Bài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụng

Bài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngBài giảng 81 Sinh lý thực vật ứng dụngHọc thuyết hoocmon ra hoa 71815 1 NHÂN GIỐ NG VÔ TÍNH Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Khoa Nông học Chuyên đề 1 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG 1 Một số khái niệm liên quan đến nhân giống  Sinh.

Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Khoa Nơng học NHÂN GIỚ NG VƠ TÍNH Chun đề NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY TRỒNG Một số khái niệm liên quan đến nhân giống    * Sinh sản (Reproduction) : khả sinh vật tái tạo hệ Phương thức đa dạng sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính + Sinh sản hữu tính (Secxual reproduction) có kết hợp giao tử đực > thành phôi ->thành thể hồn chỉnh Sinh sản hữu tính tự phối tạp giao + Sinh sản vơ tính (Asecxual reproduction) khơng có kết hợp giao tử đực cái, trồng có hình thức sau : Nhân giớng vơ tính trồng - Sinh sản vô phối (Agamic reproduction): phôi tạo không qua thụ tinh tế bào trứng & tinh trùng, tượng tự nhiên để tạo dịng vơ tính thơng qua hạt giống - Sinh sản sinh dưỡng (Vegetative reproduction): tạo thể hồn chỉnh từ phận tách rời khỏi thể mẹ thân, rễ, lá, củ, chồi Trong tự nhiên, nhiều loại trồng sinh sản vừa hình thức hữu tính, vừa hình thức vơ tính, có nhiều loại trồng sinh sản hình thức hữu tính vơ tính - PP + Những ưu điểm đơn giản tự nhiên nhân tạo mà không cần sử dụng dụng cụ thiết bị phức tạp mà lại tạo nên số lượng lớn giống nên giá thành rẻ - Hạt giống bảo quản thời gian dài dụng cụ đơn giản bao bì, chum, vại, chai, lọ tuỳ thuộc loại hạt rủi ro trình bảo quản thấp, hạt giống đảm bảo tỷ lệ sống cao - Dễ dàng vận chuyển phân phối khối lượng lớn hạt giống từ nơi sản xuất đến nơi tiêu thụ - Các loại sâu bệnh virut phần lớn không lây truyền qua hạt nên giống mọc từ hạt bệnh • Nhân giống (Propagation): biện pháp kỹ thuật mà người dùng để tái tạo cá thể cần thiết thông qua hệ thống sinh sản = hữu tính vơ tính ==>tuỳ vào mục đích loại trồng Nhân giống trồng phương pháp hữu tính + Khái niệm : nhân giống phương pháp hữu tính hình thức hình thành từ hạt Hạt hình thành kết thụ tinh giao tử đực (hạt phấn) với giao tử (nỗn) * Từ hạt hình thành mang đặc tính bố mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo) nghiêng hẳn về bố mẹ (trong trường hợp vô phối) * Hạt hình thành trình tự thụ phấn hoa thụ phấn nhân tạo + Những nhược điểm * Cây sinh từ hạt có tính trạng thay đổi so với mẹ, thay đổi đại diện tổ hợp gen hình thành q trình phân bào giảm nhiễm ==> thường khơng đồng đều khơng hồn tồn mang tính trạng mẹ * Ðối với loại ăn quả, cơng nghiệp dài ngày nhân giống phương pháp hữu tính ngày giảm, người ta áp dụng hình thức trường hợp khó thành cơng phương pháp nhân giống vơ tính, loại có hạt đa phơi, sử dụng cho cơng tác lai tạo chọn lọc giống 7/18/15 Nhân giống vô tính Nhân giống vô tính + Khái niệm : * Nhân giống vơ tính trồng phương pháp tạo từ quan, phận dinh dưỡng cành, thân, rễ, lá, củ * Ðây hình thức nhân giống phổ biến nhiều loại trồng diễn tự nhiên nhân tạo 3.1 Nhân giống vơ tính tự nhiên * Là lợi dụng khả sinh sản dinh dưỡng trồng để hình thành cá thể có khả sống độc lập với mẹ mang tính trạng mẹ Hình thức bao gồm: Nhân giớng vơ tính * Tách chồi : Chồi hình thành từ gốc thân có đầy đủ thân, lá, rễ Tuỳ loại trồng mà có loại chồi khác chồi thân (chuối), chồi ngầm (khoai nước, sen), chồi cuống quả, chồi chóp (dứa) Các chồi sau tách khỏi thể mẹ đem trồng qua giai đoạn vườn ươm • * Nhân giống thân củ, thân rễ (thân sinh địa) : • Trên thân loại sinh địa có mang chồi nhiều mắt chồi, mắt phát triển thành chồi thành hoàn chỉnh, dùng sinh địa để nhân giống hành, khoai tây, gừng, hoàng tinh Nhân giớng vơ tính in vivo Gồm hình thức : tách cây, giâm cành, chiết cành, ghép mắt để tạo * Dùng thân bị lan : Hình: Thân bò lan Biện pháp thường áp dụng số loại có tia thân dâu tây Biện pháp đơn giản loại tia thân bị đến đâu đốt hình thành mới, ta việc tách đem trồng 3.2 Nhân giống vô tính nhân tạo Là hình thức có tác động biện pháp học, hố học, cơng nghệ sinh học để điều khiển phát sinh quan, phận rễ, chồi, hình thành hồn chỉnh hồn tồn có khả sống độc lập với mẹ - Mang đặc tính di truyền mẹ Phân loại : - Nhân giống vơ tính thực điều kiện tự nhiên (in vivo) -> giống tạo có kích thước lớn (Macro propagation) - Nhân giống vơ tính thực phịng thí nghiệm (in vitro) -> giống có kích thước nhỏ (Micro propagation) Nhân giống vô tính in vivo 4.2 Ưu điểm phương pháp nhân giống vơ tính in vivo có đặc tính giống hệt mẹ 4.1 Cơ sở khoa học + Tất loại thực vật đều có đặc tính tái sinh, tức là, tách rời quan phận khỏi mẹ lúc trạng thái nguyên vẹn bị vi phạm, nhờ có đặc tính tái sinh mà có khả khơi phục lại trạng thái ngun vẹn + Ðặc tính tái sinh thực vật lớn động vật nhiều Vận dụng đặc tính tái sinh thực vật mà người điều khiển trồng theo hướng có lợi biện pháp cắt tỉa tạo tán cho cảnh, lấy búp ; nhân giống vơ tính trồng + Trong biện pháp nhân giống vơ tính trồng khả rễ bất định cành chiết, cành giâm liền vết ghép đều dựa vào đặc tính tái sinh để đảm bảo tính nguyên vẹn ===> Tạo hoàn chỉnh - Tỷ lệ thành công cao + Đạt từ 50% đến 100% tuỳ theo đối tượng trồng biện pháp áp dụng + Hiện nay, sử dụng chất điều tiết sinh trưởng để khích thích rễ bất định cho cành chiết cành giâm tỷ lệ rễ đạt tới 100% - Thời gian tạo giống nhanh Từ vài ngày đến vài tháng tuỳ theo đối tượng biện pháp áp dụng 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ Nhân giống vô tính in vivo 4.2 Ưu điểm phương pháp nhân giống vơ tính in vivo - - Tạo giống có kích thước lớn Cây giống có kích thước lớn nhiều so với phương pháp nhân giống in vitro (từ đốt đến nhiều đốt tuỳ thuộc vào đối tượng trồng nhu cầu hệ số nhân giống) - Cây giống mang đặc tính di truyền có tuổi sinh học mẹ - Thao tác trang thiết bị đơn giản 4.3 Các phương pháp nhân giống in vivo 4.3.1 Nhân giống vơ tính tách Mỗi thường có gốc rễ = BPKT tác động để phát sinh nhiều gốc, gốc có rễ riêng biệt, tách tạo Ví dụ : cưa gốc cho nảy chồi vun đất vào gốc cho rễ, tách trồng PP chậm, hiệu thấp, tốn cơng nên áp dụng 4.3.2 Nhân giống vơ tính giâm, chiết cành PP dựa khả hình thành rễ bất định cành giâm chiết cắt rời khỏi mẹ Phương pháp thường áp dụng cho hai nhóm thân gỗ thân thảo vải, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, dứa, hoa cúc, cẩm chướng * Cơ sở khoa học hình thành rễ bất định Khi cắt cành giâm khỏi thể mẹ khoanh vỏ cành chiết bắt đầu hoạt hố hình thành rễ bất định Yếu tố gây hoạt hố hình rễ bất định định auxin * Các giai đoạn hình thành rễ bất định * Cơ sở khoa học hình thành rễ bất định Sự hình thành rễ bất định q trình phản phân hố tế bào tiền tượng tầng, tiếp tái phân hố để hình thành mầm rễ (hình) Hình: Sự phản phân hố TB tượng tầng để hình thành rễ bất định Lát cắt dọc cắt ngang mầm rễ bất định IBA, -NAA, 2,4D sử dụng sản xuất * Phương pháp xử lý auxin cho rễ bất định Có ba phương pháp chính: - PP xử lý nồng độ loãng : vài chục ppm – Vài trăm ppm + Với phương thức giâm cành ngâm phần gốc vào dung dịch auxin thời gian 12 đến 24 cắm cành giâm vào giá thể + Với phương thức chiết cành trộn dung dịch xử lý với đất bó bầu trước bó bầu xung quanh vết khoanh vỏ - PP xử lý nồng độ đặc : từ 1000 – 10.000 ppm + Với phương thức giâm cành nhúng nhanh phần gốc vào dung dịch auxin khoảng 1-2 giây cắm vào giá thể + Với phương thức chiết cành dùng tẩm dung dịch xử lý cần bôi lên vết khoanh vỏ (nơi xuất rễ) trước bó bầu - Sử dụng dạng bột: Trong thành phần có chứa auxin với tỷ lệ định phối trộn với loại bột Khi giâm cành cần chấm vết cắt cành giâm vào chế phẩm bột cắm vào giá thể Chia làm giai đoạn : - Phản phân hoá TB tiền tượng tầng để trở lại chức phân chia TB mô phân sinh tượng tầng để tạo khối TB bất định (callus)  Cần lượng auxin cao (10-4 – 10-5 g/cm3) - Tái phân hoá TB rễ từ TB bất định để tạo mầm rễ bất định - Cần lượng auxin thấp (10-7 g/cm3) - Mầm rễ sinh trưởng để hình thành rễ bất định  Cần lượng auxin thấp (10-11 - 1012 g/cm3) không cần auxin 4.3.3 Nhân giống vơ tính chiết cành * Ưu điểm : - Cây dễ sống, sinh trưởng nhanh, mọc khoẻ - Cây mang đầy đủ đặc tính di truyền mẹ - Cây thấp, tán gọn nên thuận tiện cho chăm sóc thu hoạch * Nhược điểm : - Hệ số nhân giống không cao, sử dụng sản xuất nhỏ - Cây nhanh già cỗi, tuổi thọ vườn thấp, khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường không cao - Cây mẹ bị khai thác nhiều làm giảm tuổi thọ, sức sống 7/18/15 * Các hình thức chiết cành + Chiết cành biện pháp uốn vít cành Đối tượng thân bụi, thân thảo: đỗ quyên, kim ngân, ráy thơm Cách tiến hành : uốn vít cành xuống phủ đất lên, sau thời gian phần phủ đất rễ (hình) Ðể kích thích rễ nhanh gây vết thương nhẹ lên cành uốn phần phủ đất Cắt rời phần rễ để tạo Hình: Biện pháp uốn vít cành * Các hình thức chiết cành + Chiết cành Áp dụng phổ biến cho nhóm thân gỗ: - Cây ăn quả: nhãn, vải hồng xiêm, chanh, roi, cam, quýt, bưởi - Cây công nghiệp: chè, cà phê - Cây rừng: bạch đàn, quế, hương Chọn cành có tuổi sinh học trung bình hay cịn gọi cành bánh tẻ để chiết - Cách tiến hành: khoanh vỏ cách khoảng 2-3 cm đến tận phần gỗ (hình) - Cách tiến hành: khoanh vỏ cách khoảng 2-3 cm đến tận phần gỗ (hình) Thường phơi cành từ 12 – 24 bó bầu + Ðối với khó rễ: hồng xiêm, mận, mơ, mít nên xử lý cho vết khoanh vỏ dung dich auxin (-NAA) 4000 -8000 ppm trộn dung dich auxin vào hỗn hợp bó bầu (40 - 100 ppm) + Nguyên liệu bó bầu: sử dụng hỗn hợp đất vườn đất bùn ao phơi khô, đập nhỏ trộn với số nguyên liệu hữu cơ: trấu bổi, mùn cưa, rơm rác mục , rễ bèo tây với tỷ lệ 2/3 đất với 1/3 nguyên liệu hữu Ðảm bảo 70% độ ẩm hỗn hợp bó bầu Phía ngồi bầu chiết bọc giấy lynon Buộc chặt hai đầu bầu chiết vào cành để bầu không bị xoay xung quanh cành chiết Hình: Cách khoanh vỏ cành chiết a,b khoanh vỏ c Bóc cạo vỏ Hỗn hợp bó bầu chiết Bọc lynon Hình: Cách bó bầu cành chiết a Ra rễ bất định b Cắt cành chiết Hình: Sự rễ bất định cành chiết đủ tiêu chuẩn cắt 4.3.4 Nhân giống vơ tính giâm cành * Ưu điểm : - Cây giữ đựơc tình trạng di truyền mẹ, vườn đồng đều thuận tiện chăm sóc, thu hoạch - Thời gian nhân giống tương đối nhanh, hệ số nhân giống cao - Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu kinh tế cao * Các hình thức giâm cành + Giâm cành biện pháp cắt cành cắt thân Đối tượng: thân gỗ: nhãn, vải, cam, chanh, bưởi, cà phê, chè; loại rau, hoa thân thảo: khoai tây, hoa cúc Cách tiến hành * Kích thướ c – Vịtrí– Số – Xử lý auxin – Chăm só c… * Nhược điểm : a Giâm nguyên vẹn - Tuổi thọ vườn thấp, chu kỳ kinh doanh ngắn - Người sản xuất có trình độ kỹ thuật định - Tốn nhiều cơng chăm sóc (Cắt thân nằm ngang) (Cắt đốt đơn) b Giâm mẩu (Cắt đốt kép) 7/18/15 + Giâm cành biện pháp cắt 4.4 Nhân giống vơ tính phương pháp ghép - Có hai kiểu cắt : * cắt tồn cắt mẩu (hình: a,b) Khi cắt rời khỏi mẹ rễ bất định hình thành phần cuống trực tiếp * Nếu phần cuống có mắt ngủ mắt ngủ bật chồi hình thành tự phần hình thành chồi để thành + Trong kỹ thuật giâm cành cần ý : - Giá thể cát ẩm: cát thô, cát mịn, cát đen, cát vàng tuỳ theo đối tượng trồng mà sử dụng loại cát cho thích hợp - Cát có đặc tính: trơ, nước xốp tạo điều kiện thuận lợi cho rễ Cát dùng làm giá thể phải để tránh nấm, khuẩn tạp chất làm chết cành giâm Thường sử dụng loại cát khai thác cát cũ phải rửa cách ngâm cát HCl thuốc tím vài sau rửa nhiều lần vịi nước - Cành giâm cần thường xuyên phun ẩm đảm bảo độ ẩm bão hoà bề mặt cành giâm xuất rễ bất định b Mục đích, ưu nhựơc điểm PP ghép *Mục đích - PP khác khó thực hiệu - Thay = phần hay phận khác - Tận dụng ưu điểm gốc ghép - Cải tạo phần bị hại (gãy, sâu bệnh) - Sử dụng PP ghép để test chống chịu bệnh * Ưu điểm - Giữ tính trạng mẹ Hệ số nhân cao, có tuổi thọ cao - Có khả thay đổi giống cần mà trồng (giống cũ, suất thấp, sâu bệnh ) cứu chữa phận hỏng (bị hại gốc, rễ dẫn tới chết toàn ghép để thay rễ) - Khai thác ưu điểm làm gốc ghép : khả ST, chống chịu sâu bệnh Đ/K ngoại cảnh bất lợi Sử dụng công tác lai giống * Nhược điểm - Cây làm gốc ghép trồng hạt nên ST khơng đồng đều khó chăm sóc - Cần có kỹ thuật, trình độ am hiểu về kỹ thuật ghép, giống trồng - Cần đầu tư để chọn tổ hợp ghép thích hợp theo loại vùng * Cách tiến hành Chọn cành “bánh tẻ” Tách mắt ghép thân gỗ Tách mắt ghép họ cam chanh Buộc chặt mắt ghép vào gốc ghép Hình: Mắt ghép sau tháo dây buộc nảy chồi Ghép PP lấy phận giống tốt, sinh trưởng đoạn cành, đoạn rễ, mầm ngủ lắp đặt vào vị trí thích hợp khác gọi gốc ghép để tạo thành tổ hợp ghép, STPT tạo nên hoàn chỉnh a Cơ sở khoa học phương pháp ghép * PP ghép dựa vào đặc tính tái sinh liền vết thương Tế bào phần bị thương có khả tái phân chia liên tục thành đám tế bào để liền vết thương tiếp nhận phần ghép vào * Khi ghép cần áp sát phần mô phân sinh tượng tầng phần ghép với gốc ghép, mơ phân sinh gốc ghép hoạt động mạnh làm lấp đầy chỗ trống hai vết cắt, tổ chức mô tế bào phần ghép gốc ghép hoà hợp, gắn với Hệ thống mạch floem xylem dần liên kết lại với thông suốt Lúc này, chồi ghép cung cấp chất dinh dưỡng nước, gốc ghép chồi ghép trở thành thể * Cây nhân giống phương pháp ghép hoàn toàn giữ tính trạng mẹ c Phương pháp ghép mắt - Hình thức ghép khác nhau: ghép áp, ghép cành, ghép mắt (theo đối tượng mục đích ghép để lựa chọn hình thức ghép thích hợp) - Ghép mắt có kiểu ghép : ghép nêm, ghép chữ T, U, H, I, * Ưu điểm phương pháp : - Hình thức ghép phổ biến, áp dụng cho nhiều loại giống trồng - Thao tác đơn giản, thuận tiện Hệ số nhân giống cao Dễ dàng bảo quản vận chuyển vật liệu ghép Cây khỏe, tuổi thọ cao Cách tiến hành : - Mắt ghép: chọn mắt ghép cành "bánh tẻ", khơng bị sâu bệnh (hình ) Tách mắt ghép theo kiểu bóc vỏ (cành táo ), cắt vát phần mắt (cành chanh, bưởi, cam ) (hình) Sau khoảng 15-20 ngày mở dây buộc cắt miếng vỏ đậy phía ngồi miếng ghép (hình) Ðể kích thích mắt ngủ mọc mầm nhanh, sau mở dây buộc khoảng ngày tiến hành cắt gốc ghép (cách mắt ghép từ 2-3 cm), nên cắt nghiêng khoảng 45o về phía ngược chiều với mắt ghép để tránh nước nhỏ vào mắt ghép Phương pháp ghép "cửa sổ" có tỷ lệ sống cao khoảng từ 70-100% tuỳ theo loại 5.Nhân giống vơ tính in vitro - Nhân giống vơ tính trồng in vitro hay vi nhân giống lĩnh vực ứng dụng có hiệu công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Ðây PP nhân giống thực phịng thí nghiệm nên cịn gọi PP nhân giống ống nghiệm - Khác với PP nhân giống truyền thống giâm, chiết cành ghép mắt, PP nhân giống in vitro có khả thời gian ngắn tạo số lượng giống lớn, đồng đều mà PP nhân giống khác - PP không phụ thuộc vào Đ/K thời tiết, tiến hành quanh năm - Ðây hướng ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam có nhiều phịng thí nghiệm ni cấy mơ, nhiều trung tâm sản xuất giống hàng năm cung cấp lượng đáng kể giống có chất lượng cao cho sản xuất chuối, dứa, khoai tây, loại lan, cảnh, lâm nghiệp… 7/18/15 5.1 Cơ sở khoa học nhân giống vơ tính in vitro Dựa vào tính tồn năng, phân hố phản phân hố a Tính tồn tế bào - Haberland (1902) cho rằng: TB thể sinh vật đa bào đều có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại TB chun hố đều chứa lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền thể trưởng thành Vì vậy, điều kiện định tế bào đều phát triển thành thể hồn chỉnh -> Tính tồn ngăng Hình: Sử dụng ni cấy b Tính phân hố phản phân hố tế bào + Tính phân hố: biến đổi TB phơi sinh thành TB mơ chun hố đảm nhiệm chức khác Trong thể thực vật có khoảng 15 loại mơ đảm nhiệm chức khác (mơ dậu, mơ dẫn, mơ bì, mơ khuyết ) chúng đều có nguồn gốc từ TB phơi sinh trải qua giai đoạn phân hố TB để hình thành mơ riêng biệt +Tính phản phân hoá: TB phân hoá thành mô riêng biệt với chức khác điều kiện định chúng quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào Trong kỹ thuật nuôi cấy quan sinh dưỡng lá, thân , giai đoạn tạo mơ sẹo (callus), tế bào quay trờ về trạng thái phơi sinh có khả phân chia liên tục mà hẳn chức quan sinh dưỡng lá, thân trước loại mơ Tế bào phơi sinh Bản chất Phân hố tế bào Phản phân hóa Tế bào chun hố 5.2 Mục đích PP nhân giống vơ tính in vitro Phân hố phản phân hố q trình hoạt hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể số gen hoạt hố số gen khác bị ức chế Ðiều xảy theo chương trình mã hố cấu trúc phân tử ADN Khi nằm thể hồn chỉnh TB có ức chế lẫn nhau, tách rời điều kiện định gen hoạt hố dễ dàng nên chúng có khả mở tất gen để hình thành cá thể Ðó sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô TB - Nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác tạo giống - Nhân nhanh trì cá thể đầu dòng tốt để cung cấp giống (cây lương thực, rau, hoa, cảnh, dược liệu, lâm nghiệp ) - Nhân nhanh kết hợp với làm virút - Bảo quản tập đoàn gen, đặc biệt loại dễ bị nhiễm bệnh điều kiện tự nhiên (khoai tây, khoai lang ) dễ bị giao phấn 5.3 Ưu, nhược điểm PP nhân giống in vitro 5.3 Ưu, nhược điểm PP nhân giống in vitro E.F Gerge (1993) nêu lên số ưu, nhược điểm sau đây: a Những ưu điểm - Khả hình tạo số lượng lớn giống từ mơ, quan với kích thước nhỏ khoảng 0,1- 10 mm - Hoàn toàn tiến hành điều kiện vô trùng nên giống tạo khơng bị nhiễm bệnh từ mơi trường bên ngồi - Sử dụng vật liệu virút có khả nhân nhanh số lượng lớn virút - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh được: thành phần DD, ánh sáng, nhiệt độ, chất ĐTST theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên có khả sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn (khoảng từ 36 đến 1012 / năm) - Có thể tiến hành quanh năm mà không bị chi phối Đ/K ngoại cảnh - Cây giống in vitro chưa có nhu cầu sử dụng bảo quản thời gian dài điều kiện in vitro b Những nhược điểm - Cây giống tạo có kích thước nhỏ đơi xuất dạng không mong muốn (biến dị, mọng nước) - Cây giống in vitro cung cấp nguồn hydrat carbon nhân tạo nên khả tự tổng hợp vật liệu H/C (tự dưỡng) - Cây giống in vitro ni dưỡng bình thuỷ tinh bình nhựa nên độ ẩm khơng khí thường bão hoà > trồng Đ/K tự nhiên thường bị cân nước (xốc nước) > héo chết - Vì vậy, trước chuyển từ Đ/K in vitro Đ/K in vivo, cần trải qua giai đoạn "huấn luyện " để quen dần với Đ/K MT bên ngồi có độ ẩm khơng khí thấp ánh sáng mạnh - Cần trang thiết bị cần thiết kỹ thuật viên phải có tay nghề cao 7/18/15 5.4 Điều kiện ni cấy in vitro *cho phịng chuẩn bị mơi trường Trang thiết bị phịng ni cấy mơ *Phịng cấy, ni nhà ươm in vitro Tủ cấy đơn Tủ cấy đơi Cân phân tích , cân kỹ thuật Tủ sấy (khử trùng khô) Buồng nuôi cấy Nhà ươm Máy đo pH Nồi hấp (khử trùng ướt) * Môi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy: giá thể có đầy đủ chất dinh dưỡng, hoạt chất nguyên tố vi lượng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng - Tuỳ theo loại quan ni cấy mà người ta có mơi trường riêng cho chúng Ví dụ: + MT MS (Murashige Skoog) cho nhiều đối tượng trồng + Môi trường Adnerson cho thân gỗ + MT Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần + MT CHU cho nuôi cấy bao phấn.v.v… * Độ pH mơi trường - pH MT ni cấy thích hợp cho đa số loại trồng từ 5,5 - 6,0 - Nếu pH thấp agar khơng đơng sau hấp khử trùng - Khi pH 7 làm kết tủa số muối vô phân giải số chất hữu làm chết - Khử trùng ướt (hấp MT) amp * Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro Có hai hình thức nhân giống vơ tính in vitro : + (1)Tạo từ chồi nách, chồi đỉnh mô phân sinh Mô phân sinh (meristem) có kích thướ c khoảng từ 0,1 - 0,5 mm vớ i mục đích ni cấy làm virus bắt buộc phải nuôi cấy meristem Tỷ lệ thành công khơng cao Hình: Ni cấy chồi nách, chồi đỉnh Hình: Mô phân sinh đỉnh (meristem) * Thành phần môi trường dinh dưỡng - Năm 1898, Haberland đề xướ ng tính tồn củaTB,ơng tiến hành thínghiệm về nuôi cấy mô không thành công Do hiểu biết về nhu cầu DD khoáng, đặc biệt vai trò chất ĐTST hạn chế - Ðến có hàng trăm loại môi trường DD nhân tạo xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại môi trường đều bao gồm nhóm chất chính sau đây: + Các loại muối khoáng (đa lượng, vi lượng) + Nguồn carbon hữu (thường đường saccaroza 2-3% ) + Vitamin (B1, B2, B6, ) + Chất điều tiết sinh trưởng (nhó m auxin, xytokinin ) + Nhóm chất tự nhiên (nướ c dừ a, dịch chiết nấm, rau ) + Chất làm đơng mơi trường (agar) +(2) Nhân giống vơ tính phát sinh chồi bất định (adventitiou shoots) phôi vơ tính (somatic embryos) Chồi hình thành hình thức trực tiếp gián tiếp : * Chồi phát sinh trực tiếp từ mẩu mô quan tách từ mẹ > Các phận đều sử dụng cho việc nhân giống in vitro : Ðoạn thân : thuốc lá, cam, chanh Mảnh : thuốc lá, cà chua, bắp cải Các phận hoa : suplơ, lúa mỳ, đồng tiền, phong lan Nhánh củ, bẹ củ : hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, Iridaceaee Trong trường hợp cần phải thực qúa trình phản phân hố tái phân hoá tế bào để bắt tế bào sinh dưỡng hình thành chồi trực tiếp gián tiếp thơng qua giai đoạn phát triển mô sẹo (callus) * Ở đối tượng mầm lan, dưa, chuối, hoa loa kèn phát triển chồi thường phải qua giai đoạn dẻ hành (protocorm), vậy, mẫu cấy hình thành hàng loạt thể protocorm, tiếp theo, protocorm sản sinh protocorm phát triển thành 7/18/15 Hình ảnh minh họa +(2) Nhân giống vô tính phát sinh chồi bất định (adventitiou shoots) phơi vơ tính (somatic embryos) Chồi hình thành hình thức trực tiếp gián tiếp : Thể protocorm phát sinh chồi từ protocorm phong lan Nuôi cấy qua giai đoạn callus Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) - a,b mô phân sinh ; c tái sinh cây; d,e * Chồi phát sinh trực tiếp từ mẩu mô quan tách từ mẹ > Các phận đều sử dụng cho việc nhân giống in vitro : Ðoạn thân : thuốc lá, cam, chanh Mảnh : thuốc lá, cà chua, bắp cải Các phận hoa : suplơ, lúa mỳ, đồng tiền, phong lan Nhánh củ, bẹ củ : hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, Iridaceaee Trong trường hợp cần phải thực qúa trình phản phân hố tái phân hố tế bào để bắt tế bào sinh dưỡng hình thành chồi trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo (callus) * Ở đối tượng mầm lan, dưa, chuối, hoa loa kèn phát triển chồi thường phải qua giai đoạn dẻ hành (protocorm), vậy, mẫu cấy hình thành hàng loạt thể protocorm, tiếp theo, protocorm sản sinh protocorm phát triển thành 5.5 Các bước tiến hành kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Hình ảnh minh họa Giáo sư Murashige trường Ðại học California chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn (Murashige, 1974) giai đoạn tiếp sau in vitro: Thể protocorm phát sinh chồi từ protocorm phong lan Nuôi cấy qua giai đoạn callus Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro Tạo hoàn chỉnh, huấn luyện Chuyển trồng ngồi Đ/K tự nhiên Ni cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) - a,b mô phân sinh ; c tái sinh cây; d,e Giai đoạn 1: Tạo vật liệu khởi đầu in vitro - Đưa mẫu vào nuôi cấy phải đảm bảo yêu cầu : Tỷ lệ nhiễm thấp - Tỷ lệ sống cao - Tốc độ sinh trưởng nhanh ==> sử dụng đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, thân, rế, thường chọn mơ non (ít chun hố - đỉnh chồi, mắt ngủ, non, vảy củ ) Ví dụ : Măng tây: chồi - Khoai tây: mầm - Dứa: chồi nách, chồi đỉnh - Bắp cải: mảnh - Suplơ: hoa tự Chọn PP khử trùng mẫu đem lại tỷ lệ sống cao MT DD thích hợp đạt tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng chất: HgCl2 0,1% xử lý 5-10 phút, NaOCl Ca(OCl)2 5-7% xử lý 15-20 phút, H202, dung dịch Br * Một số dạng MT DD phổ biến: White (1943), Heller (1953), Murashige Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hocmon: auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4D); Xytokinin (BA, BA, Kin, 2P); Giai đoạn : Nhân nhanh + Mục đích: * kích thích phát sinh số lượng lớn chồi đơn vị mẫu cấy tính theo số chồi, số đốt cấy ban đầu, số protocorn ban đầu ===> đạt hệ số nhân cao * Vật liệu khởi đầu in vitro chuyển sang MT nhân nhanh có bổ sung chất ĐTST nhóm xytokinin để tái sinh từ chồi thành nhiều chồi Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ống nghiệm ===> Cần đảm bảo yêu cầu : - Phát triển chồi nách - Tạo chồi bất định (cụm chồi) - Tạo phôi vô tính Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nơng Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ * Tạo chồi bất định, phơi vơ tính in vitro * Tạo chồi bất định (adventitiou shoots) : + Phải thực QT phản phân hoá tái phân hố để bắt TB soma hình thành chồi trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô seo ( lan, dứa, chuối, hoa loa kèn thường gặp phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocorm): từ mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm Từ đó, tiếp tục sản sinh protocorm phát triển thành * Tạo phơi vơ tính (somatic embryos): + Phải thực QT phản phân hoá tái phân hố TB để tế bào soma hình thành phôi trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mơ sẹo Phơi vơ tính có cấu trúc lưỡng cực bao gồm chồi mầm rễ mầm Các phơi vơ tính tái sinh thành hoàn chỉnh sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo * Tạo củ in vitro ( Microtuber): + Đối tượng: khoai tây, khoai lang, hoa loa kèn :nhân giống = tạo củ in vitro Giai đoạn : Tạo hoàn chỉnh huấn luyện + Khi có số lượng lớn chồi > tạo hoàn chỉnh ( MT auxin) Mỗi chồi rễ thành hồn chỉnh + Phơi vơ tính cần cấy chúng MT khơng có chất ĐTST MT chứa xytokinin nồng độ thấp phơi phát triển thành hồn chỉnh + Khi có in vitro hồn chỉnh đầy đủ quan thân, rễ, trước đưa ngồi điều kiện tự nhiên cần có giai đoạn huấn luyện để thích nghi với thay đổi về nhiệt độ, ẩm độ, nước, sâu bệnh để chuyển trạng thái từ dị dưỡng sang tự dưỡng Hình: Ra rễ tạo hồn chỉnh in vitro dưa lai Hình ảnh minh họa Khoai tây Hình : Phát sinh cụm chồi xytokin HS nhân chồi xun khung Hình: Tái sinh từ phơi vơ tính (somatic embryo) Hình: Tạo củ khoai tây in vitro củ in vitro Giai đoạn : Ra điều kiện tự nhiên + Khi ống nghiệm đủ tiêu chuẩn (về chiều cao, số lá, số rễ), chuyển trồng điều kiện tự nhiên +Trước trồng đất, ống nghiệm thường chuyển trồng vào giá thể xốp nhẹ (trấu hun, xơ dừa ) đặt nhà lưới có điều chỉnh ánh sáng, độ ẩm thích hợp cho thích nghi dần với mơi trường tự nhiên + Sau thời gian cứng cáp trồng đất Hình: Ra in vitro vườn ươm Cây khoai tây, dưa lai Nhà ươm 5.6 Một số hạn chế kỹ thuật nhân in vitro * Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability) Mục đích nhân giống in vitro tạo quần thể đồng với số lượng lớn Tuy nhiên, số trường hợp tạo biến dị soma Tần số biến dị hồn tồn khác khơng lặp lại Cây tạo thông qua GĐ tạo mô sẹo (callus) có nhiều biến dị so với ni cấy chồi đỉnh * Những nhân tố gây biến dị tế bào soma - Kiểu di truyền (Genotype): Tần số biến dị ảnh hưởng genotyp loài trồng khác Nói chung có mức bội thể cao dễ biến bị - Số lần cấy chuyển: Số lần cấy chuyển nhiều độ biến dị cao Theo Amstrong Phillips (1988): nuôi cấy lâu dài thường gây biến dị nhiễm sắc thể - Loại mơ (Tissue): Nói chung ni cấy đỉnh sinh trưởng nhân nhanh in vitro bị biến dị so với nuôi cấy quan khác Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 7/18/15 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ *.Sự nhiễm mẫu (explant contamination) Các vi sinh vật nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ giai đoạn khử trùng mẫu trước đưa vào nuôi cấy Tuy nhiên, số loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia Pseudomonas xâm nhiễm vào mơ dẫn, tồn mô gây tác hại tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy) Để khắc phục tượng cần: + Chọn mẹ tiêu chuẩn + Sử dụng số chất kháng sinh Nhưng mô thực vật mẫn cảm với kháng sinh có phản ứng đến kiểu di truyền cần thận trọng sử dụng kháng sinh Chất kháng sinh thường gây huỷ hoại ty thể lạp thể nên ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất * Hiện tượng thuỷ tinh hoá (Vitrification) - Hiện tượng bị “thuỷ tinh hoá”: tức thân mọng nước, suốt, khó sống đưa ngồi MT bị nước mạnh - Hiện tượng thường xảy khi: + Nuôi cấy MT lỏng hay MT agar, trao đổi khí thấp + ni cấy loại cây: táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền, hoa cúc • * Sản sinh chất độc từ mô nuôi cấy (Toxic compounds phenol) Do mẫu ni cấy có chứa nhiều chất tanin hydroxyphenol + Các phương pháp loại trừ hoá nâu: - Bổ sung than hoạt tính vào MT ni cấy (0,1 - 0,3%): hiệu loài phong lan Phalenopsis, Cattleya Aerides Tuy nhiên than hoạt tính làm chậm trình nhân nhanh hấp phụ số chất ĐTST dinh dưỡng cần thiết khác - Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt mẫu số ăn quả, (táo, hồng) - Sử dụng mô non giảm vết thương cho mẫu cấy khử trùng - Ngâm mẫu vào DD ascorbic xytric vài trước cấy - Ni cấy mẫu MT lỏng, có nồng độ oxy thấp, khơng có ánh sáng (1 - tuần) - Cấy chuyển mẫu liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường - tuần Một số giải pháp: - Giảm hút nước cách tăng nồng độ đường chất gây Π cao - Giảm nồng độ chất chứa nitơ MT - Giảm sản sinh ethylen bình ni cấy - Xử lý axit abxixic số chất ức chế ST Trên tóm tắt tồn bước qui trình vi nhân giống in vitro chung cho loại trồng Tuỳ loại mà có quy trình nhân giống riêng mang tính đặc thù cho giống 10 ... Chọn mẹ tiêu chuẩn + Sử dụng số chất kháng sinh Nhưng mô thực vật mẫn cảm với kháng sinh có phản ứng đến kiểu di truyền cần thận trọng sử dụng kháng sinh Chất kháng sinh thường gây huỷ hoại... sinh mà có khả khơi phục lại trạng thái ngun vẹn + Ðặc tính tái sinh thực vật lớn động vật nhiều Vận dụng đặc tính tái sinh thực vật mà người điều khiển trồng theo hướng có lợi biện pháp cắt... 28% Nhà sinh lý thực vật thiên tài người Nga Timiriazev nói: “Bằng cách điều khiển chức quang hợp, người có thể khai thác xanh vô hạn” nhà sinh lý thực vật Hà Lan Dewitt tính sử dụng 5% lượng