Công nghệ enzym

GS.TS đ ặ n g t h ị t h u (CHỦ BIỂN) PGS LÊ NGỌC TÚ, PGS.TS TÔ KIM ANH PGS.TS PHẠM THU THÚY, PGS.TS NGUYỄN XUÂN SÂM CÔNG NGHỆ ENZYM Chịu trách nhiệm xuất bản: Biên tập: Đ ồN G KHẮC SỦNG TS NGUYÊN Trình bày bìa: h u y t iế n NGỌC TUẤN NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trần Hưng Đạo - Hà Nội In 400 khổ 16 X 24cm, Xí nghiệp In NXB Văn hóa Dân tộc Số đăng ký kế hoạch XB: 235 - 2012/CXB/253 - 13/KHKT, cấp ngày 06/3/2012 Quyết định XB số: 43/QĐXB - NXBKHKT, cấp ngày 15/5/2012 In xong nộp lưu chiểu Qùý III năm 2012 L i nói đầu Enzym chất xúc tác sinh học, tức chất xúc tác sản xuất tế bào vi tế bào Là tác phẩm tự nhiên, enzym có chất protein có cấu trúc phân tử phức tạp tinh vi, enzym có lực xúc tác mạnh mẽ có tính chọn lọc cao Song chiết xuất ngồi, hoạt tính xúc tác giảm điều kiện mơi trường phản ứng khơng trì tế bào Bằng cách trích ly enzym thu chè phám enzym có độ tinh khiết cao? Bằng phương pháp chế tác chê phẩm enzym dạng khơng hịa tan để sử dụng lâu bền Enzym hòa tan enzym cố định khác động học nào? Đặc điểm thiết bị phản ứng enzym nguyên tắc làm việc điện cực enzym nào? Phạm vi hiệu sử dụng enzym kinh tế quốc dân nào? Các vấn đề nêu trình bày chương sau sách “Công nghệ enzym”: Chương Công nghệ thu chế phẩm enzym - GS Đặng Thị Thu, PGS Lê Ngọc Tú Chương Enzym cố định (enzym khơng hịa tan) - GS Đặng Thị Thu ChươìtíỊ Động học phản ứng enzym - PGS Lê Ngọc Tú Chương Điện cực sinh học (cảm biến sinh học) - GS Đặng Thị Thu Chương Thiết bị phản ứng enzym - PGS Tô Kim Anh Chương ứng dụng chế phẩm enzym triển vọng công nghệ enzym: - ứng dụng chế phẩm công nghệ thực phẩm - PGS Phạm Thu Thủy - ứng dụng chế phẩm enzym số ngành công nghiệp khác - PGS Nguyễn Xuân Sâm - Triển vọng công nghệ enzym - PGS Tổ Kim Anh Cuốn sách giáo trình học tập cho sinh viên học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm đại học Bách Khoa Hà Nội số trường đại học khác Cũng làm tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành Công nghệ hóa học, Cơng nghệ mơi trường, Dược, Thủy sản, Nơng nghiệp, cho cán nghiên cứu, quản lý viện nghiên cứu có liên quan Các tác giả xin cảm ơn mong nhận ý kiến đóng góp bạn đọc để sách bổ sung hoàn thiện lần in sau Hà Nội ngày 01 tháng năm 2012 TM, CÁC TÁC GIẢ Chủ biên Đặng Thị Thu M ụ c LỤC Lời nói đ ầ u Chương CÔNG NGHỆ THU CHẾ PHAM ENZYM 1.1 Khái quát en zym 1.2 Các đơn vị hoạt độ enzym 1.3 Nguồn nguyên liệu thu enzym 1.4 Phương pháp thu chế phẩm enzym vi sinh vật 14 Chương ENZYM cố ĐỊNH (Immobilized enzymes) 2.1 Khái niệm enzym cố định 67 2.2 Các phương pháp điều chế enzym cố định 68 2.3 Một số đặc tính enzym cố đ ịnh 82 2.4 Úng dụng enzym cố định 85 Chương ĐỘNG HỌC PHẢN ÚNG ENZYM 3.1 Động học Enzym monome .92 3.2 Động học enzym dị không gian điều hòa enzym oligom e 127 3.3 Động học enzym cố đ ịnh 136 cực SINH HỌC (Cảm Biến Sinh Học) 4.1 Sơ lược lịch sử phát triển ĐIỆN cực SINH HỌC 160 Chương ĐIỆN 4.2 Khái niệm điện cực sinh h ọc 161 4.3 Một số loại điện cực sinh h ọ c 169 4.4 ứng dụng điện cực sinh học 195 Chương THIẾT BỊ PHẢN ÚNG ENZYM 5.1 Thiết bị phản ứng gián đoạn 218 5.2 Thiết bị phản ứng liên tụ c 220 5.3 Thiết bị phản ứng enzym dạng màng 226 5.4 Thiết bị phản ứng dạng c ộ t 227 5.5 Thiết bị phản ứng tầng sôi 230 5.6 Lựa chọn thiết bị phản ứng enzym 231 Chương ỨNG DỤNG CHẾ PHAM ENZYM VÀ TRIEN v ọ n g c ủ a CÔNG NGHỆ ENZYM 6.1 ứng dụng enzym công nghiệp thực phẩm 233 6.2 Úng dụng enzym số ngành công nghiệp khác 281 6.3 Triển vọng công nghệ ENZYM .300 TÀI LIỆU THAM K H Ả O 319 CHƯƠNG CỒNG NGHỆ■ THU CHẾ PHAiyi* ENZYM 1.1 KHÁI QUÁT VỂ ENZYM - Enzym chất xúc tác sinh học, có chất protein, hoà tan nước dung dịch muối lỗng Enzym có phân tử lượng lớn từ 201.000 KDa nên không qua màng bán thấm - Tất yếu tố làm biến tính protein axit đặc, kiềm đặc, muối kim loại nặng, làm enzym bị biến tính hoạt tính xúc tác - Enzym có nhiều tính chất ưu việt hẳn chất xúc tác hoá học Enzym có cường lực xúc tác lớn: điều kiện thích hợp, hầu hết phản ứng có xúc tác enzym xảy với tốc độ nhanh gấp 10s -10" lần so với phản ứng khơng có chất xúc tác - lg pepsin phân giải 5kg protein trứng - lg renin làm đông tụ 72 sữa sản xuất mát - lm ol catalase phân huỷ 5.106mol H2OVphút lmol Fe+,chỉ phân huỷ 10 6mol H20 2/phút Enzym có tính đặc hiệu cao: Mỗi enzym xúc tác làm chuyển hoá chất định theo kiểu liên kết hoá học định, kiểu phản ứng định Sự tác dụng có tính chất lựa chọn gọi tính đặc hiệu enzym,hay cịn gọi tính chun mơn hóa cao Enzym có tính đặc hiệu cao nên khơng tạo sản phẩm phụ Enzym tác dụng điều kiện “êm dịu “ Enzym thường tác dụng thích hợp nhiệt độ 30-50"C, pH trung tính áp suất thường, khổng cần nồng độ axit hay nồng độ kiềm mạnh, áp suất cao, khơng địi hỏi thiết bị chịu axit, kiềm chịu áp suất cao đắt tiền Tất cá enzym có nguồn gốc tự nhiên khơng độc Điều có ý nghĩa quan trọng công nghiệp thực phẩm y học Các chế phẩm enzym sán xuất từ nguồn nguyên liệu dẻ kiếm, rẻ tiền: - Enzym protease động vật thường thu nhận từ phụ phẩm lò mổ nhừ : tụy tạng, dày - Enzym protease thực vật thu từ vỏ, dứa, lá, thân, nhựa sung, vả, nhựa đu đủ xanh - Enzym vi sinh vật thu nhận phương pháp nuôi cấy bể mật bề sâu 1.2 CÁC ĐƠN VỊ HOẠT ĐỘ CỦA ENZYM Đơn vị hoạt độ enzym coi lượng enzym có khả ' xúc tác làm chuyển hoá lượng chất định, đơn vị thời gian định, điều kiện tiêu chuẩn Theo quy ước quốc tế có số đơn vị hoạt độ sau: / Đơn vị IU (đơn vị quốc té) Là lượng enzym có khả nâng xúc tác chuyển hoá micromol chất sau thời gian phút điểu kiện tiêu chuẩn: II u= ụ M chất (10 fiM/phút) Đơn vị katal (kat) Là lượng enzym có khả xúc tác chuyển hoá moi chất sau thời gian giây điều kiện tiêu chuẩn: I kat = 1Moi chất / giây II u= 1/60 x l 6kat =16,67 nkat Hoạt lực enzym hoạt lực xúc tác biểu diễn số đơn vị hoạt độ enzym Hoạt độ riêng Hoat độ riêng chế phẩm enzym biểu diễn số đơn vị hoạt dộ enzym đơn vị khối lượng protein: I u kat / mg (ml) protein Hoạt độ phán tử (hoặc hoạt độ rièng phàn tử) Được biếu dien số phàn tử chất dược chuyển hoá phân tử enzyin sau đơn vị thời gian (thường phút) Hoạt độ tám xúc tác Là sô phàn tử chất bị chuyến hoá trung târọ hoạt động sau phút Hoạt độ kcat (hoạt độ xúc tác) Là lượng phân tử chất lớn chuyển hoá phân tử enzym dơn vị thời gian (giây) điều kiện enzym bão hoà chất Tỷ lệ kcatỉkm Là hiệu xúc tác enzym (catalytic efficency) biểu tính đặc hiệu enzym với chất khác 1.3 NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU ENZYM Enzym chất khống thể điều chế phương pháp tổng hợp hoá học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật vi sinh vật Trong hàng trăm enzym sử dụng công nghiệp nửa sản xuất từ nấm mốc nấm men, phần ba từ vi khuẩn, lại từ 8% nguồn động vật % nguồn thực vật 1.3.1 Enzym động vật Một sô mô động vật chứa nhiều enzym: Dạ dày, tụy tạng, tim, gan, lách Tụy tạng: quan chứa nhiều enzym amylase, mantase, lipase, cholesterol esterase, excitinase, nuclease, trypsin, kimotrypsin, cacbocylpeptidase A, B, elastase Tất enzym tiết ngồi tế bào vói dịch tụy Dạ dày: Màng nhầy dày lợn, chó gà, thỏ, chứa pepsin A,B,C,D (dạ dày lợn nhiều nhất) riêng del dày lợn có gastrinsin (enzym thuỷ phân protein) Ngăn thứ tư dày bò chứa loại vi khuẩn tổng hợp cellulase Dạ dày loài động vật có sừng non (bê, nghé) chứa renin (enzym lầm đơng tụ sữa sản xuất mát) Ruột: enzym ruột tiết tế bào với dịch ruột: Enterokinase, lactase, aminopeptidase, v v manta.se, saccara.se, nuclease, phosphatase Gan: Là quan chứa nhiều enzym có chung quan, thấy hộ enzym riêng gan có: Enzym tham gia tổng hợp urê, nhờ phong phú vể enzym mà gan tham gia nhiều trình trao đổi chất Người ta ví gan phịng thí nghiệm trung tâm thể Tuyến nước bọt: Trong nước bọt enzym tiêu hố: Amylase, Iĩiantase, cịn chứa enzym có tên Kalicrein, enzym tác dụng lên globin a-2 Kali-dinogen để giải phóng kalidin decapeptít có tác dụng làm tăng tiết nước bọt Huyết thanh: Trong huyết chứa nhiều enzym, bình thường hoạt độ enzym không lớn Một số enzym coi thị để theo dõi bệnh tật : - Amylase (tăng viêm tụy cấp) - Phosphatase kiềm (tăng bị còi xương, tắc mật) - Transaminase (tăng viêm gan, nhồi máu tim) Mặc dù quan động vật chứa enzym, song thông thường người ta thu chế phẩm pepsin từ dày lợn, renin từ dày bê, pancreatin từ tụy tạng lợn 1.3.2 Enzym thực vật Từ thực vật thượng đẳng thu số enzym thuỷ phân: - Papain từ nhựa đu đủ - Bromelain từ thân, dứa chồi vỏ dứa Papain bromelain có tác dụng giống nhau: Làm mềm thịt, đẩy nhanh trình thuỷ phân protein dùng để phá đục protein bia, rượu 10 - Các enzym plazmin, papain, ficin thường có họ Ficus sung, si, vả (nhựa lá, thân) - Các a , ß- amylase có malt đại mạch malt thóc - Urease có giá đậu tương, lipase có mầm hạt thầu dầu - Polyphenoloxydase có chè, chuyển Hố hợp chất polyphenol thành quinol tương ứng, có màu sắc đặc trưng chè - Peroxydase tác dụng với tanin tạo thành sản phẩm ngưng tụ khơng màu - Ngồi chè chứa số enzym protease, pectinase, amylase, invertase Dưới tác dụng enzym này, xảy biến đổi chất tương ứng chè q trình chế biến góp phần tạo nên chất tham gia vào hình thành chất lượng chè (màu sắc hương thorn) 1.3.3 Enzym vi sinh vật Đây nguồn thu enzym phong phú Từ vơ số lồi vi sinh vật, người ta thu nhiều loại enzym khác nhau, có enzym mà thể động vật thực vật tổng hợp - Hệ enzym vi sinh vật có khả thay đổi cách thay đổi điều kiện nuôi cấy dùng tác nhân điều chỉnh Từ loài vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh loại enzym theo ý muốn - Vi sinh vật có khả sinh sản, phát triển sinh tổng hợp enzym với tốc độ lớn, cho phép thu lượng lớn enzym thời gian ngắn cách dễ dàng - Enzym vi sinh vật có hoạt tính lất mạnh, vượt xa enzym từ nguồn khác Người ta tính rằng, vịng 24 vi sinh vật có thê chuyển hoá lượng lớn thức ãn gấp 30-40 lần so với trọng lượng thể chúng Trong hệ enzym lợn 50kg chuyến hố vài kg thức ăn ngày 11 Khi thể tích pha hữu đủ lớn, Khai pha tiến tới Khc trường pha phụ thuộc bậc vào a, hợp phản ứng đơn phân Tuy nhiên, Khai vậy, giá trị trung gian a, pha nhận giá trị cực đại Khai cực tiểu khác với Kn Khe- Như vậy, Khai pha có giá trị lớn phản ứng tương tự xảy hệ pha hữu nước Trong trường hợp này, vận tốc phản ứng hệ hai pha lớn nhiều so với phản ứng hệ pha Một trường hợp đặc biệt phản ứng nhị phân hệ hai pha cấu tử cùa phản ứng nước Khi ấy, trình (6.16) trở thành: A + B Pha hữu A + B K„ — - c + orj X Pha nước c + h 2o (6.20) (6.21) Pn = ÍH:0 ,J / ( H ,0 J Thông thường hệ dung môi nước, phản ứng thủy phân xảy ra, nghĩa theo chiều từ phải sang trái Tuy nhiên hệ hai pha, sổ cân phản ứng thay đổi mô tả trên, cho phép enzym thủy phân hoạt động theo chiều từ trái qua phải Điều cộ ý nghĩa phàn ứng tổng hợp khó xảy phản ứng hóa học hữu thơng thường địi hỏi vùng đặc hiệu lựa chọn nhóm phản ứng Có hai yếu tố ảnh hưởng tới suất thu nhận sản phẩm c, là: 1) thay đổi Khai pha, 2) nồng độ ([H20]t) Nồng độ nước tổng cộng tính theo phương trình cân bàng vật liệu: [ H 20 ] n [H20 ] t (V„ + Vhc) = [H20]„.v„ + [H20]hc.Vhc (6.22) nồng độ phần mol nước tinh khiết, [ H 20 ] n = 1000/18 = 55,5M 55,5(1-KxPn) [H 20 ] , 1+ a Với 306 K haiplia _ [A ,][B ,] [C t].[H ,0 ] (6.23) Và (6.19), thay Pn cho Pn, được: rcl=K ( l + g P , ) ( l + g ) [ A ,] [ B ,] (6.24) “ 55,5.(1 + a P , ) ( l + a P „ ) Neu c phân cực hom A B hiệu suất phản ứng tăng lên nồng độ pha hữu Ví dụ hình 6.14 tổng hợp este từ axit rượu hệ hai pha cho thấy nồng dộ pha hữu tăng lên, hiệu suất phàn ứng tăng từ 0% lên 100% Để đạt hiệu suất chuyển hóa cao, cần loại bỏ lượng nước tạo thành hệ hai pha để tránh giảm a Tuy nhiên loại bỏ nước hệ hai pha khơng dễ đạt Có thể bổ sung đặn enzym thể tích định pha hữu để giữ cho số cân pha hệ khơng thay đổi H ìn h T ô n g h ợ p e ty l este N - b e n z o y l- L -p h e n y la la n in t N -b e n z o y l-L p h e n y la la n in rư ợ u etylic tro n g h ệ h a i p h a c lo ro fo rm - n c - Động học enzym hệ hai pha hữu - nước Trong hệ hai pha, ln có lượng định chất phản ứng tan lớp nước bao quanh enzym Thường lớp nước khơng bị khuấy trộn cho dù pha hữu khuấy dặn suốt trình phàn ứng Nếu chiều dày lớp nước lớn, vận tốc phàn ứng enzym bị kiểm soát vận tốc khuêch tán chất qua lớp nước độ hòa tan thấp cùa chất pha nước Trong trường hợp enzym hòa tan tốt nước, lớp nước thường mòng, vận tốc phàn ứng phụ thuộc vào vận tốc 307 khuếch tán chất nồng độ cao pha hữu qua lớp phân chia bề mặt tới vi môi trường bao quanh enzym có nồng độ chất thấp Trong trường hợp enzym cố định, vận tốc dòng chất tới bề mặt xúc tác hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào bề mặt riêng hạt enzym Trong trường hợp hệ pha, bề mặt riêng bề mặt hạt enzym tiếp xúc với môi trường phản ứng Trong hệ hai pha, bề mặt riêng bề mặt phân chia hai pha Trong trường hợp thông thường, bề mặt phân chia pha phụ thuộc vào thể tích giọt nước bao quanh hạt enzym Nếu thể tích pha hữu tăng lên, thể tích giọt nước giảm đi, làm giảm suất thể tích phàn ứng Khi phản ứng tạo thành nước, cần tách nước hàm lượng nước tích tụ làm chuyển dịch cân bàng hệ thống mà làm giảm vận tốc phản ứng Các nguyên tắc cho phép tối ưu hóa phản ứng enzym hai pha chủ yếu phụ thuộc vào logP: - Giảm tối đa khác biệt logP cùa chất bề mặt phân chia pha LogP cùa dung mồi hữu cần lớn logP chất nhiều để đảm bảo nồng độ chất cao khu vực phân chia pha nhờ đạt vận tốc khuếch tán cao cùa chất từ pha hữu vào pha nước - Sự khác biệt logP sản phẩm pha hữu cần phải nhỏ, đồng thời logP sản phẩm phải lớn logP bề mặt phân chia pha Nhờ có thê đạt vận tốc chuyển dịch lớn sản phẩm sau phản ứng từ pha nước qua bề mặt phân chia vào pha hữu - Có thể thay đổi logP bề mặt phân chia pha độc lập với pha hữu nhờ bổ sung chất hoạt động bề mặt chất hiệp trợ thích hợp Tuy nhiên thực tế, việc sử dụng lựa chọn chất hoạt động bề mặt phức tạp nhiều Đặc biệt phán ứng tạo nước, chất hoạt động bê mặt tạo lớp màng kép chất hoạt động bề mặt bao quanh giọt nước Có thê hạn chế nồng độ nước xung quanh hạt enzym cách sử dụng màng lọc phân tứ (K-Al-silicagel) để hấp thụ nước pha hữu Neu dung môi hữu có nhiệt độ sơi cao tách nước chưng cất chân khơng (ví dụ phản ứng este hóa axit béo rượu kỵ nước nhờ lypase công nghệ sản xuất loại sáp) 308 6.3 L2 Phản ứng enzynt hệ hai pha lỏng tan lẫn: pha nước - nước Hệ hai pha nước cho phép chuyển dịch cân bang phản ứng phía tạo sàn phẩm cách đảm bảo chất enzym phân bố chủ yếu vào pha, sản phẩm phân bố chủ yếu pha lại Lý thuyết hệ hai pha hữu - nước hoàn tồn áp dụng trường hợp hai pha nước Có thể minh họa hệ thống thơng qua ví dụ thủy phân tinh bột, nhờ Oíamylase gluco-amylase hệ hai pha nước tạo nước (pha trên) nước - propyenglycol (PFG 20000) (pha dưới) Tinh bột phần lớn enzym phân bố pha dưới, glucose phân bố chủ yếu pha Một lượng nhỏ glucoamylasẹ phân bố pha giúp chuyển hóa ologosaccarit pha thành glucose nâng nồng độ sản phẩm tới 140 g/1 pha Hệ thống cho phép enzym chất tồn pha, tránh hạn chế cùa tượng chuyển khối qua bề mặt phân chia pha trường hợp hệ hai pha khơng tan lẫn Ngồi ra, không cần tách sản phẩm khỏi chất chưa chuyển hóa giảm dược mát enzym - Phản ứng tồng hợp enzym xúc tác Các phàn ứng tổng hợp nhờ enzym mối quan tâm nhà công nghệ sinh học việc tổng hợp chất nhờ đường hóa học khó khăn, tạo nhiều sản phẩm phụ giá thành sản phẩm cao Việc sử dụng enzym với tính đặc hiệu nhóm, đặc hiệu mạch bên đặc hiệu quang học cao điều kiện cân phàn ứng chuyển dịch theo chiều từ phải sang trái (tổng hợp) thu sàn phẩm với giá thành thấp nhiều so với phương pháp hóa học Chúng ta xem xét ví dụ sừ dụng protease phàn ứng plastein, glycozidase phản ứng tồng hợp oligosaccarit lipase phản ứng chuyển vị este Phản ứng plastein Sử dụng protease dung dịch protein, axit amin peptit có nồng độ cao có thê tổng hợp ngẫu nhiên polyme Phản ứng thường sử dụng để cài biên chất dinh dưỡng, cảm quan khơng hấp dẫn cùa protein, ví dụ tạo protein có mùi, vị màu sắc hấp dẫn so với protein nguyên thủy Phản ứng sử dụng để gắn thêm 309 vào protein thành phần ax it amin dó nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng biến đổi cấu trúc bậc protein nhằm cải biến tính chất chức protein Hầu protease phân cắt protein liên kết đặc hiệu, vỉ sử dụng enzym theo chiều phàn ứng tổng hợp để tổng hợp liên kết peptit định trước Yếu tố tăng cường trình tổng hợp bao gồm pH, nhóm cacbọxyl nhóm amin lựa chọn để bảo vệ, khả kết tủa sản phẩm, phản ứng hệ hai pha lỏng Các yếu tổ đạt bàng cách kiểm soát cân bàng phản ứng Một cách khác để tổng hợp peptit dựa vào q trình kiểm sốt động thái q trình tổng hợp có vận tốc tạo sản phẩm (kp) cao trình thủy phân (kh) Q trình mơ tả sau (X este, amit cacboxyl): ọ II R - C -X H I + enzym O Ọ H II [ r —c— X : enzym] _ R—C—X —cnzym + HX R-NH, H,oị *H oII H1 ù R -C -O H Oắ oII N -R ’ Vận tốc tạo thành sản phẩm phụ thuộc vào tỳ số kp / kh, km nồng độ nước hợp chất amin Hiệu suất trình nâng cao giảm hoạt độ nước môi trường phản ứng Có thể kéo dài peptit bàng cách thêm vào peptit axit amin cách ngưng tụ peptit Phản ứng ngưng tụ peptit thực q trình kiểm sốt động thái, phản ứng kéo dài peptit thực tốt hệ hai pha rắn - lỏng (thông qua việc kết tủa) q trình kiểm sốt động thái hệ hai pha lỏng - lỏng Để kiểm soát động thái phản ứng, cần có enzym hoạt độ cao, giá thành sản phẩm cao Đe giảm chi phí, sử dụng enzym cố định Tổng hợp chất thay aspartam ví dụ đơn giản phản ứng plastein Aspartam dipeptit a-L-asparty-L-phenylalanyl-Ometyl-este tạo L-aspartic metyl este phenylamin Trong phương pháp tổng hợp aspartam đường hóa học, cần bảo vệ hai nhóm /3- 310 cacboxyl ữ-amin L-aspartic Nếu nhóm /3-cacboxyl khơng bảo vệ, phản ứng tạo dạng /3-izome mà để loại bỏ nó, giá thành sản phẩm tăng lên 30% Hiệu suất tổng hợp theo đường thấp, giá thành sản phẩm cao Nếu sử dụng protease thermolysin, cần bảo vệ nhóm a -am in L-aspartic nhờ phản ứng với benzyl chloroformât để tạo thành dẫn xuất benzyloxy-cacbonyl-BOC (BOC-L-aspartic), tránh tạo thành poly L-aspartic Có thể sử dụng hồn hợp racemic cùa L-aspartic để tổng hợp aspartam tính đặc hiệu quang học enzyưi Việc tổng hợp isulin người từ isulin lợn đòi hỏi thay alanin đầu cacbon mạch peptit lợn threonin Có thể thực phản ứng nhờ phản ứng chuyển peptit trypsin xúc tác với tham gia threonin có nhóm cacboxyl bảo vệ Phản ứng xảy pha nước với dung môi hữu tan nước Sản phẩm tạo thành thủy phân nhẹ để tách nhóm cacboxyl threonin để tạo insulin người - Phản ứng tổng hợp sừ dụng glycozidase Bên cạnh việc sừ dụng protease phản ứng plastein, glycozidase sừ dụng rộng rãi để tổng hợp oligosaccarit khử không khử từ đường khử quen thuộc glucose, fructose việc phát triển thực phẩm chức /3galactosidase sử dụng phản ứng tổng hợp N-acetyllactosamin từ lactose N-acetylglucosamin để loại bỏ lactose sữa sản xuất chế phẩm sữa cho người tiểu đường bệnh nhân mẫn cảm với lactose Phản ứng chuyển vị este Vị trí chất gốc cacboxyl cấu tạo lipit tạo nên lipit có tính chất vật lý cảm quan hoàn toàn khác Một sổ lipit có giá trị thương mại lơn, ví dụ bơ cacao Bơ cacao có giá trị cao nhiệt độ nóng chảy đặc biệt (nằm nhiệt độ môi trường nhiệt độ thể người) Trong thành phần cấu tạo bơ cacao, 80% triglycerit có thành phần axit palmitic stearic vị trí 3, axit oleic vị trí Có thể sản xuất lipit có giá trị cao từ lipit thông thường rẻ nhờ phản ứng chuyển vị este thay gốc cacboxyl gốc rượu lipit tác dụng lipase 311 Để sản xuất bơ cacao từ dầu cọ gốc axit dầu cọ cần thay gốc strearic Phản ứng thực hexan chứa lượng vừa đủ nước cho hoạt hóa lipạse Cũng nâng cao chất lượng dầu oliu bàng cách thay gốc oleic vị trí 1,3 bàng gốc palmitic, chất lượng dầu cọ dầu hướng dương cách tăng tỷ lệ gốc oleic dầu Ngoài ra, lipase sử dụng phản ứng tổng họp chất thơm tự nhiên hệ hai pha (ví dụ tổng họp isoamyl acetat rượu isoamylic) Các phản ứng tổng hợp thực sử dụng lipase có tính đặc hiệu phù hợp điều kiện phản ứng thích ứng cho trình hợp ưu trình thủy phân Đối với lipase cơng nghiệp, thơng thường hoạt tính thủy phân cao hoạt tính tổng hợp - lần Có thể hạn chế phản ứng thủy phân bàng cách làm giảm hàm lượng nước hệ thống phản ứng sử dụng phản ứng hệ hai pha hữu - nước 6.3.2 Triến vọng tương lai cơng nghệ enzym Hiện tai, có số enzym sản xuất quy mơ lớn thích ứng với sản xuất cơng nghiệp Ngành công nghiệp enzym phát triển dựa hướng sau: kiếm tìm nguồn enzym mod; thiết lập sử dụng đa hóa enzym cơng nghiệp; sử dụng công cụ kỹ thuật di truyền để thiết kế sản xuất chất xúc tác hữu tương tự enzym sử dụng hệ enzym phức tạp Để đáp ưng yêu cầu phát triển công nghiệp enzym, cần có phối hợp nhà enzym học, nhà di truyền nhà hóa học 63.2.1 Cơ chất phi tự nhiên Rất nhiều enzym tính đặc hiệu với chất tự nhiên điều kiện phản ứng thay đổi enzym thể hoạt tính hồn tồn khác với hoạt tính biết trước chủng Nhờ phản ứng này, thực phản ứng enzym với vận tốc cao nhiều lần so với sử dụng chất thơng thường chúng tạo cách thức để sản suất sản phẩm Có thể minh họa khả enzym trường hợp sau: 312 Enzym glucooxydase đặc hiệu phản ứng oxy hóa đường khử với chất đặc hiệu D-glucose không đặc hiệu với chất nhận electron phản ứng oxy hóa Thơng thường, oxy đóng vai trị chất nhận electron phản ứng oxy hóa D-glucose bàng enzym glucooxydase Benzoquinon đóng vai trị chất nhận điện tử thay cho oxy, phản ứng diễn sau: D-Glucose Benzoquinon Ữ-Glucono- 1,5-iacton Hydroquinon Hydroquinon hợp chất hữu quý sử dụng nhiều kỹ thuật nhiếp ảnh Phản ứng xảy với hiệu suất gần 100%, enzym không bị vô hoạt peroxyt phản ứng với oxy Vận tốc phản ứ n g g iữ a glucooxydase với benzoquinon cao vận tốc phản ứng cửa enzym với oxy tính tan benzoquinon pha nước cao oxy Acetylcholinesterase enzym xúc tác thủy phân acetylcholin, chất dẫn truyền thẩn kinh động vật có xương sống, tạo thành cholin acetic Enzym xúc tác đặc hiệu việc thủy phân acetyl-Dcamitin khơng có hoạt tính acetyl-L-camitin L-camitin có hoạt tính vitamin sử dụng hữu ích điều trị, đó, dạng D-camitin lại khơng có giá trị Vì thế, enzym acetylcholinesterase sử dụng để phân tách hỗn hợp racemic hai hợp chất Người ta tổng hợp hỗn hợp racemic L,D-camitin bàng đường hóa học, sau acetylat hóa hỗn hợp bang acetyl clorua để tạo acetyl-L,D-camitin Cho hồn hợp qua cột phản ứng với acetylcholinesteraza, thu acetyl-L-camitin D-camitin Tách hỗn hợp bàng sắc ký trao đổi ion, thu acetyl-Lcamitin, chất có tác dụng tương tự L-camitin 63.2.2 Biến đôi cấu trúc enzytn Một xu hướng phát triển năm vừa qua lĩnh vực enzym áp dụng kỹ thuật di truyền làm biến đổi có định hướng cấu trúc 313 enzym, làm thay đổi hoạt tính, hiệu suất phản ứng động học enzym, làm cho trình thu hồi enzym trở nên thực Một khía cạnh sản xuất enzym tính đến gắn gen chịu trách nhiệm tổng hợp enzym có nguồn gốc từ nguồn khơng an tồn vào thể chủ an toàn tổng hợp chúng với suất cao nhờ việc chứa nhiều gen Trong tương lai, enzym thao tác cho dễ dàng phù hợp với điều kiện sản xuất điều kiện nhiệt độ, ion, kiềm pH Một xu hướng hứa hẹn công nghệ enzym sử dụng công nghệ protein cải biến trung tâm hoạt động enzym, nhờ thu enzym có hoạt tính cao có hoạt tính Một kỹ thuật xem triển vọng đột biến điểm cho protein enzym Điểm mấu chốt kỹ thuật thay đổi vài axit amin cấu tạo protein enzym, dẫn tới thay đổi lớn cấu hình protein, hoạt tính tính chất enzym thay đổi theo Để kỹ thuật phát triển được, cần có hệ liệu đủ chi tiết phần mềm hỗ trợ, cộng thêm kỹ thuật đột biến điểm phương pháp truyền thống, hóa học phân tử lý thuyết thực nghiệm 63.2.3 Tổng hợp enzym nhàn tạo Các chất có hoạt tính tương tự enzym (synzym) tổng hợp bàng đường nhân tạo Để tổng hợp synzym, cần thiết kế tổng hợp trung tâm gắn chất trung tâm xúc tác Thực tế cho thấy việc thiết kế trung tâm gắn chất đơn giản thiết kế trung tâm xúc tác gặp nhiều khó khăn Nhìn chng synzym tn thủ mơ hình MichaelisMenten, chế phản ứng tương tự phản ứng enzym xúc tác Cho tới nay, enzym nhân tạo chưa thể thiết kế từ protein chưa có đầy đủ thơng tin ngun tắc cấu hình khơng gian từ cấu trúc bậc protein Hơn nữa, enzym tạo nên từ protein gặp phải nhược điểm enzym tự nhiên dễ biến tính, dễ bị oxy hóa thủy phân 314 Một vài enzym nhân tạo đà sử dụng thành cơng, ví dụ trường hợp axit polyglutamic với tính chất tương tự esteraza, hoạt động pH hẹp, tối ưu pH = 5,3; Km= 2mM vmax= 10‘4 -M ° s'1đối với phản ứng thủy phân chất 4-nitrophenyl acetat 6.2.3.4 H ệ thống tái tạo Coenzym Đối với enzym sử dụng Coenzym, việc tái tạo Coenzym vô quan trọng giá thành cao Coenzym khó khăn tái tạo coenzym Có thể giải vấn đề cố định Coenzym enzym chất mang thích hợp Một biện pháp hệ thong cố định tế bào Tuy nhiên hệ thống làm việc với hiệu suất thấp tính ổn nhiệt khơng cao Có thể thực phản ứng enzym thiết bị phản ứng màng với kích thước lỗ màng lọc phải nhỏ kích thước coenzym Hoặc Coenzym cố định chất mang Thơng thường cần dẫn xuất hóa Coenzym để dễ dàng cố định chúng chất mami không ảnh hưởng tới chức hỗ trợ xúc tác chứng Các chất phân tử lượng cao hòa tan nước thường sử dụng làm chất mang coenzym ảnh hường tới khuếch tán Coenzym so với chất mang không tan nước Các chất hay sử dụng dextran, propylenglycol, polyetylenimin Thường Coenzym nên gắn mức độ thấp tránh làm giảm khả chuyển động khuếch tán ảnh hưởng ức chế chúng tới phản ứng enzym Động thái phản ứng enzym thay đổi theo hệ thống, nhiên chủng tuân theo mô hình Michaelis-Menten với Kmcao Vm thấp trường hợp khơng cố định Coenzym Hiện nay, có số hệ thống tái tạo Coenzym dựa nguyên tẳc hóa học, điện hóa nguyên tắc enzym Tái tạo coenzym theo nguyên tắc enzym ưu điểm tính đặc hiệu cao nó, phương pháp điện hóa lại có tính cạnh tranh Dưới hai ví dụ tái tạo Coenzym theo nguyên tắc enzym Để thực nguyên tắc này, chất enzym phải rẻ enzym hỗ trợ trình phải dễ kiếm, sản phẩm cần tách dễ dàng, chất sản phẩm phản ứng tái tạo Coenzym không ảnh hưởng tới hệ thống 315 oxyđoreductase Cơ chấi (A =Q) sàn phẩm (A H O H ) polyetylen giycol-NAD* Polyeihylen glycol-NADH + fp CO, (khí) ->• ^ : - HCOOH formal dehydrogenase kinase Cơ chất ( AOH) : _ dextran-ADP Dextran-ATP Axit acetic , sán pham ( AOPO-." ) acetal kinase acetyl phosphat 6.3.2.S Sử dụng enzynt phân tích, chẩn đốn điều trị Một lĩnh vực phát triển quan trọng công nghệ enzym sử dụng énzym phân tích - chẩn đốn điều trị Trong năm gần đây, kỹ thuật enzym tiếp cận phân tích chăn ni, trồng trọt, nghiên cứu sinh thái học công nghiệp thực phẩm đặc biệt việc sử dụng công cụ enzym chẩn đốn y tế vệ sinh mơi trường Việc sử dụng enzym y học đạt thành công hạn chế, chủ yếu phân tích chẩn đốn Việc sử dụng enzym tín hiệu cảnh báo điều trị gặp nhiều khó khăn, chủ yếu là: - Các enzym polyme lớn, khó đưa vào tế bào thể Đây lý hạn chế khả khai thác việc sử dụng enzym chẩn trị bệnh di truyền Nhiều phương pháp phát triển áp dụng để giải vấn đề cách sử dụng enzym hướng đích Ví dụ enzym với liên kết cộng hóa trị gắn vào gốc galactose có tác dụng hướng đích tế bào gan, enzym với liên kết cộng hóa trị gắn kháng thể đơn dịng đặc hiệu sử dụng để tránh hiệu ứng phụ tính khơng đặc hiệu, gây nên 316 - Do có chất protein, enzym vào thể có thê đóng vai trị kháng ngun cảm ứng phản ứng miễn dịch thê Điều gây nên phản ứng dị ứng đặc biệt sử dụng thời gian dài Trong vài trường hợp giải vấn đề cách biến đổi enzym thành chất khơng cịn chất protein nhờ liên kết cộng hóa trị Khi ấy, enzym thể hoạt tính chống khối u không gây nến đáp ứng miễn dịch Tuy nhiên việc sử dụng enzym cần đàm bảo khơng kèm theo độc tố Chính mà enzym động vật sử dụng phổ biến enzym vi sinh vật cho dù giá thành chúng cao enzymvi sinh vật - Các enzym kéo dài thời gian bán hủy nhờ phương pháp khác nhau: tạo liên kết cộng hóa trị, bao enzym lớp vỏ nhân tạo Tuy thời gian hoạt động enzym cải thiện song gây nên phản ứng miễn dịch tạo cục máu đông Các enzym sử dụng chẩn đốn, điều trị cần có độ tinh đặc hiệu cao Các giá trị Km phải thấp Vmax cao để đạt hiệu sử dụng nồng độ enzym chất thấp Gia thành chế phẩm enzym cao cạnh tranh với hóa trị đắt tiền 6.3.2.6 Bảo vệ mơi trường Việc sử dụng enzym quan trọng công tác bảo vệ môi trường sử dụng enzym “công nghệ cuối đường ống7’- xừ lý chất thải, chuyển chất thải thành sản phẩm có ích, công nghệ tái sừ dụng phế thải, chuyển phế thải thành sản phẩm có ích Trong trường hợp enzym sừ dụng dạng chế phẩm kỹ thuật Ngồi ra, mơi trường chứa nhiều thành phân khác nên địi hỏi enzym phải có độ đặc hiệu cao Chính yêu cầu đặt thách thức lớn cho việc sử dụng enzym công tác bảo vệ môi trường Một xu hướng bảo vệ môi trường sử dụng enzym mục đích phát triên cơng nghiệp bền vững Người ta hy vọng enzym giúp phát triển chiến lược sàn xuất sử dụng nguyên liệu tái chế, thay kỹ thuật sử dụng hóa chất vật liệu trình sinh học 317 Cơng nghệ enzym giai đoạn chín mùi để phát triển Lý thuyết enzym tích lũy Việc sử dụng enzym nhân rộng nghiên cứu, công nghiệp ngày tìm thấy ứng dụng đặc biệt khơng thể thay Tuy vậy, cịn nhiều khoảng trống kiến thức enzym phưcmg diện lý thuyết thực nghiệm Việc phát enzym tự nhiên hệ sinh thái thiết kế enzym phía trước 318 X ài Liệu Tham Khảo Aehle Wolgang, 2004 Enzyme in industry, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co.kgaA Andres Illanes, 2008, Enzyme Biocatalysis, Applications, Springer Science Publishing Anthony P Turner F, 1996, Biosensors: Past, Present and Future, Institute of Bioscience and Technology Ashok Mulchandani, 2008, Principles of Enzyme Biosensors, vol : Enzyme and Microbial Biosensors Byong H Lee, 1996, Fundamentaks of Food Biotechnology, VCH Publisher Bommarius, A S, Riebel B R, 2004, Biocatalysis and Applications Wiley -V CH Verlag GmbH and Co.kgaA Campbell, C N, Gal D, Cristies N, Barditrat C, 2002, Enzyme amplified amperometric Sandwich test for RNA and DNA - Anal chem, ppl58-162 Erika Kressroger, 1997, Handbook of Biosensors and Electronic Noces Medicine, Foof and the Environment CRC Press FOX P.F, 1991, Food Enzymology-Vol2-Elivier Science Publishers LTD 10 Georgres Hennen, 1998, Biochimie l Lr Cycle, Dunod, Paris 11 Gerard Coutouly, 1991, Genie Enzymaticque CO-Edition MassonDoin Principles and 12 Graham Romsay, 1998, Commercial Biosensors-Application to Chilical Bioprocess and Environment Samples, Chem, Anal Vol 148 13 Hideaki Nakamura, Isao Karube, 2003, Current Reseach Activity in Biosensors Anal Bianal Chem 377 14 Josh Haacker, 1997, Immobilized Enzyme Weiley, Chichester 319 15 Jacquer-Henry Well, 1997, Biochimie General, Masson Paris 16 Kiyoshi Toko, 2000, University Press Biometric Sensor Technology Cambridge 17 Lehniger, A L, 2004, Principles of Biochemistry, 4lh Edition, U H Freeman 18 Martin Chaplin, Christopher Bucker, Cambridge Unviversity Press 1990, Enzym Technology, 19 Nicholas, Price, Lewis Stevens, 1984, Fundamentals of Enzymology Oxford University Press 20 Publications of “ 2001 Annual Meeting and Food Expo” -6-2002 Anaheim, California, Session 76A-Biotechnology 21 R.Monsan.G, Durand, 1985, Biochimie Appliquée 22 320 Wang D.I.C, Cooney C.L, Demain A.L, 1979, Fermentation and Enzyme Technology, W iley, New York / C r r ! ... ứng enzym nguyên tắc làm việc điện cực enzym nào? Phạm vi hiệu sử dụng enzym kinh tế quốc dân nào? Các vấn đề nêu trình bày chương sau sách ? ?Công nghệ enzym? ??: Chương Công nghệ thu chế phẩm enzym. .. phản ứng enzym - PGS Tô Kim Anh Chương ứng dụng chế phẩm enzym triển vọng công nghệ enzym: - ứng dụng chế phẩm công nghệ thực phẩm - PGS Phạm Thu Thủy - ứng dụng chế phẩm enzym số ngành công nghiệp... PGS Nguyễn Xuân Sâm - Triển vọng công nghệ enzym - PGS Tổ Kim Anh Cuốn sách giáo trình học tập cho sinh viên học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm đại học Bách Khoa Hà