Nghiên cứu bào chế và một số tác dụng sinh học của cao đặc hoàng cầm thang

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược HÀ NỘI • • NGÔ THỊ PHƯƠNG THÚY NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAo đ ặ c HỒNG CẦM THANG KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP DƯỢC s ĩ • • • Người hưóng dẫn: 1.TS Nguyễn Mạnh Tuyểỉẩ DS Ngô Văn Tuyên Nơi thực hiện: Bộ môn dược cổ truyền LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Mạnh Tuyển - người thầy tận tình dìu dắt hướng dẫn tói hồn thành tốt khóa luận nàv Đồng thời gửi lời cám ơn DS Ngơ Văn Tun - ln đóng góp bảo tơi có hướng đủng trình làm khóa luận Tôi xin chân thành cám ơn PGS TS Cao Văn Thu cảc anh chị kỹ thuật viên môn Vi sinh - Sinh học giúp đỡ trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cám ơn cảc anh chị kỹ thuật viên môn Dược học cổ truyền môn Dược lực tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tôi xỉn gửi tới thầy cô cán Trường đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành dìu dắt dạy bảo tơi suốt thời gian học tập trường Cuối xỉn bày tỏ lịng biết ơn vó hạn đến gia đình, người thân bạn bè ln bên tơi cô vũ, động viên, chỏ dựa tinh thẩn cho tơi trình học tập nghiên cứu Hà Nội ngày 17 thảng năm 2010 Ngô Thị Phương Thủy MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét thuốc Hoàng cầm thang 1.1.1 Công thức thuốc 1.1.2 Công thuốc 1.2 Các vị thuốc 1.3 Cao thuốc .12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết b ị 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Xác định tính dược liệu 19 3.2 Bào chế cao đặc Hoàng cầm thang 19 3.3 Nghiên cứu số tác dụng sinh học thuốc 22 3.3.1 Chuẩn bị chế phẩm thử 22 3.3.2 Tác dụng kháng khuẩn cao đặc Hoàng cầm thang 23 3.3.3 Tác dụng kháng nấm cao đặc Hoàng cầm thang 28 3.3.4 Tác dụng chống viêm cao đặc Hoàng cầm thang 30 3.3.5 Tác dụng tả cao đặc Hoàng cầm thang 32 3.4 Bàn luận 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 ĐẶT VẤN ĐÈ Từ xa xưa nhân dân ta biết sử dụng cỏ thiên nhiên thuốc y học cổ truyền để phục vụ sống cách hữu ích, đặc biệt việc phòng chữa bệnh Ngày y học đại phát triển mạnh mẽ, y học cổ truyền song song tồn ngày thể vai trị y học Tuy nhiên để thuốc y học cổ truyền sử dụng cách có hiệu phổ biến cần phải kiểm nghiệm, nghiên cứu chứng minh tác dụng chúng phương pháp khoa học, từ phát triển thuốc thành dạng bào chế tiện dụng, an toàn sử dụng rộng rãi thực tế Phương thuốc Hồng cầm thang có tác dụng nhiệt lỵ, hòa trung tiêu đau, phương thuốc tiêu biểu điều trị bệnh lỵ muôn đời, sử dụng để điều trị bệnh: tả, lỵ đại tràng thấp nhiệt, viêm đại ừàng mạn tính, chứng viêm nhiễm đường tiêu hóa, bệnh truyền nhiễm, phế nhiệt dẫn đến ho Để chứng minh tác dụng chữa bệnh nói trên, đồng thời góp phần đại hóa thuốc y học cổ truyền, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu bào chế số tác dụng sinh học cao đặc Hoàng cầm thang” Mục tiêu nghiên cứu bao gồm: Bào chế cao đặc Hoàng cầm thang Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm tác dụng tả cao đặc Hoàng cầm thang Chương TỔNG QUAN 1.1 Vài nét thuốc Hồng cầm thang 1.1.1 Cơng thức thuốc Bài thuốc Hồng cầm thang gồm có vị theo cơng thức sau: Hoàng cầm 18g Bạch thược 12g Cam thảo 6g Đại táo 12 [19] 1.1.2 Cơng thuốc Phương thuốc Hồng cầm thang có xuất sứ từ sách “Thương hàn luận”, điều 172 viết: “Hợp bệnh thái dương thiếu dương, tự hạ lỵ giả, Hồng cầm thang” Cơng thức: “Hồng cầm lượng, Thược dược lượng, Cam thảo (chích) lượng, Đại táo 12 quả” Cách dùng: “sắc vị với đấu nước, nấu thăng, bỏ bã, chia lần, uống lần thăng, ban ngày uống lần, ban đêm uống lần” Hoàng cầm thang có cơng nhiệt lỵ, hỗn cấp thống, phương thuốc để điều trị nhiệt tả, nhiệt lỵ, đồng thời có tác dụng nhiệt, táo thấp, giải độc, lương huyết hòa dinh, hịa hỗn chứng cấp, nên sách “Y phương tập giải” gọi phương thuốc “Vạn trị lỵ chi biểu phương”, nghĩa là: “Phương thuốc tiêu biểu điều trị bệnh lỵ mn đời” Trong phương, Hồng cầm đóng vai trị Qn dược, có vị đắng tính hàn, tác dụng lý nhiệt thiếu dương, dương minh, nhiệt táo thấp, giải độc trị lỵ Thược dược đóng vai trị Thần dược, vị chua đắng, tác dụng tả nhiệt, liễm âm hịa dinh, hỗn cấp thống Hoàng cầm phối hợp với Thược dược, toan khổ tương tế, điều trung tồn âm mà lỵ, đóng vai trò quan trọng điều trị nhiệt lỵ Cam thảo, đại táo điều trung hịa tỳ, ích khí tư dịch, cố hộ đóng vai trị Tá Sứ Các thuốc phối họp có tác dụng nhiệt lỵ, hịa trung thống Hồng cầm thang thường dùng trường họp nhiệt tả, nhiệt lỵ, biểu sốt, miệng khát, đau bụng ngoài, lưỡi đỏ rêu vàng, mạch sác [16] Trương Bân phân tích: “Hồng cầm thang, tức lấy Hồng cầm làm chủ, tính vị khổ hàn, nhập tràng vị đởm kinh mà nhiệt táo thấp, hạ lỵ Lấy Bạch thược làm trợ, tính vị toan khổ vi hàn, tác dụng tả can an tỳ khiến cho nhiệt mà hòa hoãn trung tiêu, liễm âm lỵ Đại táo làm tá, có tác dụng kiện tỳ ích khí mà thắng thủy thấp Cam thảo làm sứ, tác dụng hòa trung phù mà trị (cứu) lý nhiệt [17] Trên lâm sàng, Hoàng cầm thang gia giảm để điều trị bệnh thuộc nhiệt chứng tả, lỵ đại tràng thấp nhiệt, viêm đại tràng mạn tính, chứng viêm nhiễm đường tiêu hóa, bệnh truyền nhiễm, phế nhiệt dẫn đến ho [18] 1.2 Các vị thuốc thuốc 1.2.1 Hoàng cầm Hoàng cầm rễ phơi hay sấy khơ hồng cầm (Scutellaria baicalensis Geogri.), thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae) [2], [6], [11], [15] Hình Hồng Cầm - Phân bố: Trung Quốc, thí nghiệm di thực vào nước ta, mọc tốt vùng khí hậu mát (Sapa) chưa phát triển [11], [15] - Thành phẩn hóa học Chủ yếu baicalein, baicalin, wogonin (scutelarin) Ngồi cịn có nhiều tannin nhóm pyrocatechic (2-5%) nhựa Flavonoid: xác định 31 chất thuộc nhóm flavon flavanon gồm có: baicalin, baicalein, shogaol, gingerol, chrysin, oroxylin A, viscidulin, rivularin, apigenin, dihydrobaicalin, salvigenin, dihydrooroxylin scutelarein, A, boscutelarein, sculaflavon; 2, 3, eriodictyol, 5, 6, 7- pentahydroxyflavanon Glycosid: rễ cịn có 12 glycosid, wogonin 5-Ị3-D gỉucosid; 2(3 -hydroxy-4-methoxypheny l)-ethy 1-O-a-L-rhamnosy l-( 1—>3)-p-D-(4feruloyl) glucosid; chrysin-6-C-Ị3-D-glucosid-8-C-a-L-arabinosid; 6-C-a-Larabinosyl-8-C-P-D-glycosid-chrysin;baicalein-7-0-P-D-glucopyranosid; wogonosid; wogonin; 7-O-glycuronid; 1,2,3,4,6-penta-O-galoyl glucose; baicalein-7-O-glucosid; oroxylin-A-7-O-glucuronid; apigenin-7-O-glucuronid isoscutelarein-8-O-glucuronid [4], [11], [15] OH Ồ Wogonin D ,D_ Baicalin(R = goc acid) Baicalein - Tác dụng dược lý Tác dụng kháng khuẩn: hồng cầm có khả ức chế chủng vi khuẩn: Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio-cholerae (tả), Shigella (lỵ), Salmonella typhi (thương hàn), Crynebacterỉum dỉphterỉae (bạch hâu), E coỉi Tác dụng hạ nhiệt, chống viêm, chống dị ứng, tác dụng hạ huyết áp, làm giảm co thắt trơn ruột, lợi tiểu, an thần có tác dụng cầm máu Baicalin, baicalein wogorin ức chế tăng độ thấm mạch, làm giảm phù chặn phát triển thương tổn thứ phát viêm khớp chuột thực nghiệm [2], [11], [15] - Tỉnh vị: vị đắng, tính hàn [2], [6], [11], [15] - Quy kỉnh: vào kinh tâm, phế, can, đởm, đại tràng, tiểu tràng [2],[6] - Công chủ trị Thanh thấp nhiệt, trừ hỏa độc tạng phế: trị chứng phế ung, phế có mủ, viêm phổi, gây sốt cao trường hợp hàn nhiệt vãng lai (lúc sốt, lúc rét), trị ho phế nhiệt Lương huyết an thai: trường họp động thai chảy máu dùng hoàng cầm đen, phối hợp với ngải diệp, trữ ma Trừ thấp nhiệt vị tràng: dùng bệnh tả, lỵ, đau bụng, dùng phối hợp với hoàng liên Chỉ huyết: bệnh thổ huyết, chảy máu cam, đại tiếutiện máu, băng huyết bí tiểu tiện, dùng hoàng cầm đen Thanh can nhiệt: dùng chữa đau mắt đỏ [2] - Liều dừng: ngày uống - 9g, dạng thuốc sắc [6] - Kiêng kị: người tỳ vị hư hàn, khơng có thấp nhiệt, thực hỏa khơng nên dùng, phụ nữ có thai không động thai không dùng [2], [6] 7.2.2 Cam thảo Rễ phơi sấy khơ ba lồi cam (Glycyrrhiza thảo urciỉensis Gỉycyrrhta Fisch., inflata Bat., Glycyrrhiza gỉabra L.), (Fabaceae) họ Đậu [2], [6], Hình Cam thảo [11], [15] - Phân bố: nhiều noi giới Trung Quốc, Mông cổ, Liên Xô cũ, Hungari - Thành phần hóa học Saponin thuộc nhóm olean: Glycyrrhizin hàm lượng từ 10 - 14% dược liệu khô (tồn dạng muối Mg Ca acid glycyrrhizic); acid liquiritic, acid 18-a-hydroxy-glycyrrhetic, acid 24-ahyđroxyrrhetic, glabrolid, hydroxyisoglabrolid, acid desoxyglabrolid, isoglabrolid, 1l-desoxoglycyrrhetic, acid acid 24-a- 24-hydroxy-11- desoxogỉycyưhetic Flavonoid: quan trọng liquiritin, isoliquiritin, glabridin, glabron, glabren, lincochalcon A, lincochalcon B, quercetin-3-glucobiosid, galbranin, pinocembrin, prunetin Esotrogen steroid, coumarm (umbelliferon, hemiarin,liqcoumarin), 20 - 25% tinh bột, - 10% glucose saccharose [4], [7], [11], [15] H OH Acid glycuronic Acid glycuronic Glycyrrhiza ^ V o Liquiritin 0R o Isoliqiuritin - Tác dụng dược lý Tác dụng thần kinh trung ương: gây trấn tĩnh, ức chế thần kinh trung ương, giảm vận động tự nhiên, hạ thân nhiệt, giảm hơ hấp Tác dụng đường tiêu hóa: chữa loét đường tiêu hóa, ức chế tác dụng gây tăng tiết dịch vị histamine Tác dụng giống cortisone [15] Tác dụng giải độc: Na Glycyrrhizat có hiệu lực chống lại chất gây độc tim, đồng thời kích thích co bóp tim giống adrenalin Na K glycyrrhizat có tác dụng giải độc mạnh độc tố bạch hầu, chất độc nọc rắn, độc tố uốn ván, cocain hydroclorid cloral hydrat [15] Tác dụng giảm ho Tác dụng giảm co thắt trơn 28 Mau pha lỗng 16 lần cao đặc Hồng cầm thang có tác dụng kháng khuẩn yếu, cho tác dụng với vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus aureus Như thuốc Hồng cầm thang có tác dụng tốt vi khuẩn Gram (+) (4/5 vi khuẩn thử) vi khuẩn Gram (-) Ở mẫu pha lỗng lần cao đặc Hồng cầm thang cho tác dụng kháng khuẩn mạnh 3.3.3 Tác dụng kháng nấm cao đặc Hoàng cầm thang Tác dụng kháng vi sinh vật thử phương pháp khuếch tán, đo vịng vơ khuẩn thước panmer có độ xác 0,02mm đĩa thạch, thực môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà Nội a Giống vi sinh vật kiểm định: môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà Nội cung cấp: Candida albicans Aspergillus nỉger Mốc xanh (Botrylỉs cỉneca) Mốc xanh (Penicillin notatum) b Môi trường thử nghiệm - Môi trường Sabouraud lỏng nuôi cay Candida albicans: Pepton 1,0% Glucose 2,0% Nước cất vđ 100ml - Môi trường thử nghiệm Sabouraud đặc: Pepton 1,0% Glucose 2,0% Thạch 1,6% Nước cất vđ 100ml c Tiến hành 29 - Chuẩn bị mẫu thử: Mau thử dạng cao lỏng pha loãng với nồng độ khác từ cao đặc thuốc Hoàng cầm thang Mầu thử 1: pha lỗng lần cao đặc Hồng cầm thang Mầu thử 2: pha lỗng lần cao đặc Hồng cầm thang Mầu thử 3: pha lỗng lần cao đặc Hồng cầm thang Mau thử 4: pha loãng 16 lần cao đặc Hồng cầm thang - Các khoanh giấy lọc vơ trùng, sấy khô, tẩm lần với dung dịch mẫu thử, sau lần tẩm khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đem sấy nhiệt độ 60°c đến khô - Chuẩn bị môi trường vi sinh vật kiểm định: Nấm kiểm định (Candida albicans) nuôi cấy vào môi trường Sabouraud lỏng, nuôi cấy cho phát triển tủ ấm 29 - 30°c thời gian từ - đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra pha loãng dẫy dung dịch chuẩn) Các loại nấm khác cấy vào môi trường Sabouraud đặc vô trùng (tiệt trùng 121°C/20 phút), nuôi cấy tủ ấm 29 - 30°c thời gian từ - giờ, sau dùng dung dịch Tween 80 0,2% vô trùng lấy bào tử nấm Lắc môi trường thạch theo tỷ lệ 2,5ml (môi trường Sabouraud dịch huyền dịch đính bào tử)/100ml mơi trường kiểm định, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa để thạch đơng lại - Thử tính kháng nấm + Mỗi vi nấm làm đĩa petri + Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc tẩm chất thử xử lý đặt lên bề mặt môi trường thạch kiểm định chứa vi nấm kiểm định theo sơ đồ định sẵn 30 + Sau cấy, ủ đĩa petri có mẫu thử tủ ấm có nhiệt độ 29 - 30°c - giờ, sau lấy đọc kết quả, đo đường kính vịng vơ nấm có (thước kẹp panmer độ xác 0,02 mm) - Đánh giá kết quả: dựa đường kính vịng vơ nấm - Kết quả: Thử kháng nấm cao đặc Hoàng cầm thang với vi nấm thấy thuốc khơng có tác dụng kháng nấm với vi nấm 3.3.4 Tác dụng chống viêm cao đặc Hoàng cầm thang -Súc vật: chuột nhắt trắng trọng lượng 18-20g, giống đực, chia ngẫu nhiên thành lô, lô 10 Lô chứng : uống nước cất đồng thể tích Lơ đối chiếu : uống aspirin với liều 0,6g/kg/lần Lô thử : uống cao đặc liều 2,2g/kg/lần Lô thử : uống cao đặc liều 4,4g/kg/lần Lô thử : uống cao đặc liều 8,8g/kg/lần (Cao đặc Hoàng cầm thang aspirin pha nước để thể tích lần uống thuốc 2ml/100gTT) - Gây viêm xylen - Cách tiến hành: Cho chuột uống thuốc 12h/lần, liên tục lần, sau uống thuốc lần cuối lh, bôi 0,05ml xylen/con lên cảhai mặtcủa tai phảichuột, trái không bôi để đối chiếu Sau 2h, giết chuộtbằngcáchkéo cổ tai cắt tai chuột Dùng dụng cụ đục lỗ đường kính 8mm, đục lỗ hai bên tai chuột vị trí Cân tính giá trị chênh lệch hai bên tai chuột *) Kết quả: Đánh giá dựa mức độ phù tai chuột 31 Bảng Mức độ phù tai chuột ỉô thử (n=10) Thuốc thử Lô Liều thử (g/kgTT/lần X lần/ngày) Mức độ phù (%) ( x ± SD) Nước cât Aspirin ,6 94,99 ±21,62 67,93 ± 13,97 Liều thấp ,2 71,46 ± 13,08 Liều trung binh 4,4 60,67 ± 9,36 Liều cao 8,8 83,35 ± 24,43 ị p P2 -1 0,05 P5-2> 0,05 P5 - > 0,05 P > 0,05 > □ x% 140 120 '3 °- ‘O ' 100 80 »0 I 60 s 40 20 chứng aspirin liều thấp liều TB liều cao Hình Biếu đị mức độ phủ tai chuột lô thử Nhận xét: Kết thực nghiệm trình bày bảng biểu đồ hình cho thấy: 32 - Chênh lệch mức độ phù lô chuột biếu thị khả giảm phù thuốc: lô chuột uống aspirin, uống cao đặc Hoàng cầm thang với liều thấp /2 liều tương đương) liều trung bình (bằng liều tương đương) có tác dụng giảm phù tai rõ rệt so với lô chứng (P0,05) Nguyên nhân ở liều thử cao nồng độ dịch thử cao, hoạt chất tăng lên lượng tạp chất tăng gây cản trở trình hấp thu hoạt chất Sau giết chuột thuốc chưa hấp thu nhiều, nên tác dụng chống viêm thuốc giảm - Có khác dùng liều thấp liều trung bình Tác dụng chống viêm thuốc dùng liều thấp không cho kết tốt dùng liều trung bình (sự khác có ý nghĩa thống kê, p 0,05 □ từ 6h đến 24h