Chuong i CONG NGHE THU CHE PHAM ENZYM

Email: duynguyenvan_1978@yahoo.com.vn DD: 0915.384.836 0966.667.557 N I DUNG Ch ơng I CỌNG NGH THU CH PH M ENZYM (7T) Ch ơng II ENZYM C Đ NH (5T) Ch ơng III Đ NG H C PH N NG ENZYM (5T) Ch ơng IV ĐI N C C SINH H C (3T) Ch ơng V THI T B PH N Ch ơng VI NG ENZYM (1T) NG D NG CH PH M ENZYM (3T) TH O LU N (12T) N I DUNG I Khái quát v enzym II Các đ n v ho t đ c a enzym III Ngu n nguyên li u thu enzym IV Ph ng pháp thu ch ph m enzym vi sinh v t V M t s quy trình tách tinh ch enzym I KHÁI QUÁT V ENZYM I.1 Khái ni m enzym • Là chất xúc tác sinh h c có b n chất protein • Hịa tan n ớc dung d ch mu i lỗng • Kh i l ng phân tử: lớn: từ 20.000 ậ 1.000.000 Da nên không qua đ c màng bán thấm I KHÁI QUÁT V ENZYM I.2 M t s tính chất c a enzym • B bi n tính ho t tính xúc tác d ới tác d ng c a y u t : axit đặc, kiềm đặc, mu i kim lo i nặngầ • C ờng l c xúc tác lớn: vph n ng cao gấp 108-1011 l n so với khơng có s xúc tác Ví d : mol catalase phân h y đ c 5.106 mol H2O2/phút, 1mol Fe3+ ch phân h y đ c 10-6 mol H2O2/phút • Tính đặc hi u cao: ch xúc tác chuyển hóa m t m t s lo i chất theo m t kiểu ph n ng đ nh Do đó, ph n ng enzym th ờng không t o s n ph m ph I KHÁI QUÁT V ENZYM I.2 M t s tính chất c a enzym • Xúc tác điều ki n “êm d u”: nhi t đ th ờng từ 30-50oC, pH trung tính áp suất th ờng nên khơng địi h i thi t b ph n ng đắt tiền, có kh ch u nhi t, ch u áp suất cao, ch u axit ch u kiềm • Tất các enzym có nguồn g c t nhiên khơng đ c nên có ý nghĩa quan tr ng công ngh th c ph m y h c • Th ờng đ c s n xuất từ nguyên li u d tiền nên gi m đ c giá thành s n ph m ki m, rẻ II CÁC Đ N V HO T Đ C A ENZYM Đơn vị IU ( đơn vị quốc tế): Là l ng enzym có kh xúc tác chuyển hóa µM chất sau thời gian phút đktc IU = μM chất ( 10-6 M/phút) Đơn vị katal (kat): Là l ng enzym có kh xúc tác chuyển hóa m t mol chất sau thời gian m t giây điều ki n tiêu chu n kat = mol chất/giây IU = 1/60 10-6 kat = 16,67 nkat Hoạt độ riêng: Ho t đ riêng c a m t ch ph m enzym đ c biểu di n s đơn v ho t đ enzym đơn v kh i l ng protein IU kat /1 mg (ml) protein Hoạt độ phân tử (hoặc hoạt độ riêng phân tử): Đ c biểu di n s phân tử chất đ c chuyển hóa m t phân tử enzym sau m t đơn v thời gian (th ờng phút) Hoạt độ tâm xúc tác: Là s phân tử chất b chuyển hóa m t trung tâm ho t đ ng sau m t phút III NGU N NGUYÊN LI U THU ENZYM • Đ ng v t: ch y u ph dày, t y t ng, ru t, ganầ ph ph m lị mổ: d • Th c v t: nh a đu đ , nh a h Ficus, d a, giá đ uđ ầ • Vi sinh v t: nguồn thu enzym ch y u: vi khu n, nấm men, nấm s i,ầ III NGU N NGUYÊN LI U THU ENZYM u điểm c a nguồn thu enzym vi sinh v t: • Có thể thay đổi h enzym cách thay đổi điều ki n nuôi cấy sử d ng tác nhân điều ch nh Bằng cách vi sinh v t sinh tổng h p m nh m t m t vài enzym theo ý mu n • Kh sinh s n nhanh, phát triển m nh sinh tổng h p enzym với v n t c lớn nên cho phép thu đ c m t l ng lớn enzym kho ng thời gian ngắn m t cách d dàng • Kh chuyển hóa m nh nên ho t tính c a enzym vi sinh v t m nh, v t xa so với enzym khác Th m tích làm đặc dung d ch enzym Làm đặc k t tinh enzym • Protein b k t tinh dung d ch có nồng đ mu i đ m đặc • Do v y, làm tăng nồng đ mu i m t cách từ từ cho đ n hình thành v n đ c protein k t tinh đ c chúng Lo i mu i th ờng đ c sử d ng k t tinh protein (NH4)2SO4 • Các ph ơng pháp làm tăng nồng đ mu i th ờng dùng: Bổ sung dung d ch mu i đ m đặc vào dung d ch protein theo gi t Thêm mu i qua màng bán thấm Cho bay dung d ch protein • Sau hình thành v n đ c protein, dung d ch đ c đặt vào m t nơi đồng thời tăng từ từ nồng đ dung d ch mu i Bằng cách thu đ c tinh thể protein có chất l ng t t Quá trình k t tinh th ờng kéo dài vài ngày, th m chí hàng tu n Đánh giá đ tinh sach c a ezym n di Cơ sở: Trong dung d ch đ m có đ pH xác đ nh, m i protein có tổng n tích xác đ nh => D ới tác d ng c a n tr ờng m t chiều, protein có tổng n tích khác s di chuyển với t c đ khác nên phân b thành băng v trí khác b n n di N u ch có m t lo i protein: ch có băng gel N u có nhiều lo i protein có n tích tổng s khác nhau: có nhiều băng khác Lo i gel th ờng đ c sử d ng n di protein gel polyacrylamide có ch a SDS (SDS-PAGE) V M T S QUY TRỊNH TÁCH VẨ TINH CH ENZYM 5.2.4.1 Enzym th c v t: papain 5.2.4.2 Enzym đ ng v t: pepsin 5.2.4.3 Enzym vi sinh v t: endo-β-1,4-mannanase V.1 Enzym th c v t: papain Ngu n thu • Nh a đu đ (ch y u) • Nh a h c Ficus: sung, si, v • Từ nh a đu đ bao gồm protease: papain, chymopapain, proteinase III, proteinase IV m t lyzozim lipase Cây đu đ (Carica papaya) V.1 Enzym th c v t: papain Cấu tao: • Ch a 15,5% 1,2% S • Gồm 212 aa (trong khơng ch a metionin) • M = 27.000 Da • Gồm chu i polypeptide: đ u N izolơxin, đ u C asparagin • Ch a g c cystein → ba c u ậS-S- (22 ậ 23, 56 ậ 95 153 ậ 200) m t g c amino axit ch a nhóm SH t v trí 25 • Trung tâm ho t đ ng bao gồm: nhóm SH c a Cys-25 N b c c a His -159 Cys-25 V.1 Enzym th c v t: papain Tính chất • Có tính chất endopeptidase + exopeptidase => th y phân h u nh liên k t h t liên k t peptit ( trừ liên k t c a prolin axit gluctamic) • Ch u nhi t: nh a khô: 105oC, 3h dung d ch: 82,5o C, 30 phút • PH: pH=4.5-8.5: bền 2h, bền vùng pH=7-8,5, bi n tính nhanh vùng pH12 • Chất ho t hóa papain: chất khử nh cystein, tioglyconic, Na2S2O3, • Chất c: chất có ho t tính oxy hóa: oxy, ozon, hydroperoxit, iodaxetat, iodaxetamit, p- chlomercury benzoat h p chất disulfua khác Do chúng ph n ng với nhóm ậSH c a trung tâm ho t đ ng c a papain làm kìm hãm s hoat đ ng c a enzym V.1 Enzym th c v t: papain Tách tinh ch V.2 Enzym đ ng v t: pepsin Nguồn thu: Màng nhày d dày đ ng v t V.2 Enzym đ ng v t: pepsin Cấu t o • Ch a N= 14,7%, • Có c u ậS-S- g c axit phosphoric k t h p với nhóm ậOH c a Ser •Ch a nhiều amino axit axit • M t m ch polypeptide, đ u N isoleucin, đ u C alanin, cấu trúc b c hai •Trung tâm ho t đ ng: nhóm COOH c a axit aspactic Axit aspactic V.2 Enzym đ ng v t: pepsin Tính chất • Ho t đ ng m nh vùng pH 2- 4, pHt i u= 1,8-2,2 • Khá bền tr ng thái khô, c nhi t đ th ờng • B vơ ho t mơi tr ờng kiềm • Phân cắt 30%liên k t peptide c a protein → peptide ậ axit amin • Ch phân cắt liên k t peptide gi a amino axit kỵ n ớc với nhóm COOH c a g c axit glutamic, metionin, glyxin, cystein Ngoài cắt liên k t este V.2 Enzym đ ng v t: pepsin Tách thu nh n pepsin V.3 Enzym vi sinh v t: endo-β-1-4 mannanase từ Aspergillus niger Tính xúc tác xúc tác th y phân ng u nhiên liên k t -1,4-mannopyranosyl chu i mannan ( chu i polysaccharide d thể có thành phân ch y u là: mannobiose, mannotriose, mannoteraose ầ V.3 Enzym vi sinh v t: endo-β-1-4 mannanase từ Aspergillus niger Cấu t o • Kh i l ng: tùy thu c vào nguồn g c thu nhân - Từ nấm m c Sclerotium rolfsii : M = 46,5 kDa - Từ nấm m c A niger : M = 45 kDa - Từ vi khu n Themotoga neapolitana: M = 65 kDa - Từ Vibrio sp MA138: M = 139 kDa • Cấu trúc: Phân tử Man26A (từ A niger) cấu t o chu i xoắn  d i β Tâm ho t tính cấu t o g c amino axit nằm chu i β4, β5, β7 β8 V.3 Enzym vi sinh v t: endo-β-1-4 mannanase từ Aspergillus niger Tính chất Đặc tính khác tùy thu c nguồn g c thu nh n: • Từ A niger: - pHt - Tt - pI = 3.7 i u i u = 3, = 60oC A niger • Từ Sclerotium rolfsii: - pHt - Tt - pI = 2.75 i u i u = 3-3.5 = 75oC Sclerotium rolfsii V.3 Enzym vi sinh v t: endo-β-1-4 mannanase từ Aspergillus niger Thu nhân endo-β1,4-mannanase từ A niger ... a h Ficus, d a, giá đ uđ ầ • Vi sinh v t: nguồn thu enzym ch y u: vi khu n, nấm men, nấm s i, ầ III NGU N NGUYÊN LI U THU ENZYM u ? ?i? ??m c a nguồn thu enzym vi sinh v t: • Có thể thay đ? ?i h enzym. .. M ENZYM (3T) TH O LU N (12T) N I DUNG I Kh? ?i quát v enzym II Các đ n v ho t đ c a enzym III Ngu n nguyên li u thu enzym IV Ph ng pháp thu ch ph m enzym vi sinh v t V M t s quy trình tách tinh...N I DUNG Ch ơng I CỌNG NGH THU CH PH M ENZYM (7T) Ch ơng II ENZYM C Đ NH (5T) Ch ơng III Đ NG H C PH N NG ENZYM (5T) Ch ơng IV ? ?I N C C SINH H C (3T) Ch ơng V THI T B PH N Ch ơng VI NG ENZYM