Phát hiện và định lượng vi khuẩn listeria monocytogens

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM BÀI TẬP VI SINH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENS GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN LƯU HUYỀ.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

- -BÀI TẬP VI SINH

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN

LISTERIA MONOCYTOGENS

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : LƯU HUYỀN TRANG

TP.HCM, THÁNG 09/2017

PHẦN 1 Phương pháp phát hiện Listeria monocytogens theo TCVN 7700-1 : 2007, ISO 11290-1 : 1996.

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENS

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và môi trường tăng sinh

Mẫu thử: được lấy từ sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi theo tiêu chuẩn lấy

mẫu yêu cầu, mẫu gửi phải đúng là mẫu đại diện, không bị hư hỏng hay biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản và phải được đồng nhất

Môi trường tăng sinh ban đầu (canh thang nửa Fraser): Nuôi cấy môi trường tăng sinh

chọn lọc ban đầu chứa một thể tích liti clorua và một nửa thể tích acriflavin và axit nalidixic (canh thang nửa Fraser), đồng thời canh thang này cũng được sử dụng làm dịch pha loãng cho phần mẫu thử

Bước 2: Ủ phần mẫu thử ở 30°C trong 24h

Quá trình này chỉ mới tăng sinh ban đầu, nên không cần phải ủ ở một thời gian quá lâu,

ủ ở một thời gian thích hợp vừa đủ cho khuẩn lạc mọc lên và chuyển tiếp sang bước tăng sinh thứ cấp Trong quá trình ủ có thể xuất hiện màu đen, đây là do trong môi trường có Kali dihydro phosphate nên có khả năng sinh ra khí H2S, khi đó sẽ tiếp tục tác dụng với sắt (III) amoni citrate trong môi trường, tạo kết tủa màu đen

Bước 3: Tăng sinh thứ cấp (canh thang Fraser)

Nuôi cấy môi trường thứ cấp tăng sinh lỏng nồng độ đầy đủ (canh thang Fraser)

Bước 4: Ủ canh thang Fraser ở 35 °C hoăc 37 °C trong 48h

Tại đây số lượng vi sinh vật đã được tăng sinh lên nhiều, không để quá thời gian hơn 48h có thể môi trường hết chất dinh dưỡng, và vi sinh chết

Bước 5: Cấy đĩa

Từ dịch cấy thu được, cấy đĩa trên hai môi trường đặc chọn lọc: Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (ALOA) và môi trường PALCAM agar

Môi trường thứ nhất (Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti):

Nguyên tắc và giải thích:

Do L monocytogenes và L innocua có tính chất sinh hóa tương tự, chúng không thể phân biệt được với phương pháp truyền thống (PALCAM, Oxford) Cơ sở được dựa trên công

thức của Ottoviani và Agosti để phân tách Listeria monocytogenes một cách có chọn lọc và phân loại từ thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được chứng nhận ISO

Các thành phần trong môi trường thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti là: Peptone thịt, thuỷ phân enzyme cazein, chiết xuất nấm men và pyruvate natri cung cấp các chất dinh dưỡng và chất nitơ tăng trưởng cần thiết Glucose là carbohydrate lên men Natri clorua duy trì trạng thái cân bằng thẩm thấu Phosphat đệm môi trường Clorua lithium và các chất bổ sung

có chọn lọc (FD212 và FD213) ức chế vi khuẩn đi kèm và cho phép sự phát triển của loài Listeria

Dấu hiệu nhận biết: Loài Listeria thủy phân chất nền tạo ra các khuẩn lạc màu xanh lá cây Sự khác biệt của Listeria monocytogenes từ các loài Listeria khác dựa trên hoạt tính phosphatidylinositolspecific phospholipase C (PIPLC) Phospholipase C enzyme hydrolyses chất nền tinh khiết (FD214) được thêm vào môi trường dẫn đến một quầng sáng mờ đục quanh các khuẩn lạc Listeria monocytogenes

Môi trường chọn lọc thứ hai (Môi trường PALCAM agar)

Nguyên tắc và giải thích:

Tiêu hóa các tế bào vật chủ là chất dinh dưỡng chính cho các sinh vật Dextrose, tinh bột

và mannitol là các carbohydrate và các nguồn năng lượng Natri clorua duy trì sự cân bằng thẩm thấu của môi trường Màu Phenol đỏ là thuốc nhuộm chỉ thị pH thể hiện sự thay đổi độ

pH của môi trường L monocytogenes thủy phân esculin tạo thành esculetin và dextrose Esculetin phản ứng với ammonium ferric citrate và tạo thành một phức hợp màu nâu đen được xem như một quầng đen xung quanh các khuẩn lạc L Monocytogenes và không lên men mannitol nhưng Enterococci và Staphylococci có thể lên men và làm thay đổi màu sắc từ màu

đỏ sang màu vàng Trong các điều kiện vi khí hậu, các loài aerobic nghiêm ngặt như các loài Bacillus và Pseudomonas bị ức chế Việc bổ sung lòng đỏ trứng (2,5% v / v) vào PALCAM Agar đã được báo cáo để hỗ trợ các tế bào bị tổn thương

Tùy thuộc vào loại mẫu được sử dụng, nước làm giàu chọn lọc nên được sử dụng trước khi cấy lên PALCAM Agar

Dấu hiệu nhận biết: Trên Agar PALCAM, khuẩn lạc của Listeria có màu xám xanh với kết tủa đen, sau khi tiêm và ủ ở 35°C trong 24-48 giờ dưới điều kiện hiếu khí

Bước 6: Ủ thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti trong 24h ± 3h ở 37 0 C và tiếp theo 24h

± 3h nữa nếu cần.

Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti: các khuẩn lạc màu xanh được bao quanh bởi quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) được coi là L monocytogenes Nếu mọc rất thưa, hoặc nếu không quan sát thấy khuẩn lạc nào, hoặc nếu sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ mà không có mặt khuẩn lạc điển hình nào, thì ủ lại các đĩa thêm 24 giờ ± 3 giờ

Bước 7: Khẳng định Listeria spp.

+ Chọn lọc khuẩn lạc để khẳng định

Từ mỗi đĩa đựng mỗi loại môi trường chọn lọc (môi trường thứ nhất: thạch Listeria và môi trường thứ 2: Môi trường PALCAM agar) lấy ra năm khuẩn lạc nghi ngờ là Listeria spp

Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt đĩa thạch TSYEA đã sấy khô trước và đặt các đĩa này trong tủ ấm ở 35°C hoặc 37°C trong 18h đến 24h sao cho các khuẩn lạc mọc tách biệt rõ

Đặc điểm khuẩn lạc: Các khuẩn lạc điển hình có đường kính từ 1 mm đến 2 mm, lồi, không màu và toàn bộ mép mờ đục

Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ để tiến hành khẳng định Để khẳng định thì ta phải tăng sinh

từ khuẩn lạc đó lên trên môi trường TSYEA nhằm tăng số lượng khuẩn lạc từ 1 khuẩn lạc ban đầu đủ để ta tiến hành nhiều thử nghiệm khẳng định

+ Thử nghiệm sinh hoá:

Phản ứng catalase: giúp xác định khả năng tiết enzyme catalase phân cắt H2O2 tạo thành H2O và O2 sinh hơi ở một số loài Listeria

Dấu hiệu nhận biết: thấy có bọt khí xuất hiện chứng tỏ có thể có Listeria.

Nhuộm gram: giúp xem đặc điểm hình thái để xem vi sinh vậ đó có thể là Listeria spp hay không (nếu không thì loại bỏ không tiến hành các bược khẳng định tiếp theo)

Dấu hiệu nhận biết: Listeria biểu lộ Gram dương, dạng hình que ngắn và mảnh.

Thử tính di động: Vì Listeria có khả năng di động nên dựa vào đặc tính này để khẳng định, nếu không có khả năng di động thì vi sinh vật đó không phải là Listeria và tiến hành loại

Dấu hiệu nhận biết (quan sát bằng kính hiển vi): Listeria spp có dạng hình que ngắn,

mảnh chuyển động hỗn loạn Các dạng cầu, trực khuẩn lớn, hoặc các trực khuẩn chuyển động nhanh, dạng bơi thì không phải là Listeria spp

Dấu hiệu nhận biết (cấy đâm sâu vào thạch di động): Listeria cho kiểu mọc điển hình

giống như cái ô xung quanh vết cấy, nếu mọc chưa đủ thì nuôi ấm thêm 5 ngày và kiểm tra lại vết cấy

Bước 8: Khẳng định L monocytogenes

Phép thử đặc tính phân giải huyết: Dựa vào khả năng làm tan huyết của Listeria monocytogenes tiến hành thử nghiệm đặc tính phân giải huyết để kiểm tra đó có phải là Listeria monocytogenes hay không

Dấu hiệu nhận biết: Listeria monocytogenes phân giải huyết tạo ra vùng sáng, trong và hẹp (phân giải huyết );

Sử dụng hydrat carbon: Listeria monocytogenes có khả năng sử dụng rhamnose sinh acid tạo màu vàng và không có khả năng sử dụng xylose

Dấu hiệu nhận biết: Các phản ứng dương tính (sinh axit) cho màu vàng và phần lớn xảy

ra trong vòng từ 24h đến 48h

Phép thử CAMP: L monocytogenes có khả năng cộng hưởng tan huyết với S aureus và không có khả năng cộng hưởng tan huyết với R.equi do đó thực hiện phép thử CAMP để phân biệt L monocytogenes với các Listeria khác

Phản ứng dương tính với R.equi cho thấy một quầng phân giải huyết rộng (5 mm đến 10 mm) “hình đầu mũi tên” Phản ứng được coi là âm tính nếu một quầng phân giải huyết nhỏ trải

ra chỉ khoảng 1 mm ở điểm giao nhau của chủng xét nghiệm và vùng khuếch tán của chủng R.equi

Phản ứng dương tính với S.aureus cho thấy một vùng tròn nhỏ từ quầng phân giải huyết lan rộng hơn khoảng 2 mm so với chủng xét nghiệm và nằm trong vùng phân giải huyết yếu do

sự phát triển của chủng S aureus Các vùng phân giải huyết rộng không xuất hiện xung quanh vệt cấy của chủng S aureus và L monocytogenes

Bước 9: Khẳng định cuối cùng

Các chủng được coi là L monocytogenes có thể gửi tới phòng thử nghiệm chuẩn Listeria đã được công nhận để khẳng định về huyết thanh học hoặc, nếu có thể, về kiểu loại tiềm tan Việc gửi đến phòng thử nghiệm phải kèm theo tất cả các thông tin có liên quan đến các chủng này

PHẦN 2: Phương pháp định lượng Listeria monocytogens theo TCVN

7700-2:2007, ISO 11290-2:1998

SƠ ĐỒ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENS

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và dịch pha loãng

Mẫu thử phải được lấy một cách ngẫu nhiên, có tính đại diện, đồng nhất và không bị hư hỏng hay biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản

Chuẩn bị huyền phù ban đầu để lượng vi sinh vật phân bố trong phần mẫu thử càng đồng đều càng tốt

Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật, dễ dàng trong việc đo đếm và tính toán kết quả, giảm bớt khó khăn trong việc đọc kết quả Giảm bớt số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích, để sau khi ủ có thể quan sát được có hay không có sự phát triển của chúng (trong ống hoặc lọ) hoặc định lượng được các khuẩn lạc (trên các đĩa thạch), như trong tiêu chuẩn riêng quy định

Bước 2: Hồi phục ở 20 0 C

Listeria thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và dễ tổn thương trong quá trính chế biến cùng sự tồn tại một số lượng các loại vi khuẩn khác, do đó phục hồi là bước quan trọng giúp cho vi sinh vật hồi phục và phát triển khoẻ mạnh lại để tạo điều kiện thuận lơi cho các quá trình sau này

Bước 3: Nuôi cấy bề mặt thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti

Listeria có khả năng phân giải esculin làm tan huyết trên môi trường thạch máu, do đó đây là môi trường dinh dưỡng thích hợp để chúng dùng làm dinh dưỡng

Các thành phần trong môi trường thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti là Peptone thịt, thuỷ phân enzyme cazein, chiết xuất nấm men và pyruvate natri cung cấp các chất dinh dưỡng

và chất nitơ tăng trưởng cần thiết Glucose là carbohydrate lên men Natri clorua duy trì trạng thái cân bằng thẩm thấu Phosphat đệm môi trường Clorua lithium và các chất bổ sung có chọn lọc (FD212 và FD213) ức chế vi khuẩn đi kèm và cho phép sự phát triển của Listeria spp

Dấu hiệu nhận biết: Loài Listeria thủy phân chất nền tạo ra các khuẩn lạc màu xanh lá

cây Sự khác biệt của Listeria monocytogenes từ các loài Listeria khác dựa trên hoạt tính phosphatidylinositolspecific phospholipase C (PIPLC) Phospholipase C enzyme hydrolyses chất nền tinh khiết (FD214) được thêm vào môi trường dẫn đến một quầng sáng mờ đục quanh các khuẩn lạc Listeria monocytogenes

Bước 4: Nuôi ấm ở 37°C trong khoảng 24 - 48h

Các đĩa thạch sau khi đã được cấy đều sẽ được đưa vào tủ ấm ở 37°C trong khoảng 24

48 giờ và sẽ mang ra kiểm tra

Mục đích: Ở 37°C là nhiệt độ thích hợp cho hầu hết vi sinh vật phát triển và nhiệt độ tối hảo để vi khuẩn L.monocytogenes phát triển là từ 300C đến 370C

Bước 5: Nhận dạng và khẳng định

Nhận dạng

Canh thang Fraser được sử dụng cho môi trường tăng sinh chọn lọc của Listeria monocytogenes trong thực phẩm

Từ tăng sinh 2 bước cấy ria dịch khuẩn lên bề mặt của hai môi trường rắn chọn lọc (ALOA và Oxford hoặc Palcam).Ủ các đĩa 37,0 oC ± 1,0 oC trong 24 đến 48 h

Từ tăng sinh 1 bước cấy ria dịch khuẩn lên bề mặt của hai môi trường rắn chọn lọc (ALOA và Oxford hoặc Palcam).Ủ các đĩa 37,0 oC ± 1,0 oC trong 24 đến 48 h

Trên môi trường Oxford hoặc Palcam khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình có màu xám xanh, đường kính nhỏ từ 1-2 mm, luôn có một quầng đen bao quanh Sau 48h, tâm khuẩn lạc lõm xuống ở cả hai loại môi trường

Các khuẩn lạc màu xanh được bao quanh bởi quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) được coi là L monocytogenes

Nguyên nhân: Tiêu chí thử nghiệm ISO 11133:2014 đối với canh thang Fraser là sự tăng trưởng của hơn 10 khuẩn lạc trên thạch chọn lọc Listeria theo Ottaviani và Agosti (ALOA) Khi được nuôi cấy trong một môi trường pha trộn với Escherichia coli và Enterococcus faecalis, chỉ

có L monocytogenes có thể tăng trưởng trên môi trường thạch này như khuẩn lạc đặc trưng màu lam với quầng mờ đục

Mặc khác trong môi trường ALOA có chứa dung dịch bổ sung là

L-α phosphatidylinositol là một dạng lipit có enzyme phân hủy thành các dạng ngắn tạo kết tủa không tan xung quanh tạo nên quầng sáng

Khẳng định

Sau khi ủ 24 giờ, và ủ tiếp 18 giờ đến 24 giờ nếu mọc yếu hoặc nếu không quan sát thấy khuẩn lạc nào sau khi ủ 24 giờ, kiểm tra các đĩavề sự có mặt của các khuẩn lạc giả định là Listeria spp

Các khuẩn lạc màu xanh được bao quanh bởi quầng sáng đục (các khuẩn lạc điển hình) được coi là L monocytogenes Nếu mọc rất thưa, hoặc nếu không quan sát thấy khuẩn lạc nào, hoặc nếu sau khi ủ 24 giờ ± 3 giờ mà không có mặt khuẩn lạc điển hình nào, thì ủ lại các đĩa thêm 24 giờ ± 3 giờ

Bước 6: Khẳng định chủng Listeria spp.

+ Chọn lọc các khuẩn lạc để khẳng định:

Môi trường thạch từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEA)

 Dịch thuỷ phân casein bằng enzym Nguồn cung cấp N, vitamin khoáng

 Dịch thuỷ phân đậu tương bằng enzym chất và axit amin cần thiết cho VSV

 Natri clorua (NaCl) : có vai trò duy trì áp suất thẩm thấu

 Dikali hydro phosphat (K2HPO4): đệm pH

 D-Glucoza: Nguồn cung cấp cacbon

 Cao men: một nguồn vitamin, đặc biệt các vitamin B cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn

 Thạch

 Nước

 Là môi trường có giá trị dinh dưỡng cao, dùng để tăng sinh vi sinh vật

Cấy ria khuẩn lạc giả định lên môi trường TSYEA

Ủ ở 37°C trong 18 – 24 giờ

Khuẩn lạc điển hình Đường kính từ 1 – 2 mm, lồi, không màu và toàn bộ mép mờ đục

+ Phản ứng catalaza

Thử nghiệm được dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kị khí Các vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy ý có khả năng sinh enzyme catalase Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhân điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyền điện tử tạo H2O2 Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ các

phân tử có độc tính cao này trong tế bào Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2 gây ra hiện tượng sủi bọt khí

Listeria spp cho phản ứng dương tính (+)

Lấy 1 ít sinh khối từ khuẩn lạc đặc trưng lên phiến kính

Nhỏ dung dịch H2O2 3% lên phiến kính

Quan sát sự sủi bọt

Thử nghiệm cho dương tính (+) có hiện tượng sủi bọt do CO2 sinh ra

Thử nghiệm cho dương tính (-) không có sủi bọt khí

Hóa chất sử dụng: H2O2 3% do H2O2 là một chất oxy hóa mạnh nên nếu dùng nồng

độ cao có thể gây chết VSV

+ Nhuộm gram

Nhuộm màu các tế bào vi khuẩn này cho phép mô tả được hình thái của vi khuẩn và phân loại chúng thành hai nhóm theo chức năng, chúng có thể hay không thể giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím tinh thể (Gram +) trong các điều kiện thử nghiệm Các kết quả phân loại này phần lớn dựa trên sự khác nhau về cấu trúc thành tế bào của hai nhóm và là điểm khác biệt chính giữa hai nhóm

Listeria là vi khuẩn gram dương (+), khi nhuộm màu gram có màu xanh tím

Dung dịch tím tinh thể

 Tím tinh thể: tương tác với các thành phần mang điện tích âm của tế bào vi khuẩn

và làm tế bào bắt màu tím

 Etanol (95 %)

 Amoni oxalat (C2H8N2O4)

 Nước cất

Dung dịch iôt

 Iôt: chất giữ chặt tím kết tinh trong tế bào, làm tế bào bắt màu xanh tím