BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM BÀI TẬP VI SINH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENS GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN LƯU HUYỀ.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM - - BÀI TẬP VI SINH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENS GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : LƯU HUYỀN TRANG TP.HCM, THÁNG 09/2017 PHẦN Phương pháp phát Listeria monocytogens theo TCVN 7700-1 : 2007, ISO 11290-1 : 1996 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENS Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử môi trường tăng sinh Mẫu thử: lấy từ sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi theo tiêu chuẩn lấy mẫu yêu cầu, mẫu gửi phải mẫu đại diện, không bị hư hỏng hay biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản phải đồng Môi trường tăng sinh ban đầu (canh thang nửa Fraser): Nuôi cấy môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu chứa thể tích liti clorua nửa thể tích acriflavin axit nalidixic (canh thang nửa Fraser), đồng thời canh thang sử dụng làm dịch pha loãng cho phần mẫu thử Bước 2: Ủ phần mẫu thử 30°C 24h Quá trình tăng sinh ban đầu, nên không cần phải ủ thời gian lâu, ủ thời gian thích hợp vừa đủ cho khuẩn lạc mọc lên chuyển tiếp sang bước tăng sinh thứ cấp Trong q trình ủ xuất màu đen, môi trường có Kali dihydro phosphate nên có khả sinh khí H2S, tiếp tục tác dụng với sắt (III) amoni citrate môi trường, tạo kết tủa màu đen Bước 3: Tăng sinh thứ cấp (canh thang Fraser) Nuôi cấy môi trường thứ cấp tăng sinh lỏng nồng độ đầy đủ (canh thang Fraser) Bước 4: Ủ canh thang Fraser 35 °C hoăc 37 °C 48h Tại số lượng vi sinh vật tăng sinh lên nhiều, không để thời gian 48h mơi trường hết chất dinh dưỡng, vi sinh chết Bước 5: Cấy đĩa Từ dịch cấy thu được, cấy đĩa hai môi trường đặc chọn lọc: Thạch Listeria theo Ottaviani Agosti (ALOA) môi trường PALCAM agar Môi trường thứ (Thạch Listeria theo Ottaviani Agosti): Nguyên tắc giải thích: Do L monocytogenes L innocua có tính chất sinh hóa tương tự, chúng phân biệt với phương pháp truyền thống (PALCAM, Oxford) Cơ sở dựa công thức Ottoviani Agosti để phân tách Listeria monocytogenes cách có chọn lọc phân loại từ thực phẩm thức ăn chăn nuôi chứng nhận ISO Các thành phần môi trường thạch Listeria theo Ottaviani Agosti là: Peptone thịt, thuỷ phân enzyme cazein, chiết xuất nấm men pyruvate natri cung cấp chất dinh dưỡng chất nitơ tăng trưởng cần thiết Glucose carbohydrate lên men Natri clorua trì trạng thái cân thẩm thấu Phosphat đệm môi trường Clorua lithium chất bổ sung có chọn lọc (FD212 FD213) ức chế vi khuẩn kèm cho phép phát triển loài Listeria Dấu hiệu nhận biết: Loài Listeria thủy phân chất tạo khuẩn lạc màu xanh Sự khác biệt Listeria monocytogenes từ loài Listeria khác dựa hoạt tính phosphatidylinositolspecific phospholipase C (PIPLC) Phospholipase C enzyme hydrolyses chất tinh khiết (FD214) thêm vào môi trường dẫn đến quầng sáng mờ đục quanh khuẩn lạc Listeria monocytogenes Môi trường chọn lọc thứ hai (Môi trường PALCAM agar) Ngun tắc giải thích: Tiêu hóa tế bào vật chủ chất dinh dưỡng cho sinh vật Dextrose, tinh bột mannitol carbohydrate nguồn lượng Natri clorua trì cân thẩm thấu môi trường Màu Phenol đỏ thuốc nhuộm thị pH thể thay đổi độ pH môi trường L monocytogenes thủy phân esculin tạo thành esculetin dextrose Esculetin phản ứng với ammonium ferric citrate tạo thành phức hợp màu nâu đen xem quầng đen xung quanh khuẩn lạc L Monocytogenes không lên men mannitol Enterococci Staphylococci lên men làm thay đổi màu sắc từ màu đỏ sang màu vàng Trong điều kiện vi khí hậu, lồi aerobic nghiêm ngặt loài Bacillus Pseudomonas bị ức chế Việc bổ sung lòng đỏ trứng (2,5% v / v) vào PALCAM Agar báo cáo để hỗ trợ tế bào bị tổn thương Tùy thuộc vào loại mẫu sử dụng, nước làm giàu chọn lọc nên sử dụng trước cấy lên PALCAM Agar Dấu hiệu nhận biết: Trên Agar PALCAM, khuẩn lạc Listeria có màu xám xanh với kết tủa đen, sau tiêm ủ 35°C 24-48 điều kiện hiếu khí Bước 6: Ủ thạch Listeria theo Ottaviani Agosti 24h ± 3h 37 0C 24h ± 3h cần Thạch Listeria theo Ottaviani Agosti: khuẩn lạc màu xanh bao quanh quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) coi L monocytogenes Nếu mọc thưa, không quan sát thấy khuẩn lạc nào, sau ủ 24 ± mà khơng có mặt khuẩn lạc điển hình nào, ủ lại đĩa thêm 24 ± Bước 7: Khẳng định Listeria spp + Chọn lọc khuẩn lạc để khẳng định Từ đĩa đựng loại môi trường chọn lọc (môi trường thứ nhất: thạch Listeria môi trường thứ 2: Môi trường PALCAM agar) lấy năm khuẩn lạc nghi ngờ Listeria spp Ria cấy khuẩn lạc chọn lên bề mặt đĩa thạch TSYEA sấy khô trước đặt đĩa tủ ấm 35°C 37°C 18h đến 24h cho khuẩn lạc mọc tách biệt rõ Đặc điểm khuẩn lạc: Các khuẩn lạc điển hình có đường kính từ mm đến mm, lồi, khơng màu tồn mép mờ đục Chọn khuẩn lạc nghi ngờ để tiến hành khẳng định Để khẳng định ta phải tăng sinh từ khuẩn lạc lên mơi trường TSYEA nhằm tăng số lượng khuẩn lạc từ khuẩn lạc ban đầu đủ để ta tiến hành nhiều thử nghiệm khẳng định + Thử nghiệm sinh hoá: Phản ứng catalase: giúp xác định khả tiết enzyme catalase phân cắt H2O2 tạo thành H2O O2 sinh số loài Listeria Dấu hiệu nhận biết: thấy có bọt khí xuất chứng tỏ có Listeria Nhuộm gram: giúp xem đặc điểm hình thái để xem vi sinh vậ Listeria spp hay khơng (nếu khơng loại bỏ không tiến hành bược khẳng định tiếp theo) Dấu hiệu nhận biết: Listeria biểu lộ Gram dương, dạng hình que ngắn mảnh Thử tính di động: Vì Listeria có khả di động nên dựa vào đặc tính để khẳng định, khơng có khả di động vi sinh vật khơng phải Listeria tiến hành loại Dấu hiệu nhận biết (quan sát kính hiển vi): Listeria spp có dạng hình que ngắn, mảnh chuyển động hỗn loạn Các dạng cầu, trực khuẩn lớn, trực khuẩn chuyển động nhanh, dạng bơi khơng phải Listeria spp Dấu hiệu nhận biết (cấy đâm sâu vào thạch di động): Listeria cho kiểu mọc điển hình giống xung quanh vết cấy, mọc chưa đủ ni ấm thêm ngày kiểm tra lại vết cấy Bước 8: Khẳng định L monocytogenes Phép thử đặc tính phân giải huyết: Dựa vào khả làm tan huyết Listeria monocytogenes tiến hành thử nghiệm đặc tính phân giải huyết để kiểm tra có phải Listeria monocytogenes hay không Dấu hiệu nhận biết: Listeria monocytogenes phân giải huyết tạo vùng sáng, hẹp (phân giải huyết ); Sử dụng hydrat carbon: Listeria monocytogenes có khả sử dụng rhamnose sinh acid tạo màu vàng khơng có khả sử dụng xylose Dấu hiệu nhận biết: Các phản ứng dương tính (sinh axit) cho màu vàng phần lớn xảy vòng từ 24h đến 48h Phép thử CAMP: L monocytogenes có khả cộng hưởng tan huyết với S aureus khả cộng hưởng tan huyết với R.equi thực phép thử CAMP để phân biệt L monocytogenes với Listeria khác Phản ứng dương tính với R.equi cho thấy quầng phân giải huyết rộng (5 mm đến 10 mm) “hình đầu mũi tên” Phản ứng coi âm tính quầng phân giải huyết nhỏ trải khoảng mm điểm giao chủng xét nghiệm vùng khuếch tán chủng R.equi Phản ứng dương tính với S.aureus cho thấy vùng tròn nhỏ từ quầng phân giải huyết lan rộng khoảng mm so với chủng xét nghiệm nằm vùng phân giải huyết yếu phát triển chủng S aureus Các vùng phân giải huyết rộng không xuất xung quanh vệt cấy chủng S aureus L monocytogenes Bước 9: Khẳng định cuối Các chủng coi L monocytogenes gửi tới phịng thử nghiệm chuẩn Listeria công nhận để khẳng định huyết học hoặc, có thể, kiểu loại tiềm tan Việc gửi đến phòng thử nghiệm phải kèm theo tất thơng tin có liên quan đến chủng PHẦN 2: Phương pháp định lượng Listeria monocytogens theo TCVN 77002:2007, ISO 11290-2:1998 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENS Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử dịch pha loãng Mẫu thử phải lấy cách ngẫu nhiên, có tính đại diện, đồng khơng bị hư hỏng hay biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Chuẩn bị huyền phù ban đầu để lượng vi sinh vật phân bố phần mẫu thử đồng tốt Việc pha loãng mẫu nồng độ thích hợp giúp ích nhiều q trình định lượng phân tích vi sinh vật, dễ dàng việc đo đếm tính tốn kết quả, giảm bớt khó khăn việc đọc kết Giảm bớt số lượng vi sinh vật có đơn vị thể tích, để sau ủ quan sát có hay khơng có phát triển chúng (trong ống lọ) định lượng khuẩn lạc (trên đĩa thạch), tiêu chuẩn riêng quy định Bước 2: Hồi phục 200C Listeria thường có mặt mẫu với số lượng nhỏ dễ tổn thương trính chế biến tồn số lượng loại vi khuẩn khác, phục hồi bước quan trọng giúp cho vi sinh vật hồi phục phát triển khoẻ mạnh lại để tạo điều kiện thuận lơi cho q trình sau Bước 3: Ni cấy bề mặt thạch Listeria theo Ottaviani Agosti Listeria có khả phân giải esculin làm tan huyết môi trường thạch máu, mơi trường dinh dưỡng thích hợp để chúng dùng làm dinh dưỡng Các thành phần môi trường thạch Listeria theo Ottaviani Agosti Peptone thịt, thuỷ phân enzyme cazein, chiết xuất nấm men pyruvate natri cung cấp chất dinh dưỡng chất nitơ tăng trưởng cần thiết Glucose carbohydrate lên men Natri clorua trì trạng thái cân thẩm thấu Phosphat đệm môi trường Clorua lithium chất bổ sung có chọn lọc (FD212 FD213) ức chế vi khuẩn kèm cho phép phát triển Listeria spp Dấu hiệu nhận biết: Loài Listeria thủy phân chất tạo khuẩn lạc màu xanh Sự khác biệt Listeria monocytogenes từ lồi Listeria khác dựa hoạt tính phosphatidylinositolspecific phospholipase C (PIPLC) Phospholipase C enzyme hydrolyses chất tinh khiết (FD214) thêm vào môi trường dẫn đến quầng sáng mờ đục quanh khuẩn lạc Listeria monocytogenes Bước 4: Nuôi ấm 37°C khoảng 24 - 48h Các đĩa thạch sau cấy đưa vào tủ ấm 37°C khoảng 24 48 mang kiểm tra Mục đích: Ở 37°C nhiệt độ thích hợp cho hầu hết vi sinh vật phát triển nhiệt độ tối hảo để vi khuẩn L.monocytogenes phát triển từ 300C đến 370C Bước 5: Nhận dạng khẳng định Nhận dạng Canh thang Fraser sử dụng cho môi trường tăng sinh chọn lọc Listeria monocytogenes thực phẩm Từ tăng sinh bước cấy ria dịch khuẩn lên bề mặt hai môi trường rắn chọn lọc (ALOA Oxford Palcam).Ủ đĩa 37,0 oC ± 1,0 oC 24 đến 48 h Từ tăng sinh bước cấy ria dịch khuẩn lên bề mặt hai môi trường rắn chọn lọc (ALOA Oxford Palcam).Ủ đĩa 37,0 oC ± 1,0 oC 24 đến 48 h Trên môi trường Oxford Palcam khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xám xanh, đường kính nhỏ từ 1-2 mm, ln có quầng đen bao quanh Sau 48h, tâm khuẩn lạc lõm xuống hai loại môi trường Các khuẩn lạc màu xanh bao quanh quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) coi L monocytogenes Ngun nhân: Tiêu chí thử nghiệm ISO 11133:2014 canh thang Fraser tăng trưởng 10 khuẩn lạc thạch chọn lọc Listeria theo Ottaviani Agosti (ALOA) Khi nuôi cấy môi trường pha trộn với Escherichia coli Enterococcus faecalis, có L monocytogenes tăng trưởng môi trường thạch khuẩn lạc đặc trưng màu lam với quầng mờ đục Mặc khác mơi trường ALOA có chứa dung dịch bổ sung L-α phosphatidylinositol dạng lipit có enzyme phân hủy thành dạng ngắn tạo kết tủa không tan xung quanh tạo nên quầng sáng Khẳng định Sau ủ 24 giờ, ủ tiếp 18 đến 24 mọc yếu không quan sát thấy khuẩn lạc sau ủ 24 giờ, kiểm tra đĩavề có mặt khuẩn lạc giả định Listeria spp Các khuẩn lạc màu xanh bao quanh quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) coi L monocytogenes Nếu mọc thưa, không quan sát thấy khuẩn lạc nào, sau ủ 24 ± mà khơng có mặt khuẩn lạc điển hình nào, ủ lại đĩa thêm 24 ± Bước 6: Khẳng định chủng Listeria spp + Chọn lọc khuẩn lạc để khẳng định: Môi trường thạch từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEA) Dịch thuỷ phân casein enzym Nguồn cung cấp N, vitamin khoáng Dịch thuỷ phân đậu tương enzym chất axit amin cần thiết cho VSV Natri clorua (NaCl) : có vai trị trì áp suất thẩm thấu Dikali hydro phosphat (K2HPO4): đệm pH D-Glucoza: Nguồn cung cấp cacbon Cao men: nguồn vitamin, đặc biệt vitamin B cần thiết cho phát triển vi khuẩn Thạch Nước Là môi trường có giá trị dinh dưỡng cao, dùng để tăng sinh vi sinh vật Cấy ria khuẩn lạc giả định lên môi trường TSYEA Ủ 37°C 18 – 24 Khuẩn lạc điển hình Đường kính từ – mm, lồi, khơng màu tồn mép mờ đục + Phản ứng catalaza Thử nghiệm dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn kị khí Các vi khuẩn hiếu khí kị khí tùy ý có khả sinh enzyme catalase Các vi sinh vật có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxy chất nhân điện tử cuối chuỗi chuyền điện tử tạo H2O2 Catalase thủy phân H2O2 thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Sự thủy phân H 2O2 giải phóng O2 gây tượng sủi bọt khí Listeria spp cho phản ứng dương tính (+) Lấy sinh khối từ khuẩn lạc đặc trưng lên phiến kính Nhỏ dung dịch H2O2 3% lên phiến kính Quan sát sủi bọt Thử nghiệm cho dương tính (+) có tượng sủi bọt CO2 sinh Thử nghiệm cho dương tính (-) khơng có sủi bọt khí Hóa chất sử dụng: H2O2 3% H2O2 chất oxy hóa mạnh nên dùng nồng độ cao gây chết VSV + Nhuộm gram Nhuộm màu tế bào vi khuẩn cho phép mô tả hình thái vi khuẩn phân loại chúng thành hai nhóm theo chức năng, chúng hay khơng thể giữ màu tím thuốc nhuộm tím tinh thể (Gram +) điều kiện thử nghiệm Các kết phân loại phần lớn dựa khác cấu trúc thành tế bào hai nhóm điểm khác biệt hai nhóm Listeria vi khuẩn gram dương (+), nhuộm màu gram có màu xanh tím Dung dịch tím tinh thể Tím tinh thể: tương tác với thành phần mang điện tích âm tế bào vi khuẩn làm tế bào bắt màu tím Etanol (95 %) Amoni oxalat (C2H8N2O4) Nước cất Dung dịch iơt Iơt: chất giữ chặt tím kết tinh tế bào, làm tế bào bắt màu xanh tím Kali iodua (KI) Nước Dung dịch safranin Safranin: nhuộm màu vi khuẩn gram (-) Etanol (95 %) Nước Cách thực Cố định lam kính màng vi khuẩn chuẩn bị từ dịch cấy, phủ lên màng dung dịch tím tinh thể Để phút Phủ lên lam kính dung dịch iơt Để phút Rót lớp mỏng dung dịch etanol (95 %) lên lam kính để 30 s khơng cịn màu tím Tráng nhẹ lam kính nước để loại etanol Phủ lên lam kính dung dịch safranin 10 s Làm khơ lam kính Kiểm tra lam kính vật kính dầu có độ phóng đại cao kính hiển vi Các tế bào vi khuẩn có màu xanh lam màu tím Gram dương (Gram +); Có màu từ hồng thẫm đến đỏ Gram âm (Gram-) Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo peptidoglycan, chất có khả giữ phức hợp tím tinh thể-iot Trong đó, lớp thành tế bào peptidoglycan vi khuẩn Gram âm mỏng thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngồi Tím kết tinh (CV) nước phân ly thành CV+ Cl− Các ion xuyên qua thành tế bào màng tế bào tế bào vi khuẩn gram dương gram âm CV+ tương tác với thành phần mang điện tích âm tế bào vi khuẩn làm tế bào bắt màu tím Dung dịch iodine (I- or I3-) tương tác với CV+ tạo phức hợp (CV–I) lớp bên tế bào Dung dịch iodine đóng vai trị chất giữ chặt tím kết tinh tế bào, làm tế bào bắt màu xanh tím Tế bào vi khuẩn gram âm lớp lipopolysaccharide bên ngoài, lớp peptidoglycan bên lộ Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trị chất hoà tan lipit làm tan màng thành tế bào Phức hợp CV-I vi khuẩn gram âm lớp peptidoglycan mỏng giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot bị rửa trơi Ngược lại, tế bào vi khuẩn gram dương trở nên nước cồn acetone làm giảm mật độ khoảng cách phân tử lớp màng Phức tinh thể - iot bị mắc kẹt bên tế bào vi khuẩn gram dương tính chất đa tầng lớp peptidoglycan Bước tẩy phải tính xác, rửa q lâu tím kết tinh tế bào vi khuẩn Gram + bị rửa trôi Sau tẩy cồn, vi khuẩn Gram + cịn bắt màu tím kết tinh, vi khuẩn Gram - bị rửa trơi phức màu, nhuộm Safranin vi khuẩn Gram - bắt màu thuốc nhuộm Safranin (tại lớp peptidoglycan) + Thử tính di động Nguyên tắc: Dựa vào quan sát khả tăng trưởng di động vi sinh vật môi truờng thạch Cách Canh thang từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEB) Thành phần Dịch thuỷ phân casein enzym Nguồn cung cấp N, vitamin khoáng Dịch thuỷ phân đậu tương enzym chất axit amin cần thiết cho vsv Natri clorua (NaCI) : trì áp suất thẩm thấu Dikali hydro phosphat (K2HPO4): đệm pH, D-Glucoza: nguồn cung cấp cacbon Cao men: nguồn vitamin, đặc biệt vitamin B cần thiết cho phát triển vi khuẩn Nước Lấy khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm đựng môi trường TSYEB Ủ 25°C – 24h Chọn ống nghiệm bị đục Quan sát kính hiển vi Listeria spp: hình que ngắn, mảnh chuyển động hỗn loạn Cấy vào môi trường TSYEB môi trường dinh dưỡng để tăng sinh vi sinh vật, Listeria spp lên men glucose làm đục môi trường, đồng thời quan sát Listeria spp di chuyển kinh hiển vi Cách Lấy khuẩn lạc điển hình thạch TSYEA Đường kính từ – mm, lồi, khơng màu tồn mép mờ đục Cấy đâm sâu vào môi trường thạch di động Ủ 25°C/48 Quan sát xung quanh vết cấy Môi trường thạch di động: Dịch thuỷ phân casein enzym Dịch thuỷ phân mô động vật enzym Thạch Nước Dịch thuỷ phân mô động vật enzym dịch thuỷ phân casein enzym cung cấp hợp chất nitơ, cacbon, lưu huỳnh giúp cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển Sự di chuyển vi khuẩn quan sát trực tiếp mơi trường di động có agar nồng độ 0,4% trở xuống lượng nhỏ agar giúp tạo môi trường bán cứng Đọc kết Thử nghiệm cho kết (+): VSV mọc lan khỏi đường cấy làm đục môi trường xung quanh Thử nghiệm cho kết (-): VSV mọc dọc theo đường cấy môi trường xung quanh Bước 7: Khẳng định L monocytogenes Phép thử đặc tính phân giải huyết: Dựa vào khả làm tan huyết Listeria monocytogenes tiến hành thử nghiệm đặc tính phân giải huyết để kiểm tra có phải Listeria monocytogenes hay khơng Dấu hiệu nhận biết: Listeria monocytogenes phân giải huyết tạo vùng sáng, hẹp (phân giải huyết ); Sử dụng hydrat carbon: Listeria monocytogenes có khả sử dụng rhamnose sinh acid tạo màu vàng khơng có khả sử dụng xylose Dấu hiệu nhận biết: Các phản ứng dương tính (sinh axit) cho màu vàng phần lớn xảy vòng từ 24h đến 48h Phép thử CAMP: L monocytogenes có khả cộng hưởng tan huyết với S aureus khơng có khả cộng hưởng tan huyết với R.equi thực phép thử CAMP để phân biệt L monocytogenes với Listeria khác Phản ứng dương tính với R.equi cho thấy quầng phân giải huyết rộng (5 mm đến 10 mm) “hình đầu mũi tên” Phản ứng coi âm tính quầng phân giải huyết nhỏ trải khoảng mm điểm giao chủng xét nghiệm vùng khuếch tán chủng R.equi Phản ứng dương tính với S.aureus cho thấy vùng trịn nhỏ từ quầng phân giải huyết lan rộng khoảng mm so với chủng xét nghiệm nằm vùng phân giải huyết yếu phát triển chủng S aureus Các vùng phân giải huyết rộng không xuất xung quanh vệt cấy chủng S aureus L monocytogenes ... FD213) ức chế vi khuẩn kèm cho phép phát triển loài Listeria Dấu hiệu nhận biết: Loài Listeria thủy phân chất tạo khuẩn lạc màu xanh Sự khác biệt Listeria monocytogenes từ loài Listeria khác... khăn vi? ??c đọc kết Giảm bớt số lượng vi sinh vật có đơn vị thể tích, để sau ủ quan sát có hay khơng có phát triển chúng (trong ống lọ) định lượng khuẩn lạc (trên đĩa thạch), tiêu chuẩn riêng quy định. .. (FD212 FD213) ức chế vi khuẩn kèm cho phép phát triển Listeria spp Dấu hiệu nhận biết: Loài Listeria thủy phân chất tạo khuẩn lạc màu xanh Sự khác biệt Listeria monocytogenes từ lồi Listeria khác dựa