Ebook Sinh lý thực vật ứng dụng - Phần 1 - Trường Đại Học Quốc Tế Hồng Bàng

Khi pH thấp (mdi ưuờng axit) sfi hoạt hóa các enzyin hydrolaza dẫn tới kìm hSm sinh ứuởng đồng thời kích thích sự hóa già của tế bào ưong mổ nuỡi cấy (Nguyỉn Như Khanh... [r]

vũ VĂN VỤ

SINH LÝ THỰC VẬT ỨNG DỤNG

L Ờ I N Ó I Đ ẦU

Sinh lý học thực vật - môn học vẻ trình sống xảy thể quần thể thực vật, từ lâu mổn học li£n quan chặt chẽ vói mổn học sỏ Sinh học : Di ttiiyẻn học, Hóa sinh học, Lý sinh học, Sinh thái học có vai trò quan trọng việc cung cấp kiến tìiức sở cho ngành Trỏng ưọt, Lãm học, Duợc học,

Trong năm gần đây, phát triển ngành cững nghệ sinh học, cổng nghệ mồi ưuờng, sinh học mữi truờng, ứiì Sinh lý học thực vật, đặc biệt sở lý luận thục tiễn đuợc ứng dụng rộng rãi có hiệu nhong ngành xuít Chẳng hạn ; kiến thúc vẻ sinh lý tế bào đa úng dụng thành cổng cỡng nghệ nuỡi cấy mô - tế bào thục vật ; kiến thúc VỀ dinh duỡng khoáng trao 4ổi nitơ

cuốn sách : "Sinh lý thực vật ứng dụng" mục đích đời góp phần cung cấp kiến thúc nẽu ưên cho nguời đọc

Vì thời gian có hạn, sách chua đẻ cập đến phần ứng dụng chế độ nuức thục vật, hft h^p thục vật, chua đưa vào sáclTnhoiĩg phũõrng pháp chủ yếu ưong quang hợp úng dụng chắn sách nhiẻu thiếu sót Tác giả xin cám ơn ý kiến đóng góp để sách đưgrc hồn thiện dần, đáp ứng yẽu cầu nguời đọc

Chương /

NI CẤY MƠ - TẾ BÀO THỰC VẬT• m

Trong thập kỷ qua nuôi cấy mô - tế bào thục vật đa phát triển mạnh mẽ à nhiẻu quốc gia trân giới Đây cổng cụ cần thiết ưong nhièu lĩnh vực nghiên cứu úng dụng ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuồi cấy mổ phân sinh, mO sẹo nguời thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hon, gấp nhiẻu lần tốc độ vốn có tự nhiên Do tạo hàng loạt cá thể giữ nguyẽn tính trạng di truyẻn thể mẹ làm rút ngắn đuợc thời gian đua giống mói vào sản xt quy mữ lớn Hơn nOa, dựa vào kỹ thuật nuỡi cấy để trì bẳo quản đuợc nhièu giống trồng quý hiếm, tiến hành loại bô mầm bệnh (phục tráng giống) - phuong pháp đặc biệt cố hiỆu đỉTi với nhOng loài thục vật sinh sản sinh duỡng

Mặt khác, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy dung hợp protoplast (tế bào ưần), đé tạo lai xa vè mặt di truyẻn mà phuong pháp lai giống cổ điển khống thực đuọc, cOng chuyén gen mong muốn vầo ưồng Bẽn cạnh nhà nghien cúu cịn thu nhận chít trao đổi thứ cíp từ tế bào nudi cấy, dẫn đến ổn định độc lập hon, lộ thuộc vào sản xuất cửa thụpc v9t tự nhi6n

Ngoài nuữi ctfy mữ - tế bầo phuơng pháp nghiên cúu hiộu qụả nhtft qiiỉl trinh phết iinh h\nh ý

1 Cơ sờ lý luận thục nghiệm nuôi cấy mô tế bào thục vật in*vỉtro

Nuổi cíy mổ - tế bào thực vật in-vitro hình thành từ vài thập kỷ tniớc mà sở giả thuyết nhà thực vật học người Đức Haberland G (1902) ông cho tất tế bào đèir cồ tính tồn (totipotency), nghĩa tế bào mang toàn luợng thống~ĩĩn di ưuyén thể Theo Haberland tế bào có khả nâng pháttĩ^tH ànK thể hoàn chỉnhjchị_gặp điều kiện ưuỊ|n^ lợi Tiếc thí nghiệm Haberland đa khơng thành công

Năm i924 Kotte Robbins lặp lại thí nghiệm Haberland nuổi đỉnh sinh ttuởng tách từ đầu rẽ hòa thảo, tạo hệ rễ nhỏ có rẽ phụ

M u^ năm sau (1934) White đa nuổi cấy thành cổng đầu rẽ cà chua (Lycopersicum esculentum) ưsn inữi ttuờng lông có chứa đường, mu<â khống dịch chiết l ì ^ men Các thỉ nghiệm tiếp ứieo White thay dịch chiết nấtn men b ^ g hỗn hợp ba vitamin nhóm B : thiamiii (vitamin Bl), piridoxin (vitamin B6) axit nicotinic (vitatnin B3^ Sau lâu Went 'nỉimaim tìm chít kích thích sinh Utiỏng đ&u ti6n lAA (indol axetic axit)

Nghiên cứu vẻ huớng khác, Gautheiet Nobecourt (1937) đa tạo ừì điiọc sinh ttuởng cửa mO sẹo cà Tốt (Daucus carotà) ttoog thời gian dỹ đidi kỳ nàyTcác nliỉriEhoa học nghiên cúu tổng hợp thành cdng lihiéu chất kích thích sinh ưuỏng n h u : NAA (a-naphứiyl axetic axit), 2,4D (2,4 diolorophenoxy axetic axit) Nhờ thí nghiộm tạo mơ sẹo da thu đuọc kết ị nhiiu đốì tuợng thục vật ttvổc khó nuổi cấy

Những thành cổng trẽn sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuổi cấy tế bào thục vật sản xu^ với việc tạo đuợc/cãy hồn chỉnh từ mơ tách rời đỉnh sinh tniởng Hai tác giả Morel Martin đa phát triển kỹ thuật nuỗi cấy đỉnh sinh tniủng để tạo giống bệnh khoai tây (Solanum tuberosum) hoa lan (Orchid) Chính hai lĩHàlchoa học mở đầu cho hướng nuối cấy mữ - tế bào thục vật vi nhãn giống (micropropagation)

Ni cấy tế bào tách rời (tế bào đom tế bào trần) đuợc bắt đầu năm 1960 vái thí nghiệm tiẽn phong Cookịng từ trở nuữi cấy tế bào tách rời có buớc phát triển đáng khích lệ Nhờ hồn thiện kỹ thuật ni cíy protogiasỉ, người ta cố thể tiến hànỉi dung hợp tế bào tạo tế bào lai nghiên cứu chuyển gen có lợi vào cfty tiổng nhằm cải tạo giốQg

•v - - ^ ~ "

2 Các yếu tố ảnh huởng đến trình nu6i cấy

2.1 Ảnh huửng cúa m6i tniởng nuM cấy

Thành cổng nuối cấy mổ - tế bào thục vạt p^v rít nhiẦii vào chọn lựa mổi truờng dinh duỡng bao gồm số luợng chít lượng h5ã~chăt sử dụng Nhu câu dỉĩĩirduOĩig cho sinh tnidng tốì uu loài khừng gỉống nhau, gitta phận ưong thể cOng nhiều cố khác (Murashige and Skoog, 1962)

Nét đặc trung mổi truờng MS giàu vé thành phần muối khống Vì đ(Ti với số lồi thành phần dinh duửng tnữi tniờng MS tỏ cao cố tniờng hợp gfty độc cho mổ nuổi cấy Chồi cẩtn chuứng (Dianthus spp.), huong nhu {Ocimum gratis- simtm) sinh tniởng đuợc hàm luợng khoáng MS giảm nủa Tuơng tự chồi Feijoa sellowiana sinh sổi nảy nở tốt ưẽn mồi ừuờng Knop-mổi trường nghèo chất dinh duững (Bho- jwani and Razdan, 1983)

ở số lồi, mỡi tniờng MS giàu chất dinh duOng gãy tượng mọng nuức hay thủy tinh thể (viưiĩication) cẩm chuớng^ hoa ciic (Han et al, 1991) Thủy tinh thể uở ngại cho qúá ùinh chuyến cãy từ ống nghiệm vuờn uơm hay đồng ruộng Như kết luận chung ; thành phần chất khoáng ưong mOi truờng ảnh huỏng lẽn phát sinh hình thái thục vật in-vitro tuong đối phúc tạp Cho nSn với đốì tuợng, ở giai đoạn sinh tniỏng khác cần phầHìmcainổi tniờng thích hợp cho sinh tniởng phát uiển chúng

Các hợp chất vô chúa nitơ đitợc bổ sung vào mổi truờng duứi hai dạng : nittat (NO3) amon (NHỈ) làm nguồn nitơ Luợng nỉtrat hầu hết mổi tniờng nhiéu amon thường dùng à nổng độ 2SmM nitrat vđi 2-20 mM amon (Naray- anaswamy s., 1994) Khi niưat nguồn nitơ nhít sS gây kiém hóa mổi ttiiờng, cần ph<ri hợp với iuợng nhỏ amonium (Bbojwani and Razdan, 1983) Luợng nitơ mổi tniửng đuợc tỉng tàng nguồn ni tơ hOu (axit amin) hay dùng cẳ L>glutamin, L-asparagin (Narayanaswamy s., Ỉ994) Sự có mặt đồng thời cửa nguồn nitơ vổ hou hàm luợng thích hợp s£ thúc đẩy mỉu sinh ưuởng mạnh đảm bảo chống lại thiếu hụt nitơ xẳy

„QuờữgĩữSi sửxlụng-Iàni ngiiỏn bon CUB§ cấp Aãng-ỉuợng^ ehà yếu nuổi cíy nhiéu lồi thục vật (Hu et al, 1979) Đồng thời

đuờng cịn đóng vai trị chất thẩm thấu mơi ưuờng Loại đuờng hay sử dụng sacaroz với nồng độ từ - 8% (Bhojwani and Razdan, 1983) Ngoầi dạng điiờng khác : manitol, mantoz, glucoz dùng cho nuổi cấy số truờng hgp ở dâu tằm (Mulberry) sinh tnrởng chồi tốt thay sacaroz mantoz glucoz

Trong ni cấy nhiều lồi thục vật, để tăng cường sinh tniởng mẫu ưiồi trường nuổi cấy phải bổ sung thẽm vitamin, axit amin, loại dịch chiết chất điẻu hòa sinh tniỏng thục vật

Hầu hết mổ nuổi cấy đẻu có khả nâng tổng hợp tất loại vitamin cần thiết nhung khổng đầy đủ vê số luợng (Czosnowski, 1952 ; París, 1958) Vitamin có vai trị xúc tác q trình ưao đổi chất diỉn tế bào, muốn đạt đuọc sinh ưuửng tối ưu mổ nudi cấy nhà nghiên cúu thuờng đua th6in vào mỡi truờng số vitamin : thiamin (vitamin Bỉ), axit nicotinic (vi- tamin B3), vitamin B5, pirídoxin (vitamin B6) Trong số đố BI đuợc coi vitamin thiết yếu đối vối sinh truởng tế bào thục vật (Weaver R J., 1972 ; Bhojwani and Razdan, 1983) Một số trường hợp phải bổ sung thẽm vitamin c ở nồng độ cao, vitamin c giúp chống lại hiộn tuợng oxy hóa Số lirợng nồng độ vitainin cần sử dụng biến đổi theo lồi thực vật Ri6ng đốì với nuổi cấy pro- toplast VÌỆC thẽm hỏn hợp vitamin cản thiết (Kao, 1977 ; Gamborg et al, 1981)

Các chất điều hòa sinh truớng thựr vật (phytohoocmon) thành phần quan trọng bậc mổi trường nuổi cấy Nhờ nhOng cbất này, nhà nghi£n cúu chủ động điẻu khiển trình phát sinh hình thái thọc vật in-viưo Có hai nhóm chất đuọc sử dụng rộng rai auxin xytokinin

sự rè ảnh hưởng tới nhiều hoạt động sinh trưởng khác Trong nuôi cấy in-viưo, auxin thúc đẩy sinh trưởng cửa mẫu qua hoạt hóa phân chia giãn nở tế bào, kích thích trình tổng hợp ưao đổi chít, tham gia điẻu chỉnh phân hóa rễ, chồi (Bhojwani and Razdan, 1983) Trong vài ưuờng hợp thân mỉu nuổi cấy tạo đủ luợng auxin cho nhu cầu chúng khổng cần đến auxin ngoại sinh

Các auxin đèu có hiộu sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng từ 0,1 - l,Omg/I tùy theo mục đích vật liệu nuối cấy Auxin đuợc th£m vào kết hợp vói auxin nội sinh để điẻu khiển chiẻu huớng cuờng độ trình sinh ưuỏng Hàm luợng auxin thíp s$ kích hoạt phân hóa Tẻ, nguợc lại hàm ỉuợng cao auxin phát động tạo mổ sẹo (callus)

NhOng chất thuộc nhóm auxin hay dùng ỉà IBA (indol butyríc axit), NAA, lAA, 2,4D lAA bẻn nhiệt nẽn dùng, IBA NAA dùng cho ttìnb tạo rỉ đa số lồi 2,4D sử dụng rẩit có hiệu Ux>ng viộc tạo mổ sẹo nhiẻu lồi thục vật, khững đuọc dừng ưong mổi ưuờng tái sinh quan

Xytokinin nhóm phytohoocmon dẫn xuất adenin, có vai ưị sinh lý tuong tự nhau, phổi, non ừong lé xytokinin có hàm luợng cao Xytokinỉn Hftn quan chặt che với phân bầo, tti trỉ hóa quan làm giảm tuợng uu ngọn, kích thỉch phăn hóa chồi từ mổ sẹo nuối cấy Đối vói nuổi cấy phổi ờ nhiỉu lồi cây, xytokinin có ẳnh hudng duong tính rO rệt tfiế trcmg giai đo9n đầu sinh phổi xởma, cố mặt cửa mixin cân thiết nhung giai đoạn sau phổi phải đuợc nuổi cấy ttữn mối ttuờng có xytokinin đỂ biột hót chồi Các xytokinin thuờng dùng nuOi cấy kinetin, 2ip, BAP với nồng độ biến đổi từ - mg/1 thích hợp cho nhiêu loại mổ nuổi cíy Các múc thíp xytokinin ■bi&i hiệti quẳ kích-thích jcém, dân 4ỂD^t90.chồLyầ sinh ừuửng cửa ch6i giim Với hàm luợng xytokinin cao se hoạt hóa hình

thành chồi bít định (Mc Comb, 1978 ; Ziminennan and Broome, 1980), chồi nhiều có kích thước nhỏ Để kéo dài chồi cần chuyển chúng sang mỡi trường có nồng độ xytokinin thấp phải bổ sung thftm GA3 (gibberellic axit) vào mối trường Ngồi nồng độ cao xytokinin cịn kìm hSm hình thành phát triển rễ (Narayanaswamy s., 1994) Trong nuôi cấy phôi, Ra- jasekaran cộng (1987) nhận thíy tỷ lộ phát sinh phơi thấp thêm nồng độ xytokinin cao vào môi tniờng nuôi cấy Dactylis glomerata Pennisetum purpureum.

Theo Bhojwani (1980) ở số loài, tnổi tniờng nuổi cấy có loại xytokinin cOng cho hệ số tạo chồi cục đại Với ngũ cốc phối hợp hai hay nhiẻu loại xytokinin cho kết tốt sử dụng xytokinin nêng rẽ Tuy nhiên muốn có tuong quan sinh ưuỏng tối ưu phải có cân hoocmon thích hợp Nhiẻu tắc giả tổng kết biệt hóa quan thục vật in-vitro kết tác động qua lại hai nhóni auxin xytokinin Tỷ lệ cao auxin xytokinin kích thích tạo rễ, trái lại se đẩy mạnh biẹt hóa chồi, cịn ở tỷ 1$ trung gian mỡ sẹo đuợc hình thành Đó nguyCn tắc chung, cịn phản úng cửa loại mơ khổng giống Vì với loại mổ, ở giai đoạn sinh trưởng khác tổ hợp nồng độ giOa auxin-xytokinin quan ưọng

Ngoài auxin xytokinin, ưong nuổi cấy mổ - tế bào thục vật nguởi ta sử dụng phytohoocmon khác : GA (gibberellic axit), ABA (absxixic axit), etylen Đặc điểm băn GA kích thích kéo dài lóng, đốt sinh ưuửng căy ỉ%ản úng kéo dài thăn chủ yếu tăng tniởng tế bào b6n cạnh GA giúp phá vớ trạng thắi lừn di truyền c&y, kích thích nẳy mỉm cửa hạt mà chất hoạt hóa trình tổng hợp enzym thủy phân tinh bột So sánh với auxin xytokinin GA nhóm rít dùng, vi có biếu úc chế sinh ưưổnng phát sinh hình thái thục vật in-viưo, đặc biệt vói mổ thục vật mầm (Narayanaswamy s., 1994)

GA đuọc đua vào mổi tniờng ưong tniờng hợp cản thiết để kéo dài chồi bất định kích thích tái sinh chồi ở số lồi thục vật (Bhojwani and Razdan, 1983)

ABA chất úc chế sinh tniửng tự nhiftn, tham gia vào điẻu tiết đóng mở khí khổng, trì ưạng thái ngủ nghỉ quả, hạt Nó đẩy nhanh q nh lão hóa gãy rụng quan (Wilmar and Doombos, 1971) Vì ABA sử dụng nhằm kìm hãm sỊnh ưuởng chồi tham gia vào bảo quản luơng thục quỹ gen inviưo số tniờng hợp ABA thúc đẩy phát triển rỉ ưong mẫu nuỡi cíy khoai lang (Ammirato, 1986), cà chua, đậu tuong (Sưeet, 1979) Trong nuôi cấy phôi, thẽm ABA vào mổi ưuờng rít cần thiết ABA giúp phổi chống iại khổ hóa (Senara- tua et al, 1989) Ngồi ABA cịn kích thích hình thành noi dự trtt lipit, protein cacbon hydrat cần thiết cho phổi nảy mầm (Robetts et al, 19^0)

Bên cạnh chít điẻu hịa sinh ữudng, người ta sử dụng nhiẻu dung dịch hOu phúc tạp có thành phần khổng xác định : nuớc dừa, dịch chiết ním men, cazein thủy phân nhằm tăng cuờng sinh tniởng phát tríển mổ nuôi cấy

Van Overbeck (1941) đa xác nhận tác dụng kích thích nuức dừa nuổi cấy phổi họ Cà Năm Ỉ948 Steward cOng thu đuợc kết ò mổ cà rốt Trong nuổi cấy tế bào đơn, cuờng độ phỉn chia tế bào đuọc gia tSng bổ sung nuúc dửa vào dịch huyén phù nuổi cấy Thành phần nuớc dùa theo Nguyỉn Thới Nhăm (i988) bao gồm đuờng, axit amin, chất béo, vitamin, yếu tố đa luọng - vi luợng phytohoocmon Tác dụng kích ho9t cửa niRỈc dừa có le chất điẻu hòa sinh truứng lAA, GA hợp chít tuong tự kinetin, zeatin ờ ttx>ng thành phần cửa nố (Pierík, 1987) Sự cố cửa nuức dừa ưong nuữi cấy phổi đa giúp phổi non

'^^©'ữTÍh' Sỉn^ữặnglliẳr ttuShỴ iEHẳnh'T)dĩ\^'nhiỉũ^k^inẵũ nũơi

cấy, luợng nuớc dùa phù họp nhẩt từ 15 - 20% theo thể tích

Trong nuổi cấy có tniờng hợp người ta sử dụng than hoạt tính (Activated charcoal) chất phụ gia than hoạt tính có tác dụng híp phụ chất tiết từ mổ cíy, vỏ bao phấn lầm tăng hiệu suất sinh phồi (Prídborg et al, 1978 ; Ammirato, 1983) Vời mẫu dễ bị hóa nâu than hoạt tính đặc biẹt cỏ hiệu quả, giúp làm giảm ảnh huởng độc tố đến mổ nuổi cấy

Agar (thạch) lầ thầnh phần định trạng thái vật lý mổi trường Hàm lượng agar dùng cho nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối luợng Nồng độ cao agar, mổi ưuờng ưở nẽn cúng, khuếch tán chất dinh duững hấp thụ mổ gặp khó khăn (Bhojwani and Razdan, 1983) Đa số ni cấy phổi thực U6n mổi ưuờng có agar phụ thuộc vào loài mà sử dụng cho phừ hợp Pennce đồng nghiệp (1980) phát thấy phổi Thebroma nuổi cíy trẽn mổi trường lỏng có kích thuớc gíp đơi ttẽn mổi ưuờng đặc Tuy mổi tniờng lỏng dẽ găy tuợng mọng nuóc mỉu nuổi cấy

Giá ưị pH mổi trường thích hợp cho sinh tniửng phát ưiển nhièu loài thực vật 1)iến đổi từ 5,0 đến 6,0 Có lồi sinh ưuửng tốt pH kièm mận (Prunus domestica) (pH = 8,6) Sưaus Larue (1954) nhận thíy vói mổ sẹo nội nha ngổ pH = 7,0 thuận lợi cho Ubig sinh khỉTi Khi pH thấp (mdi ưuờng axit) sfi hoạt hóa enzyin hydrolaza dẫn tới kìm hSm sinh ứuởng đồng thời kích thích hóa già tế bào ưong mổ nuỡi cấy (Nguyỉn Như Khanh 1996)

13 Ảnh huửng cửa <Uẻu kỉện nuổi cấy 2.2.1 Nhiệt độ

Yêu cầu vé nhiệt độ cho sinh tnrổìỉg phát triển tốt ị lồi khống Thục tế nuổi cíy ưong phịng thỉ nhiột độ đuợc trì biến đổi thường 25 ± l°c lồi hoa thủy tíỉn nhiéu chồi đuọc hình thành nuổi cấy 25° (Seabrook and Cumming, 1982)

Theo tác giẳ Shigenobụ vầ Sakamoto (1981) tíiì nhiệt độ thời gian chiếu s ^ g ngày đ£m phải khổng đổi suốt thời gian nuối cấy

Nhiột độ lạnh cOng có ảnh huửng rổ rộ t: xử lý bao phấn lúa ở 4°c hiệu suất tạo mổ sẹo tâng l£n Ngồi nhiẹt độ thíp Tắt thấp cịn sử dụng làm chậm hay ngừng hẳn sinh trưởng cửa mẫu nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điỀu kiện in-viưo.

2.2.2 Ánh sáng

Ánh sáng cố ảnh huởng mạnh tới trinh phát sinh hình thái mổ nuổi cấy, bao gồm cường độ, chu kỳ thành phần qũang phổ ánh sáng (Read, 1990 ; Dooley, 1991)

Cuờng độ ánh sáng từ 1000 - 2S00 lux (ilhiminance lux) đuọc dừng phổ biến cho nudi cấy nhiều loại mổ Vói cuờng độ ánh sáng lớn hon sinh ưươiỉg chồi chậm lại nhung se thúc đẩy bình tạo rễ (Murashige, 1977)

Theo Ammirato (Ỉ986), ánh sáng tham gia vào phát sinh phát triển phổi xoma Cuờng độ ánh sáng cao gãy n6n sinh ưuờng mữ sẹo, ánh sáng ciiờng độ ttu n g ^ ^ kích thích tạo chồi, với cuờng độ ánh sáng thấp chồi sC gia tầng chiéu cao vầ cố màu xanh đậm

Vấn đẻ quang phổ ánh sáng da đuợc Ịihiéu tác gii nghitn cúu IHerik (1987), Reutes (1988) Nuôi cấy quỳ thiẽn trúc Pelar- gonium ánh sáng làm tíừỉg chiẻu cao thân chồi, tr<mg ánh Sắng xanh l«i có biéu úc chế (Appelgen, 1991) Đtfì vứi Giy thuốc iá thi nguợc lại, ánh sáng xaiử kfch thích biệt hóa chồi, ánh sáng ưắạg (đa sấc) kim ham tạo rS phụ obttog hoạt hóa tạo chồi phụ (Pierik; 't987).'Sụ-thu-nhận inh-sáng- chối -Ến-vittD- phự thuộe vào buớc sóng ánh sáng chểt liộu bình Mổi cấy

3 Nguyên liệu phtnmg pháp 3.1 Chọn nguyên liệu

Nguyên liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật phận ; đoạn rễ thân, phần (cuống lá, phiến cấu trúc phổi mầm, trụ trẽn, trụ duới mầm, hạt phấn, nỗn chí mầu thân ngầm quan dự trữ mặt đít (củ, hành ) đuợc dùng cho nuôi cấy

Phương pháp tiến hành : mục đích nuổi cấy đặc tính lồi sS định việc chọn lựa loại mẫu phù hợp Chẳng hạn để thu đơn bội làm nguồn gen ỉai tạo giống phải dùng bao phấn, hạt phấn cho nuổi cíy Sử dụng đỉnh chồi, từ hạt để tiến hành vi nhãn giống thục vật Cây cho mẫu (cây mẹ) phải mang hay nhiéu đặc điểm uu việt mà quan tíbn : sinh tniỏng tốt, cho sản luợng, chất iưọmg cao quả, hạt hay quan sinh duững, bị nhiỉm bẬnh, có khả chống chịu điẻu kiện khổng thuận mổi ưuờng (hạn, lạnh ) Các mỉu thường đuọc thu nhận vào đẳu mùa sinh ưuỏng, lúc sáng sớm tồn cịn ị trạng ứiái căng ưuơng (Seabrook et al, 1976 ; Yang, 1977 ; Anderson,

1980 ; Narayanaswaray s., 1994)

Sự tíu sinh mỉu phụ thuộc vào thành phỉn mOi ttuờng nuOi cấy, đặc điểm di truyẻn loài cây, ưạng thái sinh lý c&y cho mỉu đổi chịu ảnh huởng mừa năm loài loa kèn Ulium speciosum, mẫu thu thập vào mùa xuăn mùa thu có khả nang tái sinh, cịn thu nhang mùa khác khơng thể đạt đuợc kết (Narayanaswamy s., 1994)

3 ^ niuong pháp vA trừng m ỉu ctfy

Miu đuọc thu hái vé có chứa hay nhiỀu vi khuẩn nấm tây theo tiếp xúc cửa chổng với mổi ưuờng Phữi Uong hạt, md ttong

15

quả, đòng lúa non bị nhiẽm vi sinh vật Ngược lại, lá, thân đặc biệt phận nằtn duới đất rẻ, củ, th&n ngầm có số luợng vi khuẩn nấm cao £>ể loại bô hệ vi sinh vật khổi mơ cấy phuong pháp thũng dụng dùng hốa chất có hoạt tính diệt khuẩn nỉbn

Khả tieu diệt nấm khuẩn hóa chất vỡ trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý múc đọ xăm nhập chúng vào ngỡ ngách ưẽn bẻ mặt mô cíy Để tăng hiệu nguời ta ngâm mẫu vào etanol 70 - 80% ưong 30 giây sau đố mổi xử lý với dung dịch diệt khuẩn ĩXTi với mỉu mà bẻ mặt chúng đuợc bao phủ lớp sáp muốn đạt kết tốt cần cho thẽtn vào dung dịch khử ưàng vài giọt chất iàm giảm súc căng bé mặt tween 20, tweén 80, teepol chất giúp làm tăng tính linh động hóa chít vổ ưùng Với mỉu bẩn phải rửa kỹ nuớc xà phòng dể duớỉ vòi nuức chẳy tìr 20 - 30 phút se có tác dụng làm giảm đáng ké hộ vi khuẩn khỏi mỉu cấy (De Possaid,

1976 ; Narayanaswamy s., 1994)

Tác nhfln vổ trùng ngồi diệt nẾFii khuẩn cịn ảnh huởng đến mổ cíy Vì chọn lụa loại hóa chất pbẳi cãn vào múc độ nhiím khaển mẫn cảm mỉu Trong số hóa chất vỗ ttừng canxi hypoclork natrí Sodium hypoclorít hay đuợc dùng dặc tính cửa chúng : có độ độc thấp vói mft duợc xử lý, khtag gay úc chế sinh tniởng hiộtt qui diệt khuắn tốt Khi vd trùng m&i cấy cỉn cho mỉu ngập hồn tồn trcmg dung dịch diệt khuẩn kfcn đic cửa m&u ph&ỉ lán kích thc cỉy vào mổỉ tniởng sau sS cắt bớt phin mỉu bị hửy hoại hóa chất vO toừng gfly Nồng dộ sử dụng, thời xian xử lý hiệu qui stf hóa chẩt vd tràng nbtf bảng sau :

Hóa chất vồ trùng

Cổng thúc hóa học

Nồng độ sử dụng

(%)

Thời gian xử lý (phút)

Hiệu

Canxi hypoclorít Natri hypoclorit Hydro peroxit Thủy ngán cỉorua Nưtfc brom

Ca(C10)2

NaClO H2O2

HgCl2

Bf2

5 - 15 0,5 -

10 - 12

0,1 - 1

1 - 2

10 - 30 10 - 15 - 15

2 - 10 -3

Rất tốt Rít tốt

Tốt T/bình Rất tốt Phuvmg pháp nuôi cấy

3.3.Ỉ Nuôi cấy môi trường đặc

TMnh phần mổi ưuờng đặc có agar với hàm luựng biến <tôi từ 0,6 đến 1,0% Agar làm cho tnổi ưuờng lại mẵu thí nghiệm đuợc cỉy I6n bè mặt mổi tniờng Dùng mổi truờng đặc để nuổi cíy quan tách rời, vi nhân giống, nuỡi cấy mổ sẹo, nuổi cấy bao phấn hạt ph^

Phuong pháp nuổi cấy trẽn mỡi ưuờng đặc ọ6 uu điểm thao tác thí nghiệm đơn giản, dẽ vận chuyển mẫu xa Nhung có nhuọc điểm mfiu tiếp xúc đuọc mặt với nguồn dinh duOng, đồng thời nhttng sản phẩm mẫu tạo ưong trình trao đổi ch^ sS tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sinh truởng mẫu

3.3.2 Ni cấy trin mõi tntờng lỏng

Có hai phương pháp sử dụng mối tniờng lỏng nuổi cấy ;

3.3.2 J Nuôi cấy lỏng khuấy (Agitated liquid media)

Tnmg phuơng pháp mỉu ngâm phin hay ngập hoàn toàn ưcmg dung dịch mổi truờng Các bình chúa mỉu đuợc dật tr£n máy lắc vđi tốc độ 100 - 12p vịniựphiìt tao thuto lọi cho ữao

đổi khí Nuữi cấy lơng khuấy dừng nudi cíy tế bào đơn, nuôi cấy huyén phù tế bào, nuổi cấy để sản xt.các chít ưao đổi thứ cấp

3.3.2.2 Ni cấy lỏng tĩtứt (Stationary liquid media)

Bình nuữi cấy đuợc để y6n tniờng hợp nuổi cấy trSn mổi ưuờng đặc, mẫu có phần ngflm dung dịch mổi tniờng phần tiếp xúc với khOng khí TrỀn sở ni cấy lỏng Qnh, nguời ta phát triển phương pháp khác phưomg pháp sử dụng cầu giíy thấm lọc Cầu đuọc tạo từ giíy lọc gấp lại nhiéu tỉn, đầu nhúng vào dung dịch nuổi cấy đé thấm chít dinhr duỡng, đ&u phía Mn đuợc uốn cong làm nơi đặt mẫu Sử dụng cầu giíy ứong nuổi cấy phdi, nuổi cíy tế bào đorn

Ngồi phuomg pháp ưtn, mẫu cố thể đuợc nuổi cấy Ư6n mổi ưuờng bán rắn hay bán lỏng phối hợp hai loại môi trường ưong ttuờng hợp phủ lớp dung dịch cửa mỡi tniờng lỏng lên bé cữa mữi tmờng đặc để nuổi cấy Lụa chọn phuong pháp tùy theo tuợng, giai đoạn (riiát ưiển cửa mỉu, mục đích kỹ thuật nudi cấy Đốì với nhOdg nghiftn cúu vé dinh duững trao đổi chất thỉ mữi ưuờng lơng tơ thích hợp (Nniyaiiaswainy s., 1994)

4 C ác kỹ th u ậ t nuAỈ cấy mA - tế bào thục vẠt

4.1 Natti ctfỹ mA quan tấidi TỜỈ

Nim 1946 hai tác gii Lon Baỉl đs khdi điu nuOi cấy mổ quan tách rời bing thí nghiệm nudi cấy đỉnh chồi cfly măng tiiy Aparagus officừuUis, sau tác gii đa ni cấy c i bỏ (^^Ỉỉvkhác cửa cfly : lá, hoa, thfln

Tròng n ^ e n cứu mổ vầ quan tách fời chọn mỉu có tầm quan ttọng đ9c biệt : mỉu ph&i à úiỉh ttạng sinh lí tốt phát triển, Đó ià nhOng phần non cfty, phổi hợp tử truửng thành, iá miin, phin tiftn mỉm, chổi bên li thứ nỉi6 hay ỉá thứ hai chúng chúf hHMB mổ ph&n sinh (Thorpe et al, Ỉ99Ỉ)

Nhu cầu dinh dưỡng nuổi cấy mơ nudi cấy quan tách rời có điểm chung : nguồn cacbon (đuờng), nguyên tố đa lượng (nitơ, photpho, kali, canxi), vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co ) vitamin Tuy nhiên nuôi cấy mơ địi hỏi cao ni cấy quan tách rời phải bổ sung thẽm chất hữu chúa nita (axit amin), đặc biẹt chít điẻu hịa sinh tniởng phải đầy đủ tnổ tách rời khổng có khả tổng hợp chất (Nguyễn Đức Thành, 1997)

Nuổi cíy mổ quan tách rời đuợc ứng dụng :

- Nghiẽn cúu điẻu kiện sinh ưuởng đối vối phận mổ

- Nhân in-vìưo

- Tạo mỡ sẹo phục vụ cho nghiẽn cứu : chọn dòng tế bào đột biến xoma

4 ^ NuAi cấy mỏ phftn sinh (merístem)

Mo ph&n sinh bao gồm mổ đỉnh chồi, đỉnh cành, <finh rỉ có kích thuớc tương đối nhô thuờng 0,1 mm - 0,5cm Chúng-đuợc tách từ mỉm non, cành non chồi tạo thành căy Thí nghiệm nuổi cíy mổ ph&n sinh đuọc thập kỷ 50 tác gỉả Morel Martin (19S2), sau Murashige (1970) Để nuOi cấy mổ phan sinh, dừng mổi ưuờng White, Murashige Skoog (1962), Gamborg có bổ sung them vitamin, đuờng, phytơhoocmon

Do kích thuớc mổ phan sinh nhỏ, ưong vài tniờng hợp đế thu nhận dê nuổi mổ phân sinh hơD người ta thuởng tách phần đĩnh chồi chứa mô phân sinh (đĩnh sinh tniỏng) đé nu<H cấy (nuữi cíy <finh sinh ưuớng)

Đặc điểm mổ phân sinh chúa tế bào non ttẻ, phfln chia mịuih, lại khỡng bi virut xâm nhập mơ phAn sinh mữ cfty vữut Morel vầ Martin (1975) d i thu nhận đuợc c&y khoai tây virut từ nuổi cíy <finh sính tiưđng

Ni cấy mố phân sinh đuọc dùng ưong ưuờng hợp :

- Tạo giống virut từ nhOng giống bị bệnh (phục tt-áng giống)

- Nhãn giống in-viưo

- Tạo căy đa bội thững qua xử lý conxixin - Nghiẽn cứu trình hình thành quan Nuỏỉ ctfy md sẹo (callus)

Khi cân chất kích thích sinh tniỏng thục vật thay đổi, cụ thể mổ đỉnh sinh trudng hay nhu mỡ đuợc tách nuổi cấy trCn mổi tniờng giàu auxin mồ sẹo hình thành Đó khối tế bào phát sinh vơ tổ chúc có hình dạng khơng nhít định với màu vàng, trấng xanh

Nguy£n liệu để tạo mổ sẹo phần non cây, đua vào nudi cíy Ui6n môi truờng MS, Gamborg cần thiết phải thẽm chít thuộc nhóm auxin Loại nồng độ aUxin sử dụng phụ thuộc vào loại mổ nuOi cấy (Ycoman and Macleod, 1977) Trong ttình nu<yị cấy t90 mữ sẹo, mỉu thuờng phải để ưong tối Tạo mổ sẹo cố thể coi ỉà q trình giải biệt hóa, đua nhong mỉu đft biệt hóa ưở vé dạng ban điu nhu mữ Mo sẹo hình thành gdm hai loại:

- Loại xốp : chứa nhiéu tế bào xốp vớí nhan nhỏ, chít tế bào loang khtog bào to

• Loạỉ cìãìg nguọc lại : tế.bào chắc, nhan to, chất tế bào dậm đặc khổng bào nhỏ (Trần vah Minh, 1994)

Từ cếc kMTi mố sẹo đua vào môi ưuờng nh&n sinh khỉTi để thu luợng lớn mữ SỘO. ÌHiy nhi6n ning tái sinh đặc tính quan tt<ọng mỡ sẹo Khả sS sớm ỏ mổ sẹo xốp ỉđmiiỉ~ỸSỉỉ~đaỹ T rtlaa lRnr ^ mo 'sẹo cứữgrNguyen-nhẳn théido tế bào cửa mổ sẹo sS mít khả nãng ỉổng hợp số chất thiết