Giáo trình SINH LÝ THỰC VẬT ỨNG DỤNG PGS.TS VŨ QUANG SÁNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I HÀ NỘI *** - Giáo trình SINH LÝ THỰC VẬT ỨNG DỤNG PGS.TS VŨ QUANG SÁNG (chủ biên) NGUYỄN THỊ NHẪN, MAI THỊ TÂN, NGUYỄN KIM THANH A +GA3 ð/C LỜI NĨI ðẦU Trong q trình phát triển mình, mơn khoa học Sinh lý thực vật có hai hướng nghiên cứu chính: - Hướng nghiên cứu Sinh lý – Hoá sinh: chuyên nghiên cứu chất trình sống xảy thể thực vật, từ tìm biện pháp điều khiển phần hay tồn q trình Sinh lý - Hố sinh theo hướng có lợi cho người điều kiện tự nhiên nhân tạo nghiên cứu trình quang hợp, cố định nitơ phân tử (N2) trình sinh trưởng, phát triển v.v… - Hướng nghiên cứu Sinh lý – Sinh thái: chuyên nghiên cứu mối quan hệ trình sinh lý yếu tố sinh thái (nước, nhiệt ñộ, ánh sáng, O2, CO2 dinh dưỡng, ñất…) Trên sở tìm quy luật hoạt động q trình sinh lý điều kiện sinh thái xác định nhằm xây dựng mơ hình sinh thái tối ưu cho trình sinh lý giúp sinh trưởng, phát triển cho suất cao, chất lượng tốt Sinh lý học thực vật cịn chia chuyên khoa: - Sinh lý thực vật ñại cương - Chuyên nghiên cứu chức sinh lý chung thực vật - Sinh lý thực vật chuyên khoa - Nghiên cứu quy luật sinh lý cho nhóm cây, Sinh lý trồng, Sinh lý rừng, Sinh lý ăn quả, Sinh lý lúa, đậu tương, Sinh lý ngơ, khoai tây v.v… - Sinh lý thực vật ứng dụng + Cơ sở biên soạn giáo trình Những năm gần ñây, Sinh lý học thực vật ngày tiếp cận với nhiệm vụ thực tiễn sản xuất nông nghiệp, lâm nghiệp, bảo quản chế biến nông sản v.v… có vai trị quan trọng cho ngành sản xuất Do khuôn khổ giáo trình Sinh lý thực vật có thời lượng giới hạn, khơng thể trình bày hết ứng dụng khả ứng dụng môn khoa học vào sản xuất, vấn ñề ứng dụng vào thực tiễn sản xuất người kỹ sư nông học cần trang bị.Trước bối cảnh mơn học Sinh lý thực vật ứng dụng ñời + ðối tượng nhiệm vụ môn học Sinh lý thực vật ứng dụng Hiểu rõ nguyên lý ứng dụng vào đối tượng trồng Vì vậy, nhiệm vụ Sinh lý thực vật ứng dụng nghiên cứu, ứng dụng quy luật sinh lý trồng ñã biết vào thực tiễn sản xuất : • Các kiến thức Sinh lý tế bào ñã ñang ñược ứng dụng rộng rãi, hiệu cơng nghệ nhân giống vơ tính trồng ñường nuôi cấy mô (in vitro), giâm chiết cành (in vivo) để cung cấp cho sản xuất giống có chất lượng cao • Các kiến thức trao đổi nước dinh dưỡng khống ứng dụng vào việc chuẩn đốn nhu cầu nước, dinh dưỡng cây.Từ ñó có biện pháp tưới nước, bón phân hợp lý ứng dụng công nghệ trồng khơng dùng đất, góp phần tạo nên nơng nghiệp bền vững • Các kiến thức quang hợp giúp ñưa biện pháp kỹ thuật ñiều khiển hệ quang hợp quần thể trồng ñể “kinh doanh” lượng ánh sáng mặt trời hiệu • Những kiến thức hơ hấp ñưa ñến biện pháp kỹ thuật bảo quản nơng sản phẩm ngâm ủ hạt giống, làm đất gieo hạt • Sự hiểu biết sinh trưởng, phát triển thực vật chất ñiều hồ sinh trưởng thực vật ứng dụng rộng rãi nơng nghiệp để điều khiển sinh trưởng, phát triển theo hướng có lợi cho người Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….1 Ngồi kiến thức hiểu biết Sinh lý học thực vật cịn ứng dụng điều khiển khai thác hệ sinh thái tối ưu, liên quan ñến việc bảo vệ môi trường bền vững + Kết cấu giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng: gồm chương Chương I : Nhân giống vơ tính trồng Chương II: ðiều khiển trao ñổi nước dinh dưỡng khống trồng Chương III: Trồng khơng dùng đất Chương IV: Quang hợp quần thể trồng Chương V: ðiều khiển hô hấp trồng trọt bảo quản nông sản phẩm Chương VI: Ứng dụng chất điều hồ sinh trưởng trồng trọt Chương VII: ðiều chỉnh phát sinh hình thái Trong trình biên soạn giáo trình chúng tơi kết hợp kiến thức Sinh lý học thực vật với hiểu biết ứng dụng khả ứng dụng mơn học sản xuất Do giáo trình khơng tài liệu học tập cần thiết cho sinh viên ngành nơng học mà cịn tài liệu tham khảo cho tất quan tâm đến lĩnh vực Tuy nhiên, giáo trình biên soạn lần đầu thời gian có hạn, lượng thơng tin cịn hạn chế nên biên soạn không tránh khỏi khiếm khuyết Chúng tơi mong nhận góp ý chuyên gia bạn ñọc ñể sách hồn thiện ðể học tốt mơn học này, nên tham khảo thêm số tài liệu sau: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB nông nghiệp, Hà Nội, 1997 Trần Minh Tâm Bảo quản chế biến nông sản sau thu hoạch NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2002 Nguyễn Quang Thạch, Hồng Minh Tấn Chất điều hồ sinh trưởng với trồng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1993 Vũ Văn Vụ Sinh lý thực vật ứng dụng NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999 Các tác giả Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….2 A PHẦN LÝ THUYẾT CHƯƠNG I NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY TRỒNG - Nắm khái niệm ưu nhược ñiểm hình thức nhân giống thực vật nói chung nhân giống trồng nói riêng Dựa vào khả nhân giống vơ tính thực vật tự nhiên để người vận dụng vào thực tiễn sản xuất công tác nhân giống vơ tính trồng Nắm sở khoa học ưu nhược ñiểm phương pháp nhân giống vơ tính trồng nhân tạo - Kỹ thuật nhân giống vơ tính trồng in vivo (phương pháp giâm, chiết cành; ghép cành): ưu nhược ñiểm, sở khoa học phương pháp, thao tác cụ thể Ứng dụng phương pháp sản xuất - Kỹ thuật nhân giống vơ tính trồng in vitro (phương pháp nhân giống vơ tính nuôi cấy mô tế bào): sở khoa học, ưu nhược ñiểm, ñiều kiện cần thiết kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật giai đoạn ni cấy mơ tế bào Ứng dụng vào thực tiễn sản xuất Một số khái niệm liên quan ñến nhân giống * Sinh sản (Reproduction) : khả sinh vật tái tạo hệ Phương thức sinh sản ña dạng ñều thuộc hai hình thức sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính Sinh sản hữu tính (Secxual reproduction) hình thức sinh sản có kết hợp giao tử đực để tạo thành phơi, sau phát triển thành thể hoàn chỉnh Sinh sản hữu tính tự phối tạp giao Sinh sản vơ tính (Asecxual reproduction) hình thức sinh sản khơng có kết hợp giao tử đực Sinh sản vơ tính trồng có hình thức sau : Sinh sản vơ phối (Agamic reproduction): phơi tạo khơng thụ tinh tế bào trứng tinh trùng, ñây tượng tự nhiên để tạo dịng vơ tính thơng qua hạt giống Sinh sản sinh dưỡng (Vegetative reproduction): khả tái tạo thể hoàn chỉnh từ phận tách rời khỏi thể mẹ thân, rễ, lá, củ, chồi Trong tự nhiên, nhiều loại trồng sinh sản vừa hình thức hữu tính, vừa hình thức vơ tính, có nhiều loại trồng sinh sản hình thức hữu tính vơ tính * Nhân giống (Propagation): biện pháp kỹ thuật mà người dùng ñể tái tạo cá thể cần thiết thơng qua hệ thống sinh sản Vì vậy, sử dụng hình thức nhân giống phương pháp hữu tính phương pháp vơ tính tuỳ vào mục đích loại trồng Nhân giống trồng phương pháp hữu tính + Khái niệm : nhân giống phương pháp hữu tính hình thức hình thành từ hạt Ðây hình thức nhân giống cổ truyền mà người sử dụng từ biết trồng trọt Hạt hình thành kết thụ tinh giao tử ñực (hạt phấn) với giao tử (nỗn) Từ hạt hình thành mang đặc tính bố mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo) nghiêng hẳn bố mẹ (trong trường hợp vơ phối) Hạt hình thành q trình tự thụ phấn hoa thụ phấn nhân tạo + Những ưu ñiểm Ưu ñiểm phương pháp nhân giống hữu tính Edwin F George (1993) tổng kết thành bốn điểm sau: - Phương pháp tiến hành ñơn giản tự nhiên nhân tạo mà không cần sử dụng dụng cụ thiết bị phức tạp Ðồng thời, phương pháp nhân giống hữu tính tạo nên ñược số lượng lớn giống nên giá thành giống thường rẻ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….3 - Hạt giống bảo quản ñược thời gian dài dụng cụ ñơn giản bao bì, chum, vại, chai, lọ tuỳ thuộc loại hạt rủi ro trình bảo quản thấp, hạt giống đảm bảo tỷ lệ sống cao - Dễ dàng vận chuyển phân phối khối lượng lớn hạt giống từ nơi sản xuất ñến nơi tiêu thụ - Các loại sâu bệnh virut phần lớn không lây truyền qua hạt nên giống mọc từ hạt bệnh + Những nhược ñiểm Nhược ñiểm lớn phương pháp nhân giống hữu tính đa số sinh từ hạt có tính trạng thay đổi so với mẹ, thay đổi ñại diện tổ hợp gen ñược hình thành trình phân bào giảm nhiễm Vì nhân giống phương pháp hữu tính thường khơng đồng khơng hồn tồn mang tính trạng mẹ Ðối với loại ăn quả, cơng nghiệp dài ngày nhân giống phương pháp hữu tính ngày giảm, người ta áp dụng hình thức trường hợp khó thành cơng phương pháp nhân giống vơ tính, loại có hạt đa phơi, sử dụng cho cơng tác lai tạo chọn lọc giống Nhân giống trồng phương pháp vơ tính Khái niệm : nhân giống vơ tính trồng phương pháp tạo từ quan, phận dinh dưỡng cành, thân, rễ, lá, củ Ðây hình thức nhân giống phổ biến nhiều loại trồng Q trình nhân giống vơ tính diễn tự nhiên nhân tạo 3.1 Nhân giống vơ tính tự nhiên Là hình thức nhân giống mà người lợi dụng khả sinh sản dinh dưỡng trồng, lợi dụng khả phân chia quan dinh dưỡng trồng để hình thành cá thể có khả sống độc lập với mẹ mang tính trạng mẹ Hình thức bao gồm : * Dùng thân bị lan : Ở phần mắt hai lóng, ñược tiếp xúc với ñất mọc rễ, phía mọc chồi để tạo thành hồn chỉnh, tách rời khỏi thể mẹ ñem trồng thành Biện pháp thường áp dụng ñối với số loại có tia thân dâu tây Biện pháp đơn giản loại tia thân bị đến đâu đốt hình thành mới, ta việc tách đem trồng (hình 1.1) Hình 1.1: Thân bị lan * Tách chồi : Chồi hình thành từ gốc thân có đầy đủ thân, lá, rễ Tuỳ loại trồng mà có loại chồi khác chồi thân (chuối), chồi ngầm (khoai nước, sen), chồi cuống quả, chồi chóp (dứa) Các chồi sau tách khỏi thể mẹ ñem trồng qua giai ñoạn vườn ươm * Nhân giống thân củ, thân rễ (thân sinh ñịa) : Trên thân loại sinh địa có mang chồi nhiều mắt chồi, mắt phát triển thành chồi thành hoàn chỉnh, dùng sinh địa để nhân giống hành, khoai tây, gừng, hoàng tinh 3.2 Nhân giống vố tính nhân tạo Là hình thức nhân giống vơ tính có tác động biện pháp học, hố học, cơng nghệ sinh học để ñiều khiển phát sinh quan phận rễ, chồi, hình thành hồn chỉnh hồn tồn có khả sống độc lập với mẹ Cây ñược tạo nên từ phương thức nhân giống mang hồn tồn đặc tính di truyền mẹ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….4 Người ta phân chia làm hai loại : -Nhân giống vơ tính thực điều kiện tự nhiên (in vivo), với hình thức này, giống tạo có kích thước lớn (Macro propagation) -Nhân giống vơ tính thực phịng thí nghiệm (in vitro), với hình thức giống có kích thước nhỏ (Micro propagation) Nhân giống vơ tính in vivo (Macro propagation) Nhân giống vơ tính in vivo tức q trình nhân giống thực điều kiện tự nhiên gồm hình thức tách cây, giâm cành, chiết cành, ghép mắt để tạo có đặc tính giống hệt mẹ * Cơ sở khoa học Tất loại thực vật có đặc tính tái sinh, tức là, tách rời quan phận khỏi mẹ lúc trạng thái ngun vẹn bị vi phạm, nhờ có đặc tính tái sinh mà có khả khơi phục lại trạng thái ngun vẹn Ðặc tính tái sinh thực vật lớn động vật nhiều Vận dụng đặc tính tái sinh thực vật mà người ñiều khiển trồng theo hướng có lợi biện pháp cắt tỉa tạo tán cho cảnh, lấy búp ; nhân giống vơ tính trồng Trong biện pháp nhân giống vơ tính trồng khả rễ bất ñịnh cành chiết, cành giâm liền vết ghép ñều dựa vào ñặc tính tái sinh ñể ñảm bảo tính nguyên vẹn Khi tách cành khỏi mẹ bị tính ngun vẹn mình, để khơi phục lại tính ngun vẹn mình, có khả sinh chồi ñể bù ñắp cành vừa ñi Ðồng thời cành tách khỏi mẹ lúc bị tính nguyên vẹn cây, tức là, cành bị thiếu phần rễ ñể trở thành hồn chỉnh, nên tự khơi phục tính ngun vẹn khả hình thành rễ bất ñịnh ñể trở thành hoàn chỉnh Hoặc ghép mắt nhờ khả tái sinh tế bào xung quanh phần bị cắt ñã làm liền vết thương tiếp nhận mắt ghép * Ưu ñiểm phương pháp nhân giống vơ tính in vivo Nhân giống vơ tính in vivo biện pháp giâm cành, chiết cành ghép mắt có số ưu điểm sau : - Tỷ lệ thành cơng nhân giống cao Các biện pháp giâm, chiết cành ghép mắt tỷ lệ tạo giống thường ñạt ñược từ 50% ñến 100% tuỳ theo ñối tượng trồng biện pháp áp dụng Hiện nay, người ta thường sử dụng chất ñiều tiết sinh trưởng ñể khích thích rễ bất định cho cành chiết cành giâm tỷ lệ rễ đạt tới 100% - Thời gian tạo giống nhanh Thông thường thời gian tạo giống kỹ thuật giâm, chiết cành ghép mắt từ vài ngày ñến vài tháng tuỳ theo ñối tượng trồng biện pháp áp dụng Bộ mơn Sinh lý thực vật- Trường đại học Nông Nghiệp I thành công kỹ thuật giâm cành nhiều loại ñối tượng trồng khoai tây, cẩm chướng, roi, bưởi, chanh sau từ đến ngày cành giâm rễ bất ñịnh sau khoảng 1- tuần giống đủ tiêu chuẩn xuất vườn - Tạo giống có kích thước lớn Cây giống tạo biện pháp giâm, chiết cành ghép mắt có kích thước lớn nhiều so với phương pháp nhân giống in vitro Kích thước giống khoảng từ ñốt ñến nhiều ñốt tuỳ thuộc vào ñối tượng trồng nhu cầu hệ số nhân giống - Cây giống mang đặc tính mẹ Biện pháp giâm chiết cành ghép mắt biện pháp nhân giống vơ tính nói chung, giống tạo thành từ quan dinh dưỡng mẹ nên có tuổi sinh học mẹ mang đặc tính di truyền mẹ - Thao tác trang thiết bị ñơn giản Kỹ thuật nhân giống vơ tính biện pháp giâm, chiết cành ghép mắt dễ dàng áp dụng cho ñối tượng lao ñộng nghề làm vườn Mọi thao tác quy trình giâm chiết cành ghép mắt đơn giản hồn tồn khơng u cầu thiết bị đại Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….5 4.1 Nhân giống vơ tính tách Mỗi thường có gốc rễ, nhiên, người sử dụng biện pháp kỹ thuật tác ñộng ñể phát sinh nhiều gốc, gốc có rễ riêng biệt, tách riêng gốc đem trồng thành Ví dụ biện pháp cưa gốc cho nảy chồi vun ñất vào gốc cho rễ, tách trồng Phương pháp chậm, hiệu thấp, tốn cơng nên áp dụng 4.2 Nhân giống vơ tính giâm, chiết cành Phương pháp giâm, chiết cành dựa khả hình thành rễ bất định cành giâm chiết ñược cắt rời khỏi mẹ Phương pháp thường áp dụng cho hai nhóm thân gỗ thân thảo vải, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, dứa, hoa cúc, cẩm chướng * Cơ sở khoa học hình thành rễ bất định Khi có tác động vào mẹ cắt cành giâm khỏi thể mẹ khoanh vỏ cành chiết lúc thể mẹ bắt đầu hoạt hố hình thành rễ bất định Yếu tố gây hoạt hố hình rễ bất ñịnh auxin Khi có tác ñộng cắt cành khoanh vỏ auxin hình thành cách nhanh chóng đỉnh sinh trưởng quan non, sau qua hệ thống mạch libe auxin vận chuyển phần vết cắt cành chiết, cành giâm để kích thích tạo rễ bất định Vì vậy, rễ bất ñịnh cành chiết, cành giâm nhanh hay chậm hoàn toàn phụ thuộc vào khả tổng hợp auxin nội sinh loại trồng Người ta xử lý bổ sung auxin ngoại sinh để thúc đẩy nhanh chóng rễ bất định cành chiết, cành giâm Sự hình thành rễ bất định q trình, q trình phản phân hố tế bào tiền tượng tầng, tiếp tái phân hố để hình thành mầm rễ (hình 2.1) Q trình hình thành rễ bất định chia làm ba giai đoạn : - Phản phân hố tế bào tiền tượng tầng ñể trở lại chức phân chia tế bào mô phân sinh tượng tầng ñể tạo khối tế bào bất ñịnh (callus) - Tái phân hoá tế bào rễ từ tế bào bất định để hình thành mầm rễ bất định - Mầm rễ sinh trưởng để hình thành rễ bất định Thơng thường, giai đoạn đầu hình thành rễ bất ñịnh cần lượng auxin lớn cho phản phân hố tế bào (10-4 - 10-5 g/cm3), giai đoạn thứ hai cần lượng auxin thấp cho tái phân hố mầm rễ (10 -7 g/cm3), cịn giai đoạn sinh trưởng rễ lượng auxin cần thấp (10-11 - 10-12 g/cm3) khơng cần auxin giai đoạn a b Hình 2.1: Sự phản phân hố tế bào tượng tầng để hình thành rễ bất định a, b Lát cắt dọc cắt ngang mầm rễ bất ñịnh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….6 Trong kỹ thuật giâm, chiết cành, người ta thường xử lý bổ sung chất thuộc nhóm auxin ngoại sinh để kích thích tạo rễ bất ñịnh nhanh hiệu IBA, α-NAA, 2,4D Tuỳ theo chất sử dụng loại trồng, tuỳ theo phương pháp xử lý mà nồng độ sử dụng khác Có ba phương pháp để xử lý auxin cho rễ bất ñịnh: - Phương pháp xử lý nồng ñộ loãng: nồng ñộ xử lý vào khoảng vài chục ppm Với phương thức giâm cành ngâm phần gốc vào dung dịch thời gian 12 ñến 24 cắm cành giâm vào giá thể Với phương thức chiết cành trộn dung dịch xử lý với đất bó bầu trước bó bầu xung quanh vết khoanh vỏ - Phương pháp xử lý nồng ñộ ñặc: nồng ñộ xử lý khoảng vài nghìn ppm Với phương thức giâm cành nhúng nhanh phần gốc vào dung dịch khoảng 1-2 giây cắm vào giá thể Với phương thức chiết cành dùng bơng tẩm dung dịch xử lý cần bôi lên vết khoanh vỏ (nơi xuất rễ) trước bó bầu - Sử dụng dạng bột: có nhiều chế phẩm giâm chiết cành dạng bột, thành phần có chứa auxin với tỷ lệ định ñược phối trộn với loại bột ñó Khi giâm cành cần chấm vết cắt cành giâm vào chế phẩm bột cắm vào giá thể a Nhân giống vơ tính chiết cành * Ưu điểm : - Cây dễ sống, sinh trưởng nhanh, mọc khoẻ - Cây mang đầy đủ đặc tính di truyền mẹ - Cây thấp, tán gọn nên thuận tiện cho chăm sóc thu hoạch * Nhược ñiểm : - Hệ số nhân giống không cao, sử dụng sản xuất nhỏ - Cây nhanh già cỗi, tuổi thọ vườn thấp, khả chống chịu với điều kiện bất lợi mơi trường khơng cao - Cây mẹ bị khai thác nhiều làm giảm tuổi thọ sức sống * Các hình thức chiết cành + Chiết cành biện pháp uốn vít cành Biện pháp uốn cành thường áp dụng cho ñối tượng thân bụi, thân thảo ñỗ quyên, kim ngân, ráy thơm Cách tiến hành : uốn vít cành xuống phủ ñất lên, sau thời gian phần phủ đất rễ (hình 3.1) Ðể kích thích rễ nhanh gây vết thương nhẹ lên cành uốn phần phủ ñất Cắt rời phần ñã rễ ñể tạo giống Hình 3.1: Biện pháp uốn vít cành + Chiết cành Ðây biện pháp áp dụng phổ biến cho nhóm thân gỗ loại ăn nhãn, vải hồng xiêm, chanh, roi, cam, quýt, bưởi ; nhóm cơng nghiệp chè, cà phê ; nhóm rừng bạch đàn, quế, hương cành từ ñược chiết ñến rễ bất định tạo hồn chỉnh cắt xuống ñem trồng Theo học thuyết chu kỳ tuổi Trailakhyan cành có tuổi sinh học khác Nếu cành có tuổi sinh học trung bình có khả tạo rễ bất định tốt cành có tuổi sinh học lớn q nhỏ Vì vậy, với mục đích nhân giống vơ tính kỹ thuật chiết cành người ta thường lựa chọn cành có tuổi sinh học trung bình hay cịn gọi cành bánh tẻ để chiết Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….7 Cách tiến hành: dùng dao sắc cắt hai khoanh vỏ cách khoảng 2-3 cm (hình 4.1 a,b) sau loại bỏ lớp vỏ ngoài, dùng dao sắc cạo lớp vỏ trắng đến tận phần gỗ (hình 4.1.c) Thường để phơi cành khoảng buổi ngày sau bó bầu Ðối với khó rễ hồng xiêm, mận, mơ, mít trước bó bầu ta nên xử lý cho vết khoanh vỏ (vết khoanh trên) dung dich auxin (α-NAA) 4000 -8000 ppm trộn dung dich auxin vào hỗn hợp bó bầu với nồng ñộ thấp (40 - 100 ppm) Nguyên liệu dùng để bó bầu thường sử dụng hỗn hợp đất vườn đất bùn ao Hình 4.1: Cách khoanh vỏ cành chiết phơi khơ, đập nhỏ trộn với số a,b khoanh vỏ c Bóc cạo lớp vỏ nguyên liệu hữu trấu bổi, mùn cưa, rơm rác mục , rễ bèo tây với tỷ lệ 2/3 ñất với 1/3 nguyên liệu hữu Ðảm bảo 70% độ ẩm hỗn hợp bó bầu Giây buộc Phía ngồi bầu chiết bọc giấy PE Buộc chặt hai ñầu bầu chiết vào cành để Hỗn hợp bó bầu khơng bị xoay xung quanh cành chiết bầu chiết Bọc giấy (hình 5.1) PE Hình 5.1: Cách bó bầu cành chiết a b Hình 6.1: Sự rễ bất định cành chiết ñủ tiêu chuẩn cắt a Ra rễ bất ñịnh b Cắt cành chiết Sau theo dõi qua lớp PE thấy rễ mọc phía ngồi bầu chuyển màu trắng nõn sang màu trắng ngà ngả màu xanh cưa cành chiết để trồng vào vườn ươm (hình 6.1 a,b) b Nhân giống vơ tính giâm cành * Ưu điểm : - Cây giữ đựơc tình trạng di truyền mẹ, vườn đồng thuận tiện chăm sóc, thu hoạch - Thời gian nhân giống tương ñối nhanh, hệ số nhân giống cao - Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu kinh tế cao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….8 * Nhược ñiểm : - Tuổi thọ vườn thấp, chu kỳ kinh doanh ngắn - Ðòi hỏi người sản xuất có trình độ kỹ thuật định - Tốn nhiều cơng chăm sóc * Các hình thức giâm cành Tuỳ theo ñối tượng trồng mục đích nhân giống mà người ta áp dụng hình thức giâm cành khác Sau số biện pháp giâm cành phổ biến cho ñối tượng trồng : + Giâm cành biện pháp cắt cành cắt thân Ðây biện pháp áp dụng phổ biến cho nhiều ñối tượng trồng, loại thân gỗ nhãn, vải, cam, chanh, bưởi, cà phê, chè ; loại rau, hoa thân thảo khoai tây, hoa cúc Một số thực nhân giống phương pháp cắt cành cắt thân quanh năm Trong số đặc biệt số thân gỗ thực vào mùa rụng mà ñang trạng thái ngủ nghỉ Cách tiến hành : dùng dao sắc cắt vát vị trí phía đốt cành đốt thân với kích thước tuỳ thuộc vào đối tượng trồng mục đích nhân giống Có thể cắt đốt đơn đốt kép (đối với có đối xứng) (hình 7.1 a,b,c,d) Loại bỏ bớt phần to Nhúng nhanh auxin (α-NAA vài nghìn ppm) vào vết cắt cần thiết, sau cắm vào giá thể giâm cành với chiều sâu khoảng 1cm ñặt nằm ngang lấp 1/2 thân vào giá thể (đối với mía, đay, mây ) Ðảm bảo độ ẩm thích hợp giá thể ñộ ẩm bão hoà bề mặt ñến xuất rễ bất định cành giâm Chăm sóc cẩn thận ñến xuất vườn (a) (b) (c) (d) Hình 7.1: Giâm cành biện pháp cắt cành, cắt thân a Cắt cành ; b Cắt thân nằm ngang ; c Cắt ñốt ñơn ; d Cắt ñốt kép Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….9 Hình 8.1: Giâm cành biện pháp cắt a Giâm nguyên vẹn b Giâm mẩu + Giâm cành biện pháp cắt Biện pháp ñược áp dụng ñối với loại cảnh, trồng chậu nhà, ñặc biệt thường sử dụng ñối với bỏng Có hai loại kiểu cắt : cắt tồn cắt mẩu (hình 8.1 a,b) Khi cắt rời khỏi mẹ rễ bất định hình thành phần cuống trực tiếp Cách tiến hành : Biện pháp thao tác quy trình tiến hành tương tự biện pháp cắt cành ñã nêu dùng phần ñể giâm Dùng dao sắc cắt mẩu lá gồm phần cuống khơng có cuống tuỳ theo loại cây, sau xử lý auxin vào vết cắt cần thiết Ðặt mẩu cắm phần cuống vào giá thể Sau thời gian phần cuống hình thành rễ bất định Nếu phần cuống có mắt ngủ mắt ngủ bật chồi hình thành tự phần hình thành chồi để thành mà khơng cần có mắt ngủ Trong kỹ thuật giâm cành cần ý : - Giá thể cát ẩm dùng ñể giâm cành tốt nhất, có nhiều loại cát cát thơ, cát mịn, cát ñen, cát vàng tuỳ theo ñối tượng trồng mà sử dụng loại cát cho thích hợp Cát có đặc tính trơ, nước xốp tạo ñiều kiện thuận lợi cho rễ Cát dùng làm giá thể phải ñể tránh nấm, khuẩn tạp chất làm chết cành giâm Thường sử dụng loại cát khai thác cát cũ phải rửa cách ngâm cát HCl thuốc tím vài sau rửa nhiều lần vòi nước - Cành giâm xảy q trình nước bề mặt cành giâm chưa có rễ để hút nước dẫn ñến cân nước, cành giâm bị héo chết Vì vậy, cần phải thường xuyên phun ẩm đảm bảo độ ẩm bão hồ bề mặt làm giảm nước cành giâm xuất rễ bất ñịnh 4.3 Nhân giống vơ tính phương pháp ghép Ghép phương pháp ñược thực cách lấy phận giống tốt, ñang sinh trưởng ñoạn cành, ñoạn rễ, mầm ngủ lắp ñặt vào vị trí thích hợp khác gọi gốc ghép để tạo thành tổ hợp ghép, sinh trưởng phát triển tạo nên hoàn chỉnh a Cơ sở khoa học phương pháp ghép Phương pháp ghép dựa vào đặc tính tái sinh liền vết thương Tế bào phần bị thương có khả tái phân chia liên tục thành ñám tế bào ñể liền vết thương tiếp nhận phần ñược ghép vào Khi ghép cần áp sát phần mô phân sinh tượng tầng phần ghép với gốc ghép, mơ phân sinh gốc ghép hoạt ñộng mạnh làm lấp ñầy chỗ trống hai vết cắt, tổ chức mô tế bào phần ghép gốc ghép hoà hợp, gắn với Hệ thống mạch Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….10 floem xylem dần ñược liên kết lại với thơng suốt Lúc này, chồi ghép cung cấp chất dinh dưỡng nước nên bắt ñầu sinh trưởng, gốc ghép chồi ghép trở thành thể Cây nhân giống phương pháp ghép hồn tồn giữ tính trạng mẹ b Mục đích ưu nhựơc điểm phương pháp ghép *Mục đích - Nhân giống vơ tính trồng trường hợp phương pháp nhân giống khác khó thực hiệu - Thay đổi phần phận phần phận giống khác - Tận dụng ưu ñiểm gốc ghép cho trồng cần nhân giống - Cải tạo phần bị hại (gãy, sâu bệnh) - Sử dụng phương pháp ghép ñể test chống chịu bệnh * Ưu điểm : - Giữ hầu hết tính trạng mẹ - Hệ số nhân giống cao, ghép có tuổi thọ cao - Có khả thay đổi giống cần mà khơng phải trồng (giống cũ, suất thấp, sâu bệnh ) cứu chữa phận hỏng (bị hại gốc, rễ dẫn tới chết tồn ghép để thay rễ) - Khai thác ưu ñiểm làm gốc ghép : khả sinh trưởng, khả chống chịu sâu bệnh ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn, úng, lạnh ) - Sử dụng công tác lai giống * Nhược ñiểm : - Cây sử dụng làm gốc ghép thường trồng hạt nên sinh trưởng khơng đồng khó chăm sóc -Cần đội ngũ kỹ thuật có trình độ am hiểu kỹ thuật ghép, giống trồng - Cần đầu tư nhiều cơng sức ñể chọn tổ hợp ghép thích hợp tuỳ theo loại trồng vùng ñịnh c Phương pháp ghép mắt Trong kỹ thuật ghép, có số hình thức ghép khác ghép áp, ghép cành, ghép mắt Tuỳ theo ñối tượng trồng mục đích ghép để lựa chọn hình thức ghép thích hợp Với mục đích nhân giống vơ tính trồng thường sử dụng hình thức ghép mắt Ghép mắt có nhiều kiểu ñược gọi theo vết rạch phần gốc ghép : ghép nêm, ghép chữ T, U, H, I, * Ưu ñiểm phương pháp : ghép mắt hình thức ghép phổ biến, áp dụng cho nhiều loại giống trồng khác Thao tác ñơn giản, thuận tiện Hệ số nhân giống cao Dễ dàng bảo quản vận chuyển vật liệu ghép * Cách tiến hành : - Lấy mắt ghép : chọn mắt ghép cành "bánh tẻ", khơng bị sâu bệnh (hình 9.1) Tách mắt ghép theo kiểu bóc vỏ (cành táo ), cắt vát phần mắt (cành chanh, bưởi, cam ) (hình 10.1 a,b,c,d) Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….11 Hình 9.1: Chọn a b mắt ghép cành Hình 10.1 a,b : Tách mắt ghép "bánh tẻ thân gỗ c d Hình 10.1 c,d : Tách mắt ghép họ cam chanh Hình 11.1: Buộc chặt mắt ghép vào a b gốc ghép Hình 12.1 a,b: Mắt ghép sau tháo dây buộc (a) nảy chồi (b) - Chuẩn bị gốc ghép : dùng dao sắc mở "cửa sổ" phần vỏ thân Bóc miếng vỏ vết khía Tiến hành đặt mắt ghép vào phía "của sổ" đậy cửa sổ lớp vỏ tách, chặt phần ghép dây nilon mỏng (tránh ñể nước mưa gấm vào bên trong) (hình 11.1) Sau khoảng 15-20 ngày mở dây buộc cắt miếng vỏ đậy phía ngồi miếng ghép (hình 12.1 a,b) Ðể kích thích mắt ngủ mọc mầm nhanh, sau mở dây buộc khoảng ngày tiến hành cắt gốc ghép Thường cắt gốc ghép cách mắt ghép khoảng 2-3 cm, nên cắt nghiêng khoảng 45o phía ngược chiều với mắt ghép để tránh nước nhỏ vào mắt ghép Phương pháp ghép "cửa sổ" có tỷ lệ sống cao khoảng từ 70100% tuỳ theo loại Nhân giống vơ tính in vitro (Micro propagation) Nhân giống vơ tính trồng in vitro hay vi nhân giống (Micro propagation) lĩnh vực ứng dụng có hiệu cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Ðây phương pháp nhân giống đại thực phịng thí nghiệm nên cịn gọi phương pháp nhân giống ống nghiệm Khác với phương pháp nhân giống truyền thống giâm, chiết cành ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả thời gian ngắn, tạo số lượng giống lớn đồng để phủ kín diện tích đất định mà phương pháp nhân giống khác khơng thể thay Ngồi phương pháp khơng phụ thuộc vào điều kiện thời tiết nên tiến hành quanh năm Ðây hướng ñang ñược ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam có nhiều phịng thí nghiệm ni cấy mơ, nhiều trung tâm sản xuất giống hàng nam ñã cung cấp lượng đáng kể giống có chất lượng cao cho sản xuất chuối, dứa, khoai tây, loại lan, cảnh, lâm nghiệp 5.1 Cơ sở khoa học phương pháp nhân giống vơ tính in vitro Kỹ thuật nuôi mô tế bào (tissue culture) nói chung kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro nói riêng dựa vào sở khoa học có tính tồn năng, phân hố phản phân hố a Tính tồn tế bào Haberland (1902) lần ñầu tiên ñã quan niệm tế bào thể sinh vật ña bào ñều có khả tiềm tàng ñể phát triển thành thể hồn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào chun hố chứa lượng thơng tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thơng tin di truyền thể Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….12 trưởng thành Vì vậy, điều kiện ñịnh tế bào ñều phát triển thành thể hồn chỉnh Ðặc tính tế bào gọi tính tồn tế bào Như vậy, tế bào hình thành hồn chỉnh ðó sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mơ tế bào (in vitro) nói chung kỹ thuật nhân giống vơ tính (clone-nhân bản) nói riêng Qua người ta biến tế bào (hoặc mẩu mơ) thành thể hồn chỉnh ni cấy mơi trường thích hợp có đầy đủ điều kiện cần thiết cho tế bào thực trình phân Hình 13.1: Sử dụng nuôi cấy loại mô hóa, phản phân hố (hình 13.1) b Tính phân hố phản phân hố tế bào + Tính phân hố tế bào biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chun hố đảm nhiệm chức khác Trong thể thực vật có khoảng 15 loại mơ khác đảm nhiệm chức khác (mơ dậu, mơ dẫn, mơ bì, mơ khuyết ) chúng có nguồn gốc từ tế bào phơi sinh ñã trải qua giai ñoạn phân hoá tế bào ñể hình thành mơ riêng biệt +Tính phản phân hố tế bào : tế bào phân hố thành mơ riêng biệt với chức khác ñiều kiện ñịnh chúng quay trở trạng thái phơi sinh để phân chia tế bào Ðó tính phản phân hố tế bào Trong kỹ thuật ni cấy quan dinh dưỡng lá, thân , giai đoạn tạo mơ sẹo (callus), tế bào quay trờ trạng thái phơi sinh có khả phân chia liên tục mà hẳn chức quan dinh dưỡng lá, thân trước Sự phân hóa phản phân hố tế bào phơi sinh tế bào chun hố biểu diễn theo sơ đồ sau: Phân hố tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào chun hố Phản phân hóa Về chất phân hố phản phân hố q trình hoạt hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể số gen hoạt hoá số gen khác bị ức chế Ðiều xảy theo chương trình mã hoá cấu trúc phân tử ADN Khi nằm thể hoàn chỉnh tế bào có ức chế lẫn nhau, tách rời điều kiện định gen hoạt hố dễ dàng nên chúng có khả mở tất gen để hình thành cá thể Ðó sở làm tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 5.2 Mục đích phương pháp nhân giống vơ tính in vitro Trong lĩnh vực nhân giống vơ tính in vitro kỹ thuật nhân nhanh giống trồng phục vụ mục đích sau : Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….13 - Nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác tạo giống - Nhân nhanh trì cá thể đầu dịng tốt ñể cung cấp giống các loại trồng khác lương thực, rau, hoa, cảnh, dược liệu, lâm nghiệp - Nhân nhanh kết hợp với làm virút - Bảo quản tập đồn gen, đặc biệt loại dễ bị nhiễm bệnh ñiều kiện tự nhiên (khoai tây, khoai lang,) dễ bị giao phấn 5.3 Ưu, nhược ñiểm phương pháp nhân giống vơ tính in vitro Phương pháp nhân giống vơ tính in vitro E.F Gerge (1993) nêu lên số ưu, nhược điểm sau đây: a Những ưu ñiểm - Phương pháp nhân giống in vitro có khả hình thành số lượng lớn giống từ mơ, quan với kích thước nhỏ khoảng 0,1- 10 mm Trong phương pháp nhân giống truyền thống (giâm chiết cành) để tạo thành giống, phải sử dụng phần quan dinh dưỡng với kích thước từ 5-20 cm - Hoàn toàn tiến hành ñiều kiện vô trùng nên giống tạo ñược khơng bị nhiễm bệnh từ mơi trường bên ngồi - Sử dụng vật liệu virút có khả nhân nhanh số lượng lớn virút - Hoàn tồn chủ động điều chỉnh tác nhân điều chỉnh khả tái sinh thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt ñộ, chất ñiều tiết sinh trưởng theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên có khả sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn Hệ số nhân giống loại nằm khoảng từ 36 ñến 1012 / năm, khơng có kỹ thuật nhân giống vơ tính khác lại có hệ số nhân giống cao - Có thể tiến hành quanh năm mà khơng bị chi phối điều kiện ngoại cảnh thời vụ - Cây giống in vitro chưa có nhu cầu sử dụng bảo quản ñược thời gian dài ñiều kiện in vitro b Những nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn giống tạo có kích thước nhỏ đơi xuất dạng không mong muốn (biến dị, mọng nước) - Cây giống in vitro ñược cung cấp nguồn hydrat carbon nhân tạo nên khả tự tổng hợp vật liệu hữu (tự dưỡng) Ðồng thời, giống in vitro ni dưỡng bình thuỷ tinh bình nhựa nên độ ẩm khơng khí thường bão hồ Do đó, trồng ngồi điều kiện tự nhiên thường bị cân nước, gây tượng bị héo chết Vì vậy, trước chuyển từ ñiều kiện in vitro ñiều kiện in vivo, cần trải qua giai ñoạn "huấn luyện " để quen dần với điều kiện mơi trường bên ngồi có độ ẩm khơng khí thấp ánh sáng mạnh - Cần trang thiết bị ñại, kỹ thuật viên có tay nghề cao 5.4 Ðiều kiện cần thiết nuôi cấy in vitro * Ðiều kiện trước tiên vô trùng Tất khâu nuôi cấy ñều ñược trùng: dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) thao tác nuôi cấy Sự thành công hay thất bại công việc nuôi cấy mô phụ thuộc vào việc vô trùng Nếu có khâu khơng vơ trùng mẫu ni cấy bị nhiễm vi sinh vật nấm chết Khử trùng ñược thực phương tiện sau: - Nồi hấp : khử trùng nước có nhiệt độ áp suất cao Thường áp dụng tiệt trùng cho môi trường nuôi cấy, dụng cụ cấy (chai, lọ, panh, dao, kéo, bơng ) Với áp suất atm tương đương với 121oC khoảng thời gian từ 20 phút ñến 30 phút ñảm bảo khử trùng tốt - Tủ sấy: khử trùng nhiệt ñộ cao nên áp dụng khử trùng cho dụng cụ thuỷ tinh dụng cụ cấy mẫu kim loại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….14 - Phễu lọc vô trùng (Microspore): khử trùng qua phễu lọc có màng lọc kích thước nhỏ (0,2 µm), áp dụng dung dịch ñiều kiện nhiệt ñộ áp suất cao bị phân huỷ vitamin B2, gibberellin - Hoá chất khử trùng: áp dụng ñể khử trùng bề mặt mẫu cấy ñốt dụng cụ, thường dùng: Ca-hypocloride, Na-hypocloride, clorua thuỷ ngân (HgCl2), nước brôm, oxy già (H2O2), cồn * Phịng ni cấy mơ phịng thí nghiệm chun hố cao với thiết bị chuyên dụng Bao gồm phịng chuẩn bị mẫu, phịng cấy mẫu, phịng ni nhà lưới ñể ñưa ñất Tuỳ theo quy mơ mục đích mà diện tích phận khác Các thiết bị quan trọng phịng ni cấy mơ gồm có nồi hấp để vơ trùng dụng cụ mẫu nuôi cấy, máy cấy vô trùng để thao tác cấy mẫu, phịng ni có đủ ánh sáng nhân tạo điều hồ nhiệt độ để ni Hình 14.1 đến hình 17.1 Trang thiết bị phịng ni cấy mơ Bộ mơn Sinh lý thực vật - khoa Nông học- ðHNNI a Tủ sấy (khử trùng khô) b Nồi hấp (khử trùng ướt) c Cân phân tích , cân kỹ thuật d Máy đo pH Hình 14.1 (a,b,c,d): Các thiết bị phịng chuẩn bị mơi trường Hình 15.1: Tủ cấy mẫu vơ trùng (a.Tủ cấy đơn ; b.Tủ cấy ñôi) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….15 Hình 16.1: Buồng ni cấy Hình 17.1: Vườn ươm - Mơi trường ni cấy giá thể có đầy đủ chất dinh dưỡng, hoạt chất nguyên tố vi lượng, vitamin, chất điều hồ sinh trưởng Tuỳ theo loại quan nuôi cấy mà người ta có mơi trường riêng cho chúng Ví dụ: Môi trường môi trường MS (Murashige Skoog) cho nhiều đối tượng trồng, mơi trường Adnerson cho thân gỗ, môi trường Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần, môi trường CHU cho nuôi cấy bao phấn 5.5 Thành phần môi trường dinh dưỡng Năm 1898, Haberland đề xướng tính tồn tế bào ơng tiến hành thí nghiệm ni cấy mơ thí nghiệm khơng thành cơng Khi hiểu biết nhu cầu dinh dưỡng khống mơ tế bào thực vật cịn hạn chế, đặc biệt vai trị chất ñiều tiết sinh trưởng chưa ñược khám phá Ðến ñã có hàng trăm loại mơi trường dinh dưỡng nhân tạo xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại mơi trường bao gồm nhóm chất sau ñây: + Các loại muối khoáng + Nguồn carbon hữu + Vitamin + Chất ñiều tiết sinh trưởng + Nhóm chất tự nhiên + Chất làm đơng mơi trường a Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng môi trường dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật phân chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng : nhóm ngun tố đa lượng nhóm nguyên tố vi lượng * Các nguyên tố khống đa lượng Bao gồm ngun tố khống có thành phần dinh dưỡng môi trường với nồng ñộ 30 ppm (part per million) Gồm nguyên tố : N, P, K, S, Mg, Ca - Nitơ (N) : ñược sử dụng dạng NO3- NH4+ riêng rẽ phối hợp hai loại - Lưu huỳnh (S): thường sử dụng dạng SO42- loại SO3 SO2 thường tác dụng, trí cịn độc - Phospho (P) : mơ tế bào ni cấy có nhu cầu phospho cao Phospho thành phần cấu trúc phân tử axit nucleic phân tử lượng ATP Ngoài phospho dạng H2PO4 HPO4 cịn có tác dụng hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH mơi trường q trình ni cấy - Kali can xi (K Ca): dạng ion K+ , Ca2+ tế bào mơ dễ dàng hấp thu đồng hoá * Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm ngun tố có thành phần dinh dưỡng mơi trường ni cấy với nồng độ thấp 30 ppm Ðó nguyên tố : Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….16 - Sắt (Fe) : sắt thường tạo phức với thành phần khác làm khả giải phóng ion sắt cho nhu cầu Vì vậy, thường sử dụng sắt dạng phức chelat với citrat với EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) Từ phức sắt ion Fe giải phóng phạm vi pH rộng Sắt ñịnh khả phân chia tế bào Thí nghiệm với sắt đánh dấu đồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy sắt ñược dự trữ nhân tế bào nhiều Thiếu sắt làm giảm lượng ARN giảm khả sinh tổng hợp protein, làm tăng lượng AND - Bo (B) : đóng vai trị quan trọng hình thành nên thành tế bào màng tế bào thực vật Nếu thiếu Bo ức chế phát sinh rễ thứ cấp ức chế sinh trưởng chiều dài rễ Bởi vì, thiếu Bo kích thích hoạt tính enzym IAA oxidaza nên hàm lượng IAA bị giảm Thiếu Bo mơ ni cấy chuyển hố thành mơ sẹo, thường mô sẹo xốp, mọng nước, khả tái sinh chồi - Ðồng (Cu): hấp thu dạng ion Cu2+ Khoảng 50% Cu2+ có mặt lục lạp Ðồng thành phần số enzyme, thành viên chuỗi vận chuyển ñiện tử hệ thống quang hoá I II quang hợp Vì vậy, thiếu đồng làm giảm nhanh chóng hoạt ñộng quang hợp - Mangan (Mn) : thiếu Mn làm cho hàm lượng amino axit tự ADN tăng lên, lượng ARN khả sinh tổng hợp protein bị giảm dẫn ñến khả phân bào Mangane xúc tác cho phản ứng quang phân ly nước quang hợp - Molypden (Mo) : ion đóng vai trị co-factor hệ thống nitrat reductaza, vậy, Mo đóng vai trị quan trọng q trình trao ñổi ñạm tế bào - Kẽm (Zn) : ion tham gia vào en zyme tổng hợp ARN, ARN-polimeraza chứa hai ion Zn Nồng ñộ Zn thấp làm tăng hoạt ñộng en zyme phân giải ARN (RNAse) Xúc tác cho phản ứng tổng hợp IAA - Coban (Co): có vai trị quan trọng q trình có định nitơ, tổng hợp ARN methionine b Nguồn carbon hữu cơ: mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, sống bán dị dưỡng nhờ vào khả quang hợp ñiều kiện ánh sáng nhân tạo, yếu nên khơng đủ nguồn carbon hữu cho sinh trưởng phát triển Vì vậy, mơi trường ni cấy cần bổ sung nguồn carbon hữu thường dùng saccaroza với liều lượng 2-3% Trong số trường hợp ñặc biệt nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần dùng glucoza, maltoza, galactoza c Vitamin Mặc dù mô tế bào nuôi cấy in vitro có khả tự tổng hợp loại vitamin cần thiết, thường khơng đủ lượng, phải bổ sung thêm từ bên ngồi vào, ñặc biệt vitamin thuộc nhóm B với nồng ñộ khoảng ppm + Vitamin B1 (Thiamin HCl) : khử trùng mơi trường nồi hấp nhiệt độ áp suất cao bị phân tách thành pyrimidin thiazol sau tế bào lại có khả tổng hợp chúng lại thành vitamin B1 + Vitamin B2 (Riboflavin): khử trùng nhiệt lại dễ bị ánh sáng làm phân giải Ðối với nuôi cấy ngồi sáng dùng nồng độ 0,01 ppm ni cấy tối tăng lên 10-15 ppm + Vitamin B6 (Pyridoxin): tiền thân pyridoxalphosphat - cofactor nhóm enzym carboxylaza transaminaza Khi hấp nhiệt ñộ cao xảy phản ứng : pyridoxin + phosphat > pyridoxalphosphat + Mio Inositol : có vai trị quan trọng cho phân chia tế bào thúc đẩy hình thành thành tế bào (sinh tổng hợp polygalacturonic axit pectin) Thường sử dụng nồng ñộ cao 50-100 ppm Trong nước dừa có inositol + Pantotenic axit : thành phần coenzym A Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….17 d Nhóm chất tự nhiên Các nhà sáng lập ngành ni cấy mơ trước thường sử dụng mơi trường dinh dưỡng đơn giản bào gồm muối khống đường Ngày người ta khẳng định loại mơi trường đơn giản chưa đủ cho tế bào sinh trưởng tốt Vì vậy, thành phần mơi trường ngày phong phú, đầy đủ phức tạp Người ta ñã bổ sung vào mơi trường số nhóm chất tự nhiên nhằm làm gia tăng thành phần dinh dưỡng có chất có hoạt tính sinh lý nên kích thích sinh trưởng phát triển in vitro Thường bao gồm : + Nước dừa: theo kết phân tích thành phần nước dừa Tulecke ctv (1961) cho thấy nước dừa có nhiều nhóm chất cần thiết cho sinh trưởng tế bào : Axit amin, axit béo, axit hữu cơ, ñường, ARN, ADN, myo inositol, chất có hoạt tính auxin, glucosit xytokinin + Dịch chiết nấm men: White (1934) lần ñầu tiên ñã nuôi cấy thành công rễ cà chua mơi trường có dịch chiết nấm men Thành phần dịch chiết nấm men gồm có : đường, nucleic axit, amino axit, vitamin, axin, khoáng Tác dụng dịch chiết nấm men cho sinh trưởng rễ tốt với mơ sẹo khơng tốt + Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha) : chứa chủ yếu số đường, vitamin số chất có hoạt tính điều tiết sinh trưởng + Dịch chiết số loại rau, tươi (khoai tây, chuối, cà rốt ) thành phần có đường, axitnucleic, axit amin, vitamin, khống e Chất làm đơng mơi trường (Agar) Agar - loại polysacarit tảo (chủ yếu tảo hồng- Rodophyta) Agar ngâm nước 80oC chuyển sang dạng sol 40oC trở trạng thái gel Khả ngậm nước agar cao (6-12 g/ 1lit nước) Tuy trạng thái gel agar ñảm bảo cho ion vận chuyển dễ dàng Vì vậy, thuận lợi cho hút dinh dưỡng tronng ni cấy mơ g Chất điều tiết sinh trưởng Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng ñịnh ñến kết ni cấy in vitro chất điều tiết sinh trưởng Nhóm nhà khoa học Netherandl giáo sư F.T.M Kors chủ biên "Catalo 20002001" tóm tắt vai trị chất điều tiết sinh trưởng ni cấy mơ theo bảng đây: CHẤT ÐIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG VAI TRỊ TRONG NI CẤY MƠ NHĨM AUXIN Indol-3acetic axit (IAA) - Phát sinh rễ bất ñịnh (ở nồng ñộ cao) Indol-3butyric axit (IBA) -Phát sinh chồi bất ñịnh (ở nồng ñộ thấp) Naphthaleneacetic axit (NAA) - Tạo phơi vơ tính(2,4D) Phenylacetic axit (PAA) - Phân chia tế bào 2,4 dichlorophenoxyacetic axit (2,4D) - Phát sinh sinh trưởng callus 2,4,5 trichlorophenoxyacetic axit (2,4,5T - ức chế bật chồi bên P-chlorophe noxyacetic axit (CPA) - Ức chế sinh trưởng rễ CYTOKININ Zeatin (Z) -Phát sinh chồi bất ñịnh (ở nồng ñộ cao) Zeatinriboside (ZR) - ức chế phát sinh rễ Isopentenyladenin (iP) - Thúc ñẩy phân chia tế bào Isopentenyladenosin (iPA) - Kích thích bật chồi bên 6- benzylaminoburin (BAP) - Ức chế kéo dài chồi Kinetin - Ức chế hoá già Thidiazuron (TDZ) N(2-chloro-4pyridil)N'phenylurea (CPPU) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….18 Gibberellic Axit (GA3) Gibberellin (GA1) Gibberellin (GA4) Gibberellin (GA7) GIBBERELLIN - Vươn dài chồi, phá ngủ hạt, củ - Phá ngủ hạt, phơi vơ tính, chồi bên - ức chế phát sinh rễ bất định - Kích thích hình thành chất ức chế q trình trình tạo rễ, củ, rẻ hành ABSCISIC AXIT - Làm chín phơi vơ tính - Kích thích phát sinh chồi, củ - Ðiều khiển ngủ nghỉ ETHYLEN - Hố già - Làm chín POLYAMIN - Thúc ñẩy phát sinh rễ bất ñịnh - Thúc ñẩy phát sinh chồi - Thúc đẩy hình thành phơi vơi tính JASMONIC AXIT - Thúc đẩy phát sinh củ, dẻ hành - Làm tăng hình thành meristem h ðộ pH môi trường pH môi trường ni cấy thích hợp cho đa số loại trồng dao ñộng từ 5,5 6,0 Nếu pH thấp agar khơng đơng sau hấp khử trùng Khi pH 7 làm kết tủ số muối vô phân giải số chất hữu làm chết 5.6 Các phương pháp nhân giống vơ tính in vitro Có hai hình thức nhân giống vơ tính in vitro : + Nhân giống vơ tính cách tạo từ chồi nách, chồi đỉnh mơ phân sinh Tuỳ theo mục đích mà sử dụng nguồn để ni cấy chồi nách, chồi đỉnh mơ phân sinh Hình 18.1 Ni cấy chồi nách, chồi đỉnh Hình 19.1: Mơ phân sinh đỉnh (meristem) Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình Sinh lý Thực vật ứng dụng ……………………….19