nồng độ ion H+ hiện diện khi 1 VSV lên men glucose

Tất cả VK thuộc nhóm Enterobacteriaceae đều cho phản ứng

MR (+) tính sau 18 – 24 giờ ủ Sau khoảng thời gian (>48 giờ), VSV

MR (+) tính tiếp tục sinh các sản phẩm acid (acid lactic, sucsinic,

acetic và formic) làm giảm pH- vượt quá khả năng ổn định pH của

hệ dung dịch đệm và duy trì tính acid của môi trường (<=4,3)

Các VSV MR (-) tính sau lên men glucose làm acid hoá mt

ttục biến dưỡng các sp này bằng phản ứng tách carboxyl sinh các acetoin trung tính Sự giảm các sp acid và tăng các sp trung tính  đẩy pH mt tăng dần về hướng trung tính

Sự chính xác của phép thử MR phụ thuộc:

dưỡng glucose

pH và VSV MR (-) tăng tối đa pH mt

Hình Phản ứng Methyl red

Voges – Proskauer (VP)

Nguyên tắc: phát hiện khả năng tạo sản phẩm trung tính

là acetoin (acetylmethylcarbinol) của VSV trong quá trình lên men glucose

QT biến dưỡng: biến glucose thành a.pyruvic - chất trung

gian chủ yếu trong qt biến dưỡng glucose Từ chất này, VSV

có thể biến đổi theo nhiều con đường sinh hoá khác nhau

Sd thuốc thử là -naphtol

Hình Phản ứng VP

Nguyên tắc:

Xác định khả năng phân giải urea  2 phân tử ammonia + CO2

do tác động của enzyme urease và làm kiềm hoá môi trường của

VSV

• Cơ chất urea là một diamide của acid carbonic gọi là carbamide

• Enzyme đặc hiệu - urease xúc tác sự thuỷ phân urea  tạo 2

phân tử amonia

• Urease là enzyme quan trọng ở VSV liên quan đến sự phân giải các hợp chất hữu cơ

• Enzyme thuộc loại enzyme sẵn có do sự hình thành enzyme

không phụ thuộc có mặt của cơ chất urea

• Cơ sở của phản ứng: tạo các phân tử amonia trong pứng  làm

mt bị kiềm hoá và làm chuyển màu thuốc thử

• Sử dụng thuốc thử phenol red có vùng chuyển màu từ pH 6,8 – 8,4 màu chuyển từ vàng đỏ

Urease

Hình 7 Phản ứng Urea

Khả năng sinh H 2 S

Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh H2S từ hợp chất hữu cơ và

vô cơ chứa lưu huỳnh trong qt ptriển của VK tạo các vệt màu đen trên mt nuôi cấy

Sử dụng men - Cysteine desulfurase

Chất chỉ thị pứng là các muối sắt II hoặc sắt III

Pứng H2S với các muối này  tạo muối FeS kết tủa màu đen

Tính di động

Đánh giá khả năng di động của VSV

VSV chuyển động chủ yếu nhờ các tiên mao (ở VK hình que, 1 số

VK hình cầu) Vi khuẩn di động nhờ 1 hay nhiều tiên mao và vị trí các lông thay đổi tuỳ loài và đk nuôi cấy

1 số VSV có thể chuyển từ trạng thái di động sang trạng thái ko di động (do mất tiêm mao) nhưng đa số ko có khả năng ngược lại

Sử dụng môi trường thạch mềm (nồng độ agar 4 – 5 g/l)

T 0 là yếu tố rất quan trọng, VSV di động ở các T0 khác nhau

Cơ quan di động của VK có bản chất là protein, bị biến tính ở T 0

cao

Có xu hướng mất đi tính di động: VSV trữ tgian dài

VK ko di động ở 37 o C sau 48h cần được ủ tiếp ở T 0 21 – 25 o C

trong tgian 5 ngày để khẳng định kết quả Cần quan sát tính di

động ở các tế bào non <24 h nuôi cấy

Hình Khả năng di động của vi khuẩn trên môi trường thạch mềm

PHƯƠNG PHÁP MỚI TRONG KIỂM NGHIỆM VSV