công nghệ enzym

Trường Cao Đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM Khoa Công nghệ Sinh học ************************** HIAST CÔ NG NG H Ệ E NZ YM E (Tài liệu lưu hành nội bộ) CBDG: ThS Lê Thanh Hải TPHCM, 03/2013 CÔNG NGHỆ ENZYME i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển công nghệ enzyme 1.2 Khái niệm enzyme 1.2.1 Bản chất sinh học enzyme 1.2.2 Bản chất hóa học enzyme 1.2.3 Cấu trúc enzyme 1.3 Cơ chế tác dụng enzyme 1.3.1 Cơ chế xúc tác enzyme 1.3.2 Năng lượng xúc tác 1.3.3 Sự tạo thành phức hợp enzyme – chất 1.3.4 Động học phản ứng enzyme 1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 10 1.3.5.1 Nhiệt độ 10 1.3.5.2 pH 11 1.3.5.3 Chất kìm hãm 11 1.3.5.4 Chất hoạt hóa 12 1.3.6 1.4 Phân loại enzyme 13 1.4.1 Danh pháp quốc tế enzyme 13 1.4.2 Phân loại enzyme 14 1.5 1.4.2.1 Oxydoreductase 14 1.4.2.2 Transpherase 14 1.4.2.3 Hydrolase 15 1.4.2.4 Lipase 15 1.4.2.5 Isomerase 15 1.4.2.6 Ligase 15 Phương pháp tách làm enzyme 15 1.5.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 15 1.5.2 Phương pháp gây biến tính chọn lọc 16 1.6 Tính chất đặc hiệu enzyme 13 Phương pháp xác định khả xúc tác enzyme 17 1.6.1 Các nhóm phương pháp xác định khả xúc tác E 17 1.6.2 Đơn vị hoạt độ 17 KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME 18 2.1 Ý nghĩa kỹ thuật tinh công nghệ enzyme 18 CÔNG NGHỆ ENZYME 2.2 Các phương pháp học tách enzyme 19 2.2.2 Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật 19 2.2.2.1 Phá vỡ tế bào phương pháp học: 20 2.2.2.2 Phá vỡ tế bào phương pháp học: 20 2.2.2.3 Các phương pháp cô đặc 21 2.2.2.4 Các phương pháp tinh enzyme 21 2.2.2.5 Tạo sản phẩm enzyme 21 ENZYME CỐ ĐỊNH 22 Chuyển hóa sinh học 22 3.1.1 Chuyển hóa vật chất enzyme tự hay enzyme hịa tan 22 3.1.2 Chuyển hóa vật chất enzyme khơng hịa tan 22 3.1.3 Chuyển hóa vật chất trình lên men 23 3.1.4 Chuyển hóa vật chất tế bào cố định 23 3.2 Đặc điểm enzyme cố định 23 3.3 Phương pháp tạo enzyme cố định 23 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định 23 3.3.2 Phương pháp cố định enzyme 25 3.4 Kỹ thuật 19 2.2.1 3.1 ii 3.3.2.1 Chất mang dùng để cố định enzyme 25 3.3.2.2 Phương pháp cố định enzyme 25 Ứng dụng enzyme cố định 26 3.4.1 Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase 27 3.4.2 Sản xuất Ltamino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định 28 THU NHẬN ENZYME 28 4.1 Chọn nguồn nguyên liệu 28 4.2 Thu nhận enzyme 31 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 32 5.1 Tình hình ứng dụng enzyme công nghiệp giới 32 5.2 Ứng dụng y học 34 5.3 Ứng dụng hóa học 34 5.4 Ứng dụng công nghiệp 34 5.4.1 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 34 5.4.2 Ứng dụng công nghiệp dệt 36 5.4.3 Ứng dụng công nghiệp thuộc da 36 5.5 Ứng dụng nông nghiệp 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 CÔNG NGHỆ ENZYME 1 MỞ ĐẦU 1.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển công nghệ enzyme Enzyme học môn học nghiên cứu vật chất phân tử có hoạt tính sinh học Mơn học phát triển mạnh nhờ thành tựu mơn hóa sinh học, vi sinh vật học, di truyền học tiến ngành hóa học vật lý học Bảng 1.1 Những cột mốc quan trọng nghiên cứu phát triển môn enzyme học[2] STT Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển 1833 Payen Persoz tách diastase từ malt 1874 Hansen người tách rennet từ bao tử cừu 1876 Kiihne người đề nghị gọi chất xúc tác sinh học enzyme 1897 Hai anh em nhà Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men chuyển hóa đường glucose thành cồn CO2 1900 Rohm sử dụng enzyme protease công nghệ thuộc da 1913 Rohm người sử dụng enzyme chất tẩy rửa 1917 Boidin Effront nghiên cứu αtamylase B.subtilis ứng dụng ngành dệt 1920 – 1928 Will Slitter tinh enyzme 1926 10 1928 Fleming phát penicilline 11 Thế chiến II Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo mơ hình cơng nghiệp, sử dụng amyloglucosidase đường hóa tinh bột Sử dụng penicillineacylase sản xuất penicilline 12 1969 Tanabec co xây dựng quy trình cơng nghiệp sản xuất amino acid Sử dụng glucose isomerase sản xuất dịch đường giàu fructose Samner kết tinh enyme urease Northrop kết tinh protease CÔNG NGHỆ ENZYME Boyer et al đưa kỹ thuật di truyền Kỹ thuật có tác động tích cực cơng nghệ enzyme 13 1972 14 1973 15 1984 Nito xác lập trình tạo acrylamide loại q trình sản xuất có tham gia enzyme 16 1984 t Đã phát hàng trăm loại enzyme khác nhau, đưa vào sản xuất công nghiệp ứng dụng rộng rãi enzyme sản xuất đời sống kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đưa công nghệ enzyme đạt nhiều kết cao Tanobe co sản xuất aspartic acid lên men cố định tế bào Winter Ferch đưa công nghệ sản xuất protein Diastase: enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose Diastase enzyme phát Nó chiết tách từ malt vào năm 1833 Anselme Payen JeantFrancois Persoz – nhà Hóa học nhà máy đường Pháp Tên “diastase” xuất phát từ tiếng Hy Lạp (diastasis), dịch nha nóng, enzyme thủy phân tinh bột hạt đại mạch thành đường hòa tan tách phần bỏ malt với phần lại hạt Ngày nay, diastase α, β γtamylase Rennet enzyme sản xuất dày động vật có vú cịn giai đoạn bú sữa mẹ thường sử dụng để làm phomai Rennet hỗn hợp enzyme, bao gồm: enzyme thủy phân protein (protease) gây đông tụ sữa, tách phần sữa đơng (phần chất rắn) phần huyết sữa (phần chất lỏng) Những enzyme hoạt động dày bê gọi chymosin rennin Ngồi ra, có enzyme quan trọng khác như: pepsin lipase Protease: (còn gọi peptidase proteinase) enzyme thủy phân protein α amylase enzyme thủy phân liên kết alpha phân tử polysaccharide tinh bột glycogen thành glucose maltose Alpha amylase tìm thấy chủ yếu người động vật có vú khác, ngồi ra, chúng cịn có mặt loại hạt có chứa tinh bột tiết số loại nấm Urease: enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ure thành carbon dioxide (CO2) amoniac (NH3), diện vi khuẩn đường ruột Urease tìm thấy vi khuẩn, nấm men thực vật 1.2 Khái niệm enzyme Sinh vật phân nhóm dựa vào cấu tạo thể chúng: sinh vật đơn bào sinh vật đa bào Mặc dù chúng có khác biệt lớn cấu tạo thể đặc điểm sinh lý khác chúng giống trao đổi chất với mơi trường bên ngồi số đặc điểm biến dị di truyền Sinh vật xem hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến trình trao đổi chất thể tế bào tế bào với mơi trường ngồi Q trình trao đổi chất bên tế bào tế bào với môi trường bên biểu sinh động sống Sự khác tế bào sống vật chất khơng phải sống khả trao đổi chất Khi thể khơng cịn khả trao đổi chất thể chết Do mối quan hệ giữ thể với bên ngồi mối quan hệ hữu Quá trình trao đổi chất bao gồm q trình dị hóa q trình đồng hóa Q trình dị hóa q trình phân giải vật chất để cung cấp cho tế bào lượng vật liệu xây dựng tế bào, trình xảy tế bào ngồi tế bào Q trình di hóa xảy tế bào trình cung cấp lượng, vật chất cho trình tổng hợp vật chất để tạo sinh khối nhằm làm đổi vật chất tế bào Q trình dị hóa ngồi tế bào phần lớn đáp ứng cầu vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp chất tế bào Năng lượng tạo từ q trình dị hóa ngồi tế bào thường giải phóng dạng nhiệt CƠNG NGHỆ ENZYME Quá trình tổng hợp vật chấtt cho ttế bào xảy tế bào Quá trình thư ường phải thu nhận lượng từ phản ứng q trình dị hóa Như vậy, q trình trao đổi chất đượcc xem x hệ thống mở sinh vật môi trường ng xung quanh Hình 1.1 Hệ thống mở tế bào sinh vật Sản phẩm trình trao đổii ch chất tạo dạng sản phẩm: Sản phẩm bậc Sản phẩm bậc m đư tạo trình phân giải tron trình tổng hợp Sản phẩm bậc 1: sản phẩm Các sản phẩm đượcc tham gia trực tiếp nên vật chất tế bào tham gia các trình tế bào Sản phẩm bậc 2: sản phẩm m ccũng tạo từ trình tổng hợp trình t phân giải tế bào Trong trình tổng hợp, p, m số vật chất tạo không tham gia vào trình tr trao đổi chất mà thoát khỏi tế bào Hi Hiện tượng coi trình sinh tổng ng hợp h thừa Hiện tượng sinh tổng hợp thừa có liên quan ch chặt chẽ đến hệ di truyền có tế bào Do đó, việc v điều chỉnh hệ di truyền, nhiều điều chỉnh hệ gen thu lượng lớn sản phẩm sinh tổng ng hợp h thừa Môi số vật chất tạo trình phân ggiải khơng tham gia vào q trình trao đổii chất ch nằm ngồi tế bào (q trình dị hóa ngồi tế bào) M Một số vật chất khác khỏi tế bào o vào mơi trường tr (q trình trình dị hóa tế bào) Q trình trao đổi chất liên tụcc đư xảy tế bào, tạo nên biến đổi liên tục vật chất thiên nhiên Quá trình chu chuyển hóa theo đường sinh vật đóng vai trò ò r quan trọng nhiều chu trình chuyển hóa ch chất có thiên nhiên Các phản ứng sinh họ ọc xảy thường xuyên không tế bào sinh vậtt mà ngồi mơi trường, bao quanh tế bào Các Cá phản ứng sinh học xúc tác loạii protei protein đặc biệt gọi enzyme Các enzymee tham gia c phản ứng tế bào gọi enzyme ngoạii bào C Các enzyme thực tế bào gọii enzyme enzym nội bào Cả enzyme nội bào enzyne ngoại bào đềuu đư tổng hợp tế bào 1.2.1 Bản chất sinh học củaa enzy enzyme Nhiều nhà khoa học nghiên ứu enzyme đến thống nhất: enzyme zyme m loại protein sinh vật sống tổng hợp nên tham gia vào phản ứng sinh học Như vậy, chất sinh học củaa enzy enzyme sản phẩm trình sinh họcc thực th phản ứng sinh hóa tế bào sinh vvật Các loại enzyme có đặcc tính chung sau: Enzyme tạo tếế bào sinh vật: trình tổng hợp enzyme mộtt qu trình phức tạp điều khiển, kiểm m soá soát chặt chẽ Enzyme tham gia phản ứng ng ccả tế bào sống enzyme tách khỏi kh tế bào sống Enzyme tham gia phản ứng ng tro điều kiện nhiệt độ ơn hịa Vì trình trì sống tế bào, enzyme tổng hợpp ho hoạt động điều kiện nhiệt độ tế bào nhiệt nhi độ thể Nhiệt độ thể tế bào sin sinh vật thường nhiệt độ thấp Phần lớn nhiệtt độ đ thể sinh vật dao động khoảng 30 t 40oC CƠNG NGHỆ ENZYME Enzyme tham gia xúc tác phản ứng thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hồn tồn lượng dự trữ hợp chất hóa học Q trình chuyển hóa thực theo chuỗi phản ứng, phản ứng xúc tác loại enzyme Các enzyme thay xúc tác để phản ứng xảy ra, để cuối tạo thành CO2, H2O, số chất khác giải phóng lượng Cũng chuỗi phản ứng tạo thành chu kỳ chuyển hóa khép kín Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm phản ứng trước chất cho phản ứng sau Enzyme thực phản ứng: Các phản ứng thường xảy tế bào (khi ta thực chúng ống nghiệm) Trong tế bào thường không xảy phản ứng enzyme đơn (một phản ứng) mà thường xảy phản ứng theo chuỗi phản ứng Phản ứng enzyme phản ứng tiêu hao lượng Trong đó, phản ứng hóa học xúc tác vởi chất xúc tác hóa học địi hỏi lượng lớn Nhờ có hoạt động xúc tác enzyme, phản ứng sinh hóa xảy liên tục điều kiện lượng ôn hòa Enzyme chịu điều khiển gen điều kiện phản ứng Gen định tổng hợp loại enzyme Mỗi enzyme định phản ứng sinh hóa Các nhà khoa học đưa chế sau: Một gen => enzyme => phản ứng Như vậy, gen định chất sinh học chất hóa học enzyme Cơ chế có ý nghĩa lớn việc điều khiển tổng hợp enzyme tế bào sinh vật 1.2.2 Bản chất hóa học enzyme Nếu tách enzyme khỏi tế bào tiến hành phân tách thành phần hóa học chúng, ta thấy chúng thuộc nhóm: Nhóm enzyme đơn cấu tử: Thuộc nhóm bao gồm enzyme cấu tạo thành phần hóa học protein Những enzyme tạo thành từ protein gọi enzyme đơn cấu tử Nhóm enzyme đa cấu tử Thuộc nhóm bao gồm enzyme có thành phần: Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein Agon: Phần thứ thành phần protein Phần thường chất hữu đặc hiệu có vai trị thúc đẩy trình xúc tác Ở enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trị xúc tác thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu có đặc hiệu) enzyme khơng thể hoạt động Chính thế, chất hữu đặc hiệu gọi chất cộng tác (cofactor) Các chất hữu đặc hiệu gắn chặt với phần protein, gắn lỏng với phần protein Ta dễ dàng tách chúng tiến hành thẩm tích qua màng Ở xảy tượng: Những chất hữu đặc hiệu gắn chặt với protein liên kết đồng hóa trị gọi nhóm phụ (prosthetic) Những chất hữu đặc hiệu gắn không chặt với protein dễ dàng tách chúng khỏi protein gọi coenzyme Tuy nhiên, phân biệt mang tính chất tương đối Ngồi nhà khoa học cho thấy, thành phần enzyme có diện số kim loại Các kim loại thường thành phần chất hữu đặc hiệu Ví dụ: hệ enzyme cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân porphyrin Các kim loại có thành phần enzyme thường dễ tách khỏi enzyme Trong trường hợp enzyme kim loại, chúng hoạt tính Khi ta đưa kim loại tương ứng vào enzyme, hoạt tính enzyme lại khơi phục Tính chất mang tính chất thuận nghịch Vai trị kim loại hoạt động enzyme chưa làm sáng tỏ Tuy nhiên nhà khoa học cho rằng, kim loại đóng vai trị liên kết enzyme chất, liên kết apoenzyme coenzyme, tham gia trực tiếp vào trình vận chuyển điện tử vai trò sắt cytochrome peroxydase CÔNG NGHỆ ENZYME Bảng 1.2 Một số enzyme có chứa kim loại [2] STT 1.2.3 Enzyme Kim loại Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe) Polyphenoloxydase Đồng (Cu) Carbonic anhydrase Kẽm (Zn) Peptidase Mangan (Mn), Sắt (Fe), Magie (Mg) Phosphatase Magie (Mg) Arginase Mangan (Mn) Cấu trúc enzyme Enzyme protein đặc biệt Ngoài cấu trúc giống cấu trúc bình thường protein, enzyme cịn có cấu trúc đặc biệt liên quan đến hoạt động enzyme Khơng phải tồn phần enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác, mà có phận đặc biệt mang tính đặc hiệu phân tử protein tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc hiệu gọi trung tâm hoạt động enzyme Trung tâm hoạt động enzyme bao gồm: Những nhóm hóa học, liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với chất Những nhóm hóa học, liên kết peptide khơng tiếp xúc trực tiếp với chất có chức trực tiếp q trình xúc tác Phần cịn lại đóng vai trị khung, giữ cho cấu trúc khơng gian thích hợp với khả xúc tác Nếu bị tác động điều kiện bên nhiệt độ, pH, nồng độ chất, khung biến đổi cấu trúc khơng gian Từ làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme Phần phân tử enzyme khơng có liên quan đến hoạt tính enzyme, bị tác động, bị bị biến đổi hồn tồn khơng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Trung tâm hoạt động enzyme thường chứa amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan Các nhóm hóa học hoạt động có khả gắn với chất để tạo thành phức chất enzyme t chất Những nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm: Nhóm NH2 lysine Nhóm tSH cysteine Nhóm γtcarboxyl glutamic acid Các gốc amino acid tạo trung tâm hoạt động enzyme thường không nằm cạnh chuỗi polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1) Trong thực tế, chuỗi popypeptide enzyme tồn trạng thái không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên amino acid thường tồn gần theo cấu trúc không gian Do cấu trúc không gian vậy, trung tâm hoạt động tạo thành Trong trung tâm hoạt động enzyme người ta thấy có ion kim loại Các ion kim loại có mặt trung tâm hoạt động enyzme có vai trị xúc tác lớn Ngồi gốc amino acid, ion kim loại, nhà khoa học cho thấy nhóm chức coenzyme coi phần cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme CƠNG NGHỆ ENZYME Mỗi enzyme thường có trung tâm hoạt động Tuy nhiên có enzyme có trung tâm hoạt động (alcohol hydrogenase gan), chí có enzyme có tới trung tâm hoạt động (alcohol dehydrogenase nấm men) Hoạt động xúc tác trung tâm hoạt động có liên quan tới chất Các nhà khoa học nghiên cứu vấn đề đưa quan điểm quan trọng: Chỉ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với trung tâm hoạt động enzyme để tạo thành phức hợp enzyme chất Theo quan điểm này, chất có cấu trúc phân tử trùng với trung tâm hoạt động tượng kết hợp chặt chẽ mang tính đặc hiệu cao Chính thế, loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng cho loại chất định Các loại enzyme thường tạo trung tâm hoạt động có cấu trúc khơng gian định Các trung tâm hoạt động thường hình thành sẵn enzyme Chính trung tâm hoạt động enzyme định cho phép chất cấu trúc tương ứng với trung tâm hoạt động kết hợp vào Quan điểm Fisher đề xướng Thuyết Fisher giải thích tượng gắn kết chất trung tâm hoạt động enzyme nhiều kết thực nghiệm, thuyết chưa giải thích trọn vẹn Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt Koshland nhiều nhà khoa học chấp nhận Theo thuyết này, nhóm chức trung tâm hoạt động enzyme tự chưa tham gia xúc tác Chính chất tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc khơng gian trung tâm hoạt động enzyme Chính tác động cảm ứng chất làm cho gốc amino acid, nhóm chức trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng cách thích hợp, xác để gắn chất vào trung tâm hoạt động thực trình xúc tác Như vây, Koshland cho trung tâm hoạt động enzyme tạo thành có tác động cảm ứng chất Chính chế mềm dẻo trung tâm hoạt động giải thích cạnh tranh chất chất chất lại có cấu trúc khơng gian giống chất Khi đó, chất giống chất chiếm chỗ trung tâm hoạt động enzyme phản ứng chất khơng xảy Hình 1.2 Mơ hình Fisher giải thích chế tác động enzyme với chất CÔNG NGHỆ ENZYME 22 ENZYME CỐ ĐỊNH 3.1 Chuyển hóa sinh học Q trình chuyển hóa sinh học trình vật chất tự nhiên sinh vật chuyển từ dạng sang dạng khác thông qua hoạt động sống tế bào Hoạt động sống tế bào trình trao đổi chất bên ngồi bên tế bào thơng qua hoạt động enzyme tế bào Nhờ hoạt động xúc tác enzyme tạo cho tế bào sinh vật thể sinh vật hệ thống mở Ở lượng chứa vật chất ln ln biến đổi, luôn trao đổi bên bên ngồi thể Tồn chuyển hóa sinh học thực trình sau: Quá trình hoạt động enzyme ngoại bào (enzyme tự do) Quá trình hoạt động vi sinh vật trình lên men Quá trình hoạt động tế bào cố định Q trình chuyển hóa enzyme cố định 3.1.1 Chuyển hóa vật chất enzyme tự hay enzyme hòa tan Enzyme tự hay enzyme tách khỏi tế bào, chúng có khả hịa tan môi trường nước thực phản ứng ngồi tế bào sinh vật Những enzyme cịn gọi enzyme ngoại bào Các enzyme đóng vai trị quan trọng chuyển hóa vật chất thiên nhiên sản xuất đời sống Tuy nhiên, sử dụng enzyme này, nhà khoa học cho thấy chúng có nhược điểm sau: Trong trình tham gia phản ứng, loại enzyme thường lẫn vào sản phẩm Việc tách sản phẩm cuối khỏi enzyme hòa tan cơng việc khó khăn địi hỏi chi phí khơng nhỏ Nhiều sản phẩm q trình thủy phân địi hỏi khơng chứa tạp chất thành phần khác enzyme Ví dụ sản xuất glucose sử dụng y học phải tuyệt đối phương diện hóa học sinh học Sau phản ứng, tách enzyme khỏi phản ứng để thực phản ứng tiếp theo, enzyme khơng giữ hoạt tính hoạt tính ban đầu, việc tái sử dụng enzyme khơng có hiệu quả, nhiều trường hợp enzyme khơng sử dụng Các enzyme hịa tan thường bền nhiệt, acid, kiềm, dung môi hữu hay số ion kim loại nặng Do đó, việc sử dụng biện pháp bảo vệ chúng phản ứng điều cần thiết 3.1.2 Chuyển hóa vật chất enzyme khơng hịa tan Enzyme khơng hịa tan hay enzyme cố định hiểu theo nghĩa hẹp nghĩa rộng Theo nghĩa hẹp: enzyme khơng hịa tan enzyme đưa vào pha riêng rẽ, pha tách riêng với pha dung dịch tự Pha enzyme khơng hịa tan nước gắn với polimer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn Theo nghĩa rộng: chất xúc tác cố định enzyme, tế bào trạng thái sống trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng enzyme khơng hịa tan bao gồm enzyme cố định vào chất mang, bao gồm enzyme có thể sống cố định bình phản ứng sinh học có gắn kết chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần Enzyme khơng hịa tan hay cịn gọi enzyme cố định thường enzyme hòa tan gắn vào chất mang nhiều kỹ thuật khác Nhờ trình mà enzyme từ trạng thái hịa tan chuyển sang dạng khơng hịa tan chuyển từ trạng thái hịa tan sang trạng thái khơng hịa tan, enzyme khơng hịa tan có ưu điểm sau: Enzyme khơng hịa tan sử dụng nhiều lần, hoạt tính enzyme khơng hịa tan bị thay đổi lần tái sử dụng Đặc điểm enzyme khơng hịa tan có ý nghĩa lớn kỹ thuật, nhờ ta tái sử dụng nhiều lần làm giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme Đây ưu điểm lớn việc thu nhận ứng dụng enzyme khơng hịa tan Enzyme khơng hịa tan khơng lẫn vào sản phẩm cuối phản ứng enzyme, khơng phí cho việc tách enzyme khỏi sản phẩm Sản phẩm cuối thu coi sản phẩm tương đối CÔNG NGHỆ ENZYME 23 Từ đặc điểm cho thấy sử dụng enzyme khơng hịa tan có ý nghĩa kinh tế sử dụng enzyme hịa tan nhiều lần 3.1.3 Chuyển hóa vật chất trình lên men Quá trình lên men trình chuyển hóa sinh học thực tế bào vi sinh vật sống tự Lên men q trình chuyển hóa vật chất đặc trưng cho riêng vi sinh vật Các trình lên men tập hợp nhiều q trình enzyme Ở đó, toàn phản ứng xảy tế bào theo trật tự định hệ thống gen có nucleic acid Khác với enzyme ngồi tế bào, trình lên men thường xảy phức tạp hơn, chất tế bào phải thẩm thấu vào tế bào Tại tạo sản phẩm bậc (sinh khối), sản phẩm bậc hai (sản phẩm trao đổi chất) Quá trình tạo sản phẩm thực tế bào sống Nếu tế bào chết trình chuyển hóa lại mang ý nghĩa khác Đó trình thủy phân enzyme ngoại bào Quá trình chuyển hóa sinh học xảy thường xuyên, liên tục thiên nhiên loài người ứng dụng vào sản xuất hàng ngàn năm sản xuất rượu, bia, nước giải khát, phomai, tương, chao, nước mắm phát triển mạnh công nghệ lên men đại amino acid, kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng 3.1.4 Chuyển hóa vật chất tế bào cố định Tế bào cố định tế bào vi sinh vật gắn vào chất mang Các chất mang vi sinh vật gắn vào đưa vào bình phản ứng sinh học (bioreactor) Cơ chất đưa vào từ đỉnh bình phản ứng sinh học sản phẩm lấy đáy bình phản ứng sinh học Quá trình thực liên tục Tế bào cố định ứng dụng rộng rãi, đem lại hiệu kinh tế rõ rệt 3.2 Đặc điểm enzyme cố định Khi gắn enzyme hịa tan vào số chất mang, enzyme có đặc điểm khác hẳn enzyme hịa tan Hoạt tính enzyme khơng hịa tan thường nhỏ hoạt tính riêng enzyme hịa tan loại Sở dĩ có thay đổi hoạt tính riêng enzyme khơng hòa tan nguyên nhân sau: a) Do ảnh hưởng điện tích chất mang Khi gắn enzyme vào chất mang có điện tích khác với điện tích enzyme, cấu trúc khơng gian enzyme có thay đổi mức độ định Vì thay đổi cấu trúc không gian enzyme nên tương tác enzyme chất chậm lại, phản ứng xảy yếu Mức độ giảm hoạt tính enzyme phụ thuộc vào mức độ thay đổi cấu trúc không gian enzyme ta gắn chúng vào chất mang b) Do enzyme bị nhốt vào gel Khi ta nhốt enzyme vào gel đó, gel bao lấy phân tử enzyme tạo thành vật cản chất enzyme Do đó, tiếp xúc trung tâm hoạt động enzyme với chất gặp khó khăn so với tiếp xúc chất với enzyme tự Enzyme khơng hịa tan hồn tồn tn theo định luật Michaelis – menten Tuy nhiên, phản ứng chất với enzyme khong hịa tan có sai khác định: a) Có thể xảy tượng cạnh tranh chất với enzyme chất mang b) Hiện tượng cản trở khuếch tán chất sản phẩm phản ứng làm giảm giảm tốc độ phản ứng Enzyme khơng hịa tan có tính bền nhiệt enzyme hịa tan loại chúng bảo vệ chất mang Enzyme khơng hịa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm acid so với pH tối ưu enzyme hịa tan khơng trùng với pH tối ưu enzyme hòa tan loại Enzyme khơng hịa tan có khả bảo quản tốt enzyme hịa tan loại Ta tái sử dụng enzyme khơng hịa tan nhiều lần Trong enzyme hịa tan sử dụng lần Đặc điềm có ý nghĩa kinh tế ta tiến hành phản ứng theo quy mô công nghiệp 3.3 Phương pháp tạo enzyme cố định 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn phạm vi môi trường xác định, cấu tạo khơng gian phân tử bị thay đổi, làm biến đổi số tính chất enzyme ban đầu (enzyme hịa tan) CƠNG NGHỆ ENZYME 24 Enzyme thay đổi pH, nhiệt độ hoạt động, giá trị số Michaelis – menten tính chất đặc hiệu, nhiên thay đổi phụ thuộc nhiều vào chất hóa học chất mang Nói chung enzyme cố định thường bền với tác nhân biến tính hơn, hoạt độ riêng thường thấp enzyme hòa tan Một nguyên nhân làm giảm hoạt tính enzyme cố định tương tác protein – protein phân tử enzyme liên kết Trong trường hợp thấy hoạt độ riêng chế phẩm bị giảm với tăng lượng enzyme kết hợp vào đơn vị trọng lượng chất mang Nhìn chung, enzyme cố định giữ tính đặc hiệu Thêm vào đó, nhờ liên kết với chất mang mà chúng có độ bền vững lớn tác động khác a) Hoạt tính enzyme khơng tan phụ thuộc vào chất tính chất hóa học chất mang Các tính chất lý học chất mang tính hịa tan, tính bền vững học, độ trương, điện tích, tính háo nước kị nước… có ảnh hưởng định đến lượng enzyme liên kết, tính bền hoạt tính sinh học dẫn xuất enzyme cố định Bản chất hóa học chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến khả tạo thành dẫn xuất enzyme, tới khả chất mang hấp phụ không đặc trưng chất từ môi trường phản ứng Dẫn xuất enzyme khơng tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan kết định vị enzyme tạo nên Chất mang có tác dụng hạn chế biến tính enzyme dung mơi có khả làm đứt mối liên kết hydrogen liên kết kị nước Khi enzyme giới hạn phạm vi môi trường xác định, xảy nhiều kiểu tương tác khác chất mang polymer lên môi trường vi mô bao xung quanh phân tử enzyme cố định Thứ nhất: polymer nhờ vào tính chất lý hóa học đặc trưng kéo tới bề mặt enzyme (hoặc đẩy khỏi enzyme) chất, sản phẩm phản ứng phân tử khác, điều làm tăng (hay giảm) nồng độ chất môi trường vi mô sát enzyme Thứ hai: thân chất mang polymer ngăn cản khuếch tán tự phân tử theo hướng tới enzyme khỏi enzyme, từ ảnh hưởng đến hiệu xúc tác enzyme b) Hoạt tính enzyme không tan phụ thuộc vào khuếch tán chất, sản phẩm phân tử khác Tốc độ khuếch tán chất, sản phẩm chất khác phụ thuộc vào yếu tố: Kích thước lỗ gel chất mang polymer Trọng lượng phân tử chất Sự chênh lệch nồng độ vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme dung dịch tự Những hạn chế mặt khuếch tán có ý nghĩa đáng kể q trình sử dụng hệ thống enzyme cố định Đường kính lỗ chất mang polymer trọng lượng phân tử chất đóng vai trị hàng đầu Song hạn chế khuếch tán khơng đơn giản cịn có khác biệt nồng độ vùng mơi trường xung quanh enzyme dung dịch tự Hoạt tính xúc tác enzyme dẫn tới thay đổi nồng độ chất sản phẩm phản ứng vùng môi trường vi mô xung enzyme Điều làm xuất gradient nồng độ chất sản phẩm dung dịch chất mang chứa enzyme cố định Sự xuất gradient nồng độ nói giải thích tốc độ khuếch tán thấp phân tử gel hoạt tính xúc tác cao enzyme Những giới hạn khuếch tán thể hai dạng: hàng rào khuếch tán bên bên Rào khuếch tán bên xuất có tồn lớp mỏng dung môi không pha trộn bao xung quanh hạt polymer Các chất khuếch tán vào lớp nhờ có kết hợp khuếch tán phân tử thụ động đối lưu Độ dày lớp phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn dung môi xung quanh hạt chứa enzyme cố định Việc gia tăng tốc độ pha trộn làm giảm rào khuếch tán bên ngồi, quy trình cơng nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trị quan trọng Rào khuếch tán bên giới hạn khuếch tán tự bên chất mang polymer chất mang gây Trong giới hạn hạt polymer có khuếch tán phân tử thụ động không bị ảnh hưởng tốc độ pha trộn Rào khuếch tán bên biểu rõ ràng enzyme cố định cách đưa vào chất mang polymer khơng phải gắn vào bề mặt chất mang CÔNG NGHỆ ENZYME 25 c) Ảnh hưởng pH lên enzyme khơng hịa tan Điện tích chất mang có ảnh hưởng đáng kể lên pH tối ưu enzyme cố định pH tối ưu enzyme cố định dịch chuyển phía pH kiềm hay pH acid so với pH tối ưu enzyme hòa tan Sự dịch chuyển pH tối ưu ảnh hưởng trường tĩnh điện chất mang tạo nên Sự có mặt trường tĩnh điện mạnh dẫn tới nồng độ H+ gần chất mang dung dịch khác Khi lực ion thấp nồng độ H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn, cịn gần chất mang điện tích dương thấp dung dịch Kết pH tối ưu enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang có điện tích âm chuyển dịch sang phía pH kiềm so với enzyme hịa tan, ngược lại enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang mang điện tích dương pH tối ưu chuyển dịch sang phía pH acid Cịn lực ion lớn điện tích chất mang làm trung hòa ion trái dấu pH tối ưu enzyme cố định gần giống enzyme hòa tan 3.3.2 3.3.2.1 Phương pháp cố định enzyme Chất mang dùng để cố định enzyme Mục đích cuối việc cố định enzyme gắn enzyme vào chất mang để ta thực phản ứng enzyme nhiều lần Công việc cần thực bước sau: Chọn chất mang phù hợp với enzyme cần gắn vào Hoạt hóa chất mang cho khả gắn enzyme tốt Tiến hành kỹ thuật phù hợp để gắn enzyme vào chất mang Yêu cầu chất mang lý tưởng: chất mang lý tưởng sử dụng cố định enzyme điều trước hết cần phải rẻ Điều có liên quan đến hiệu kinh tế quy trình cơng nghệ, đặc biệt có ý nghĩa quy trình ứng dụng quy mơ cơng nghiệp Chất mang phải có tính chất lý bền vững, ổn định Nhờ mà chất mang chịu điều kiện môi trường khuấy trộn, áp lực quy trình sản xuất Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan môi trường phản ứng Chất mang khơng làm hoạt tính enzyme Chất mang không gây phản ứng hấp phụ không đặc hiệu Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với công vi sinh vật Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất chất mang vừa làm tăng khả cố định enzyme vừa tăng khả tiếp xúc chất với enzyme, nhờ làm tăng hoạt tính enzyme cố định số lần tái sử dụng Chất mang có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng… Tất chất mang dùng cố định enzyme chia làm hai nhóm: chất mang polymer hữu cơ, chất mang vơ Chất mang polymer hữu cơ: polymer tổng hợp (polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol…) polymer tự nhiên (polysaccharide: cellulose, agarose, dextran, sephadex dẫn xuất chúng, alginate, carrageenan, chitin, chitosan…; protein: gelatin, keratin, albumin…) Chất mang vô cơ: sợi thủy tinh, silicum oxide, alluminium oxide, mangesium oxide… 3.3.2.2 Phương pháp cố định enzyme Trong tế bào sinh vật tồn sẵn enzyme dạng hòa tan enzyme khơng hịa tan Muốn thực phương pháp tạo enzyme khơng hịa tan ta phải tách thu nhận enzyme từ tế bào vsv Phương pháp nhốt enzyme: có phương pháp: Nhốt enzyme gel: nhốt enzyme gel phương pháp dựa sở tạo màng bọc hay polymer Các chất tham gia phản ứng sản phẩm phản ứng thẩm thấu vào ngồi thông qua mang bao bọc enzyem giữ ngun khn gel Cách thực hiện: enzyme trộn vào polymer Sau tiến hành q trình trùng hợp với có mặt hay nhiều tác nhân khâu mạch, tạo phức chelate Khi enzyme bao bọc khoảng không gel tạo thành Polymer sử dụng acrylamide Nhốt enzyme hệ sợi: Phương pháp nhốt enzyme hệ sợi có khả xúc tác phản ứng tốt phương pháp nhốt enzyme gel Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường sợi nhân CÔNG NGHỆ ENZYME 26 tạo Các loại sợi có độ bền với acid, kiềm, loại ion dung mơi hữu hịa tan Cellulose acetate thường sử dụng nhiều Phương pháp tạo vi nang nhốt enzyme: vi nang tạo để nhốt enzyme thường có kích thước – 100 m Các vi nang có tính chất cho chất sản phẩm phản ứng qua lại tự Phương pháp có ưu điểm enzyme nhốt bền với tác động bên sử dụng nhiều lần Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang: Đây phương pháp nhốt enzyme vào chất mang mà gắn enzyme vào chất mang Như vậy, tất vật liệu sử dụng làm chất mang mà chúng phải có tính chất đặc biệt gắn enzyme vào chất mang Tính chất đặc biệt này: Chất mang phải bền với acid, kiềm Chất mang pahri gắn với enzyme theo chế định Chất mang không tham gia phản ứng với chất Tùy theo tính chất chất mang, người ta thực gắn enzyme vào chất mang theo chế sau: Phương pháp hấp phụ: nhờ khả hấp phụ nguyên liệu làm chất mang, enzyme gắn vào bề mặt chất mang Khả hấp phụ chất mang cao, enzyme gắn nhiều vào chất mang Do đó, khả tái sử dụng enzyme cố định cao Trong thực tế người ta thường sử dụng chất có khả hấp phụ cao như: cellulose, agarose, chitin, polyacrylamide, nylon, nhựa trao đổi ion, silicagel, thủy tinh… Phương pháp tạo liên kết ion: dựa vào khả tạo liên kết ion chất mang enzyme người ta gắn enzyme vào chất mang Liên kết ion thường không bền hấp phụ enzyme chất mang Chất mang thường sử dụng: DEAEtsephadex Phương pháp tạo liên kết kim loại: người ta làm tăng hoạt tính bề mặt chất mang hợp chất kim loại Từ enzyme gắn chặt vào chất mang Những chất mang thường hoạt hóa bề mặt kim loại: cellulose, gelatin, thủy tinh, nylon, nhơm, silicagel… Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị: dựa nguyên tắc tương tác đồng hóa trị phân tử enzyme chất mang Các chất mang phải chất không tan nước Phương pháp ứng dụng rộng quy mô công nghiệp 3.4 Ứng dụng enzyme cố định Ngày nay, có vài quy trình cơng nghiệp quy mơ lớn hoạt động mà có sử dụng enzyme cố định Ví dụ điển hình q trình sản xuất fructose siro từ tinh bột bắp trình sản xuất Ltamino acid từ hỗn hợp L Dtamino acid Enzyme cố định penicillin acylase sử dụng rộng rãi trình sản xuất penicillin bán tổng hợp CÔNG NGHỆ ENZYME 3.4.1 27 Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase Dtglucose thay trực tiếp từ đường sucrose glucose Hơn nữa, tinh thể glucose dung dịch đậm đặc làm cho q trình khó thực Để loại bỏ trở ngại người ta chuyển đổi từ dạng đồng phân glucose sang fructose, sử dụng enzyme glucose isomerase Hệ số cân phản ứng 50oC gần 1, gia trị không thay đổi lớn theo nhiệt độ ước lượng nhiệt phản ứng 1kcal/mol Kết sản phẩm có chứa glucose frucose theo tỷ lệ 1:1 Hỗn hợp so với glucose đơn lẻ phù hợp để thay đường nhiều ứng dụng sản xuất nước giải khát, thực phẩm làm bánh kẹo Sở dĩ sản phẩm cuối có chứa nhiều fructose Enzyme ngoại bào glucose isomerase tạo nhiều vi sinh vật, cụ thể Arthobacter Streptomyces sp Nhu cầu phá vỡ tế bào mà không phá hủy enzyme làm cho glucose isomerase co giá thành cao so với enzyme thủy giải ngoại bào khác Hơn nữa, glucose isomerase nhạt cảm với số tác nhân kìm hãm Cả hai yếu tố cho thấy trì enzyme dạng cố định điều kiện phản ứng kiểm soát tốt biện pháp cần thực Người ta cố định glucose isomerase dạng kết hợp với collagen, hay vài loại tác nhân gắn kết khác Hình 3.1 Sơ đồ sản xuất fructose siro từ tinh bột bắp sử dụng enzyme glucose isomerase cố định Có nhiều cơng đoạn tách lọc xử lý q trình đường hóa đồng phân hóa phải thỏa mãn điều kiện enzyme học: để tối ưu hóa độ ổn định nhiệt αtamylase sử dụng giai đoạn hóa lỏng (nhiệt độ giai đoạn vào khoảng 105oC) cần sử dụng ion canxi Mặt khác, ion ức chế glucose isomerase, chúng loại bỏ nhờ trình trao đổi ion trước dung dịch đường dextrose cho vào thiết bị thực phản ứng isomer hóa CƠNG NGHỆ ENZYME 3.4.2 28 Sản xuất L|amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định Nhu cầu sử dụng Ltamino acid thực phẩm y học gia tăng nhanh chóng Ltamino acid tiến hành nghiên cứu sản xuất từ công nghệ vi sinh vật hay phương pháp tổng hợp hóa học Các amino acid tổng hợp phương pháp hóa học thường gặp số bất lợi tạo dạng đồng phân Dtamino acid, dạng đồng phân khơng có giá trị dinh dưỡng Do đó, trình sản xuất người ta mong muốn thu dạng đồng phân L sản phẩm cuối Nguyên lý chung phản ứng chuyển hóa Dltamino acid thành dạng Ltamino acid xúc tác enzyme aminoacylase: Phản ứng xảy thiết bị dạng cột có chứa enzyme aminoacylase cố định Ltamino acid mong muốn tách khỏi dạng acyl Dtamino acid dựa khác biệt độ hịa tan Sau Dtacylamino acid racemic hóa thành dạng DLtamino acid để tiếp tục quay trở lại lị phản ứng có chứa enzyme aminoacylase cố định Hình 3.2 Sơ đồ sản xuất L|amino acid sử dụng amino acylase công ty Taabe Seiyaku, Nhật Bản Hiện nay, loại aminoacylase gắn với DEAEtSephadex liên kết ion chọn sử dụng có hoạt tính cao, dễ dàng chuẩn bị, có khả tái sinh ổn định THU NHẬN ENZYME 4.1 Chọn nguồn nguyên liệu Enzyme chất xúc tác sinh học, có nhiều thể sống Việc điều chế chúng phương pháp hóa học với số lượng lớn việc làm khó khăn đầy tốn khơng muốn nói điều khơng tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn sinh học Mặc dù enzyme có tất quan, mô động vật thực vật tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu mặt kinh tế tiến hành nguyên liệu có chứa lượng lớn enzyme cho phép thu enzyme với hiệu suất cao dễ dàng tinh chế chúng Việc phân bố enzyme tế bào không đồng đều, loại tế bào có nhiều enzyme song khơng có enzyme khác Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh vật tùy theo loài nên phải chọn nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút tinh chế enzyme Có ba nguồn nguyên liệu sinh học bản: CÔNG NGHỆ ENZYME 29 Các mô quan động vật Mô quan thực vật Tế bào vi sinh vật Các mô quan động vật Trong tất nguyên liệu có nguồn gốc động vật tuyến tuỵ, màng nhầy dày, tim dùng để tách enzyme thuận lợi Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease số enzyme khác Từ ngăn tư dày bê nghé người ta thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa sản xuất fomat Người ta sản xuất pepsin từ dày động vật Nhưng khác với pepsin, renin có khả đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein Renin chế phẩm enzyme có giá trị lớn công nghiệp Mô quan thực vật Ở thực vật: thơng thường enzyme hay có mặt quan dự trữ hạt, củ, Cơ quan dự trữ giàu chất nhiều enzyme chuyển hóa chất Ví dụ hạt thầu dầu có nhiều lipase, hạt đậu tương có nhiều enzyme urease Thóc nảy mầm chứa nhiều α t amylase, củ khoai lang lại có nhiều β t amylase Người ta thu số chế phẩm enzyme thủy phân papain, bromelain, fixin từ thực vật bậc cao Papain thu từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ phận (lá, thân, quả) dứa, fixin tách từ dịch ép thân Ficus Qua nguồn nguyên liệu động, thực vật từ chiết xuất chế phẩm enzyme, thấy hai nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất chế phẩm enzyme với quy mô lớn nhược điểm sau đây: Chu kỳ sinh trưởng chúng dài Nguồn nguyên liệu không cải tạo Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn nhu cầu kinh tế quốc dân Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm bật có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, khắc phục khó khăn hạn chế Tế bào vi sinh vật Trước hết vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây nguồn nguyên liệu mà người chủ động tạo Chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn (từ 16 t 100 giờ) ni cấy hàng trăm lần năm Enzyme vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vượt xa sinh vật khác Vì cần lượng nhỏ enzyme chuyển hóa lượng lớn chất Số liệu tính tốn cho biết, vịng 24 giờ, vi sinh vật có khả chuyển hóa lượng thức ăn gấp 30 t 40 lần so với trọng lượng thể chúng Trong đó, hệ enzyme lợn 50 kg chuyển hóa vài kg thức ăn ngày Hệ enzyme vi sinh vật vô phong phú Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, có enzyme động, thực vật khơng tổng hợp Ví dụ cellulase, raxemase Phần lớn thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm giá rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả phát triển mơi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm phế liệu ngành sản xuất Hơn nữa, dùng nguyên liệu thực phẩm, dung dịch muối vơ để ni vi sinh vật Vì dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh hiệu kinh tế cao Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, tỷ lệ enzyme tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme sản xuất thời gian ngắn Đối với số trường hợp dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme CÔNG NGHỆ ENZYME 30 Vi sinh vật nhạy cảm tác động môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng số tác nhân lý hóa, học khác Do thay đổi điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta điều khiển tổng hợp enzyme dễ dàng nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme tổng hợp tổng hợp định hướng enzyme Tuy trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý số vi sinh vật có khả sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung vi sinh vật muốn sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn điều kiện sau: Khả tổng hợp enzyme mạnh thời gian ngắn Dễ tách enzyme khơng sinh độc tố Có điều lí thú là: điều kiện bình thường, vi sinh vật tổng hợp lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý thể chúng (thường gọi tổng hợp enzyme "bản thể") Nếu tăng hàm lượng số chất thêm số chất vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt chất enzyme, tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên cách đáng kể, khác thường có cịn tổng hợp enzyme mới: tượng gọi cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên cảm ứng sinh tổng hợp gọi chất cảm ứng Sự tổng hợp lượng đáng kể enzyme gọi siêu tổng hợp enzyme Để thu nguồn enzyme dồi từ vi sinh vật, cần phải ni cấy chúng Có hai phương pháp ni cấy vi sinh vật để thu enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp nuôi cấy bề sâu phương pháp phương pháp chìm Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát triển bao phủ bề mặt hoạt chất dinh dưỡng rắn, làm ẩm, dùng làm mơi trường (cám gạo, cám nếp, cám mì, bắp xay nhỏ ) Để môi trường xốp người ta trộn thêm lượng nhỏ mạt cưa Sau nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường sấy nhẹ, nghiền nhỏ Chế phẩm thu dạng rắn t thơ Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách tinh chế enzyme Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy bề sâu người ta cho vi sinh vật phát triển mơi trường lỏng Ngun liệu phổ biến dịch đường glucose, fructose, maltose, saccharose dịch thủy phân cellulose, tinh bột Nguồn nitơ hữu thường dùng nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men Cần chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật tổng hợp enzyme theo mong muốn Sau nuôi, ta thu canh trường lỏng t dạng thô Để làm tăng lượng enzyme vi sinh vật cần ý tuyển lựa chọn giống chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp enzyme cần thiết với số lượng nhiều Các chủng phân lập theo phương pháp thông thường tổng hợp lượng nhỏ enzyme (enzyme thể), cần tiến hành gây đột biến phương pháp sinh học, lý, hóa học để tạo chủng có khả siêu tổng hợp enzyme Vi sinh vật sau tuyển chọn, cần nhân giống nuôi điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme Ngồi cần phải chọn mơi trường thành phần mơi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng tổng hợp enzyme vi sinh vật Trong thành phần mơi trường phải có đủ chất đảm bảo sinh trưởng bình thường vi sinh vật tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý để tăng tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào tượng cảm ứng Vì thành phần mơi trường có chất cảm ứng chất hay sản phẩm phân giải kìm hãm làm yếu tác dụng kìm toả chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả sinh tổng hợp enzyme cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường chất tương ứng enzyme cần tổng hợp Ví dụ: Muốn tách α t amylase nấm mốc (Asp.Oryzae), người ta cho vào môi trường ni cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid có chứa liên kết α t 1,6 glucozid Muốn tách pectinase Asp.Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin Đối với hemicellulase chất cảm ứng hemicellulose; cịn proteinase chất cảm ứng có hiệu lực protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ở Actinomyces fradiae) Chất cảm ứng chất giống chất sản phẩm thủy phân chúng Ví dụ: thay cho protein peptid thay cho tinh bột erithrodextrin có tác dụng cảm ứng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 – 30oC Trị số pH ban đầu môi trường (chủ yếu mơi trường nước) gây ảnh hưởng đến CƠNG NGHỆ ENZYME 31 tạo thành enzyme, ng ccũng cần tính đến khả biến đổi nhanh hanh chóng số vi sinh vật Thơng thường α t amyl amylase, pH tối ưu cho sinh tổng hợp (pH = t 8) khác với pH tối ưu cho hoạt động (pH = 4,7 t 4,9) Các enzyme đường hóa khác nấm mố ốc glucoamylase pH tối ưu cho sinh tổng hợpp cho hoạt động chung (4,5 t 5,0) Độ ộ thơng khí cần thiết cho việc sinh tổng hợpp enzyme enzyme Vì mơi trường bề mặt người ta thường ng thêm thê chất xốp trấu vào, cịn mơi trường bề sâu (mơi ttrường dịch thể) , người ta thường lắc (nếu u enzyme en cần lắc việc quan trọng) Độ ẩm m ccũng quan trọng (chỉ có tác dụng ni cấy y bề b mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt Một điều cần nói thêm nữaa enzym enzyme thường chứa tế bào sinh vật gọii c enzyme tế bào (intracellular), ũng có th thể sinh vật tiết mơi trường sống ng Đó enzyme ngồi tế bào (extracellular) Enzyme yme vi sinh vvật thường chiết enzyme ngoại bào 4.2 Thu nhận enzyme Quy trình thu nhận enzyme từ ngu nguồn thực vật động vật Nguyên liệu thực vật/động vật Nghiền Trích ly Lọc Kết tủa Tinh enzyme Quy trình thu nhận enzyme từ vi si sinh vật Canh trường lên men vi sinh vật Phân ly lỏng/rắn Canh trường Lọc Kết tủa Tinh enzyme CÔNG NGHỆ ENZYME 32 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 5.1 Tình hình ứng dụng enzyme cơng nghiệp giới Từ phát enzyme khả chuyển hóa enzyme, lồi người tăng nhanh q trình sản xuất ứng dụng enzyme cơng nghiệp Số lượng enzyme phát ngày nhiều số lượng enzyme ứng dụng vào công nghiệp ngày nhiều Bảng 5.1 Mức độ ứng dụng số enzyme quan trọng giới [2] STT Loại enzyme Enzyme protease • Trypsine • Rennet • Protease acid • Protease trung tính • Protease kiềm yếu • Protease kiềm mạnh Carbohydrase • Pectinase • Isomerase • Cellulase • αtamylase • βtamylase Lipase Các enzyme khác ứng dụng y học phân tích Tỷ lệ ứng dụng (%) 59 10 12 25 28 13 13 10 Qua bảng ta thấy enzyme thuộc nhóm protease ứng dụng nhiều Trong đó, enzyme protease kiềm ứng dụng nhiều Trong đó, protein kiềm ứng dụng chất tẩy rửa với số lượng lớn so với loại enzyme khác Trong số enzyme sản xuất ứng dụng giới, nước Châu Âu sản xuất bán thị trường giới số lượng nhiều Bảng 5.2 Thị trường enzyme Châu Âu [2] STT Loại enzyme Carbohydrase Protease Lipase Pectinase Những loại enzyme đặc biệt Các loại enzyme khác Giá trị buôn bán enzyme (triệu USD) 83,2 187,2 31,6 41,6 20,8 41,6 (Nguồn: Frost Sullian, 1992) Riêng công nghệ thực phẩm, lượng enzyme tiêu thụ nhiều Số lượng enzyme ứng dụng công nghiệp thực phẩm chủ yếu nước Châu Mỹ, Châu Âu CÔNG NGHỆ ENZYME 33 Bảng 5.3 Thị trường enzyme công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc giới [2] STT Lĩnh vực công nghiệp enzyme Chuyển hóa tinh bột • Amylo glucosidase • αtamylase • Glucose isomerase • Enzyme nấm sợi • Pullulanase • βtamylase Cơng nghiệp sữa • Rennet động vật • Rennet vi sinh vật • Lipasetesterase • Lysozyme Rượu, bia, nước giải khát • Pectinase • Papain • βtglucanase • Cellulase – Hemicellulase • αtamylase • Amyloglucosidase • Glucose oxidase Cồn • αtamylase • Amyloglucosidase • Pullulanase • βtglucanase • Cellulase – Hemicellulase Cơng nghiệp bánh kẹo • Amylase nấm sợi • αtamylase • Protease • Cellulase – Hemicellulase Thực phẩm hỗn hợp • Invertase • Lipase • Bromelin • Glucoseoxidase Thức ăn gia súc • βtglucanase • Cellulase – Hemicellulase • αtamylase • Glucoseoxidase • Protease vi khuẩn Giá trị bn bán enzyme (triệu USD) 140 55 40 20 110 75 20 46 10 3–4 2–3 1–2 0,5 32 15 10 – 12 1–2 1–2 1–2 15 3–4 1–2 3–4 2–3