Môi trường nuôi cấy là các cơ chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng

Môi trường nuôi cấy chất dinh dưỡng pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển sản sinh sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng dùng nghiên cứu vi sinh vật trình sản xuất sản phẩm vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng yếu tố quan trọng công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật Nguyên tắc pha chế môi trường nuôi cấy 1) Chọn chất dinh dưỡng thích hợp: Nói chung mơi trường dinh dưỡng cần đáp ứng nhu cầu vi sinh vật nguồn C, nguồn N, nguồn muối khoáng, nguồn nhân tố sinh trưởng nước Vì loại hình dinh dưỡng vi sinh vật phức tạp, vi sinh vật khác có u cầu khơng giống chất dinh dưỡng có nhiều công thức pha chế môi trường nuôi cấy “Sách Danh lục môi trường nuôi cấy” (A Compilation of Culture Media) xuất từ năm 1930 ghi tới 2500 loại môi trường nuôi cấy khác Môi trường ni cấy vi sinh vật tự dưỡng hồn tồn pha chế từ hợp chất vơ Ví dụ để ni cấy vi khuẩn Thiobacillus thiooxidans gồm có thành phần sau (g/l): (NH4)2SO4 -0.4; MgSO4.7H2O - 0,5; FeSO4 - 0,01; KH2PO4 - 4; CaCl2 - 0,25; S- 10; pH: 7,0, khử trùng 1210 C 20 phút Các vi khuẩn sử dụng CO2 khơng khí (hay hòa tan nước) để cung cấp nguồn carbon Với vi sinh vật tự dưỡng quang việc cung cấp chất dinh dưỡng cần tiết cần chiếu sáng để cung cấp lượng cho chúng Đối với vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp chất hữu nhu cầu dinh dưỡng nhóm khác khác Để ni cấy vi khuẩn Escherichia coli dùng mơi trường đơn giản sau (g/l): Glucose - 5; NH4H2PO4- 1; MgSO4.7H2O 0,2; K2HPO4 - 1; NaCl - 5; pH: 7,0-7,2, khử trùng 1120 C 30 phút Nhưng cũngcó vi khuẩn dị dưỡng yêu cầu môi trường ni cấy phức tạp Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus bifidus cần mơi trường sau (trong lít mơi trường đậm đặc gấp đôi) : K2HPO4 - 5g; Na-Acetate - 50g; NZ Case Peptone- 10g; Lactose- 70g; Alanine , Cystin, Tryptophan- loại 0,4g; Asparagin- 0,2g; Xantin, Adenin, Guanin, Uracin - loại 0,02g; Dung dịch Muối B- 10ml; Pyridoxin-HCl - 2,4mg ; Tiamin-HCl - 0,4mg; Riboflavin- 0,4mg; Acid nicotinic- 1,2mg; Ca-Pentosetenat - 0,8mg ; Biotin- 8,0 mcg (microgram); Acid folic- 20 mcg; Acid p-aminobenzoic- 20 mcg; Tween 80 - 1g Điều chỉnh pH đến 6,8 Thêm thao tác vô trùng 100ml dung dịch Acid ascorbic 1% lọc qua nến lọc vi khuẩn Điều chỉnh đến pH 6,5 Lại thêm thao tác vô trùng Sữa người loại crem cho nồng độ đạt 2% Dung dịch Muối B có thành phần sau (g/l): MgSO4.7H2O-10; FeSO4.7H2O-0,5; NaC-0,5; MnSO4.2H2O- 0,337 Thông thường để thay cho nhân tố sinh trưởng người ta thường dùng Peptone (thay cho aminoacid) cao nấm men (thay cho nhân tố sinh trưởng) Môi trường thường dùng để nuôi cấy vi khuẩn dị dưỡng Môi trường Cao thịt-Pepton với thành phần sau (g/l): Cao thịt (Beef extract) - 5; Peptone- 10; NaCl- 5; pH: 7,0-7,2; khử trùng 1210 C 20 phút Môi trường để ni cấy vi khuẩn Brevibacterium spp có thành phần sau (g/l): Cao nấm men (Yeast extract)-10; Glucose- 20; CaCO3 - 20 Người ta chia môi trường nuôi cấy thành nhiều loại khác  Căn vào thành phần mơi trường ta có: mơi trường thiên nhiên, môi trường tổng hơp Môi trường thiên nhiên (complex medium): loại môi trường chứa chất hữu thiên nhiên khơng biết rõ thành phần hóa học thành phần hóa học khơng ổn định, cịn gọi mơi trường khơng xác định hóa học (chemically undefined medium) Các môi trường Cao thịt-Pepton, môi trường Mạch nha, mơi trường LB (Luria-Bertani) ví dụ loại môi trường Thành phần môi trường LB sau (g/l): Peptone - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0; khử trùng 1210C 21 phút Cao thịt nước chiết thịt cô đặc lại Cao thịt chứa chất đạm hữu cơ, đường, vitamin, muối khoáng- tất dễ tan nước Peptone dạng thủy phân protease hay acid thịt, casein, gelatin sau làm khơ lại thành dạng bột Peptone chứa phong phú chất đạm hữu cơ, có số vitamin đường Cao nấm men dịch tự phân (autolysate) tế bào nấm men cô đặc lại Cao nấm men chứa phong phú vitamin nhóm B, có chứa chất đạm hữu đường Ngoài loại nói mơi trường thiên nhiên cịn chế tạo từ nguyên liệu khác nước chiết khoai tây, nước chiết giá đậu, nước chiết đất, nước chiết rơm rạ, nước chiết lông vũ bột ngô, cám gạo, sữa, huyết thanh, nước ép cà rốt, nước dừa Vi sinh vật ưa phân (coprophilous microorganisms) dùng nước phân làm chất dinh dưỡng Giá thành môi trường thiên nhiên thường thấp, không sử dụng phịng thí nghiệm mà cịn sử dụng xí nghiệp lên men cơng nghiệp Thành phần số loại peptone dịch thủy phân protein Chế phẩm(CP) Phản ứng Biure Các thành phần (% protein) (1) (2) (3) Peptone Pharmacon + 63.5 9.7 27.8 Peptone Vitte + 44.1 26.7 29.2 Peptone Canbaum + 40.2 27.4 32.4 Peptone Gee + 44.5 23.2 32.3 Peptone Roche + 25.3 11.7 63.0 CP thủy phân nhờ pepsin + 42.1 25.2 32.7 CP thủy phân nhờ trypsin + 2.0 14.9 82.1 Dịch thủy phân gluten - 0 100 Dịch thủy phân gelatin - 0 100 Chú thích: Các polypeptid cao phân tử kết tủa tannin có mặt 2% H SO Các polypeptid kết tủa tannin mơi trường có phản ứng trung tính Các aminoacid tự peptid không bị ết tủa tannin Môi trường tổng hợp (synthetic medium): loại mơi trường có thành phần hóa học biết rõ cịn gọi mơi trường xác định hóa học (chemically defined medium) Ví dụ mơi trường Gause thích hợp cho Xạ khuẩn với thành phần sau (g/l): Tinh bột tan - 20; KNO3 - 1; NaCl - 0,5; K2HPO4.3H2O- 0,5; K HPO 3H O 7H O- 0,01, pH: 7,22 - 0,5; FeSO4 7,4; khử trùng 1210C 21 phút Môi trường tổng hợp có giá thành cao loại mơi trường vi sinh vật phát triển tương đối chậm, nói chung thích hợp sử dụng phạm vi phịng thí nghiệm Có vi khuẩn địi hỏi mơi trường tổng hợp đơn giản, chẳng hạn vi khuẩn Escherichia coli với môi trường sau đây: K2HPO4-7,0g; KH2PO4-2,0g; (NH4)2SO4-1,0g; MgSO4-0,1g; CaCl2-0,02g; Glucose-4-10g; Nguyên tố vi lượng (Fe,Co,Mn,Zn,Cu,Ni,Mo)-mỗi loại 2-10μg; Nước cất- 1000ml Escherichia coli Có vi sinh vật địi hỏi mơi trường tổng hợp phức tạp (và đắt tiền) Sau ví dụ môi trường tổng hợp dùng để nuôi cấy vi tảo Euglena: acid glutamic-6g; acid aspartic-4g; Glycine-5g; Sacchaose-30g; Acid malic1,04g; Acid boric-1,14mg; Thiamine HCl-12mg; KH2PO4- 0,6g; MgSO4-0,8g; CaCO3-0,16g; (NH4)2CO3- 0,72g; FeCl360mg; ZnSO4- 40mg; MnSO4-6mg; CuSO4- 0,62mg; CoSO4- 5mg ; (NH4)2MoO4- 1,34mg; Nước 1000ml Vi tảo Euglena Một ví dụ khác môi trường tổng hợp để nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides: K2HPO4- 0,6g; KH2PO40,6g; NH4Cl- 3g; MgSO4- 0,1g; Glucose- 25g; Na acetate- 20g; Các amino acid - loại 100-200μg (gồm có Alanine , argininee, asparagine, aspartate e, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, histidine, isoleucine , leucine , lysine, methionine, phenylalanine , proline, serinee, threonine, tryptophane, tyrosine, valinee); Purinevaf Pyrimidine – loại 10mg (gồm có adenine, guanine, uracil,xanthine); Vitamin- loại 0,01-1mg (gồm có biotin, folate, nicotinic acid, pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine, ribòlavine, thiamine, pantothenate, para-aminobenzoic acid) Nguyên tố vi lượng - loại 2-10μg; Nước cất- 1000ml Căn vào trạng thái môi trường người ta chia thành môi trường đăc, môi trường bán đặc môi trường dịch thể Môi trường đặc Môi trường đặc (solid medium): loại môi trường làm đông đặc lại nhờ có bổ sung thêm thạch (agaragar), gelatin hay silica gel Môi trường đặc phải đảm bảo yêu cầu sau đây: Rau câu vàng  Không bị vi sinh vật nuôi cấy sử dụng  Giữ trạng thái đặc nhiệt độ nuôi cấy vi sinh vật Dễ hịa tan đun nóng (thường điều chỉnh lượng chứa chất làm đặc môi trường)  Nhiệt độ để làm đặc môi trường không thấp  Chất làm đặc mơi trường khơng có hại đôi với vi sinh vật  Chất làm đặc không bị phá hủy khử trùng môi trường  Giữ trạng thái suốt môi trường  Giá thành không cao, pha chế môi trường dễ dàng Thạch sản phẩm chế tạo từ Rau câu vàng (Gracilaria verucosa) hay tảo biển khác thuộc chi Gracilaria hay Gelidium Thạch có chứa khoảng 70% agarose khoảng 30% agaropectin Để làm tan thạch cần đun môi trường đến 1000 C để làm giữ môi trường thạch trạng thái lỏng cần giữ nhiệt độ khoảng 50-600C (trong nồi cách thủy) Để làm cho môi trường đặc lại cần hạ nhiệt độ xuống 40-450C Tùy chất lượng thạch mà làm môi trường người ta cho vào với tỷ lệ 15-20g/l Khi cần nuôi cấy vi sinh vật mơi trường thạch có pH từ trở xuống cần điều chỉnh mơi trường tới pH trung tính trước khử trùng, sau điều chỉnh lại đến pH thích hợp (nếu khơng thạch có bị thủy phân điều kiện pH thấp nhiệt độ cao) Robert Koch (1843-1910) Fannie Eilshemius (1850-1934) Walther Hesse (18461911 ) Người nghĩ đến sử dụng môi trường đặc nghiên cứu vi sinh vật Robert Koch tình cờ thấy khuẩn lạc vi khuẩn củ khoai tây ông dùng lát khoai tây để làm môi trường phân lập vi khuẩn vào năm 1881 Người dùng gelatin để chế tạo môi trường đặc vào năm trợ lý Koch, ông Frederick Loeffler Việc dùng thạch để làm chất đông đặc cô Minora Taraseemon phát hiện; nấu thức ăn với tảo biển để nguội cô thấy thức ăn đông đặc lại (1882) Người dùng thạch thay gelatin môi trường nuôi cấy vợ Walther Hess (một trợ lý khác Koch) - bà Fannie Eilshemius Hess Sau vài đặc điểm chủ yếu Thạch Gelatin: Đặc điểm chủ yếu Thạch Gelatin Đặc điểm Thạch Gelatin Nồng độ thường dùng (%) 1,5-2,0 5-12 Nhiệt độ hòa tan ( C) 96 25 Nhiệt độ đông ( C) 40 20 pH Hơi acid Acid Chất khoáng (%) 16 14-15 CaO (%) 1,15 MgO (%) 0,77 N (%) 0,4 18,3 Vi sinh vật sửdụng làm chất dinh dưỡng Tuyệt đại đa số không sử dụng Nhiều vi sinh vật sử dụng Môi trường bán đặc (semisolid medium): Môi trường bán đặc môi trường chứa 0,2-0,7% thạch thường sử dụng để quan sát khả di động vi sinh vật, quan sát hiệu giá thực khuẩn thể (phage) Môi trường dịch thể (liquid medium): Môi trường dịch thể hay môi trường lỏng môi trường không bổ sung chấy làm đông đặc môi trường Để thơng khí phải dùng tới máy lắc hay nồi lên men có hệ thống thổi khí vơ trùng (vô khuẩn) hệ thống khuấy đảo làm tan bọt khí Mơi trường dịch thể ngồi việc sử dụng nghiên cứu phịng thí nghiệm cịn sử dụng rộng rãi sản xuất lớn nhà máy lên men công nghiệp - Căn vào mục đích sử dụng người ta chia mơi trường ni cấy thành nhiều loại khác Môi trường sở (minimum medium): Các vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng khơng giống nói chung chất dinh dưỡng giống Mơi trường sở mơi trường có chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng, phát triển đa số vi sinh vật Môi trường sở thông dụng Môi trường cao thịt - peptone Môi trường sở dùng làm thành phần cho môi trường đặc biệt, tùy theo yêu cầu nhóm vi sinh vật mà bổ sung thêm chất dinh dưỡng cần thiết Môi trường làm giàu hay cịn gọi mơi trường gia phú (enrichment medium): Trên môi trường sở cho thêm số chất dinh dưỡng đặc biệt để thích hợp với việc ni cấy số nhóm vi sinh vật Các chất bổ sung thêm máu, huyết thanh, cao nấm men, mơ động vật hay thực vật Ví dụ để nuôi cấy vi khuẩn Bordetella pertussis người ta dùng môi trường sở Difco 0048 bổ sung thao tác vô trùng máu thỏ (đã lọc qua nến lọc) sau khử trùng môi trường 15 phút 1210C, cho nồng độ cuối 15% Bordetella pertussis Môi trường giám biệt (differential medium): Môi trường giám biệt dùng việc giám định loài vi sinh vật khác để xác định vị trí phân loại chúng Các môi trường giám biệt phương pháp sử dụng trình bày Tập I (Thế giới vi sinh vật) Chẳng hạn xác định khả sinh protease bổ sung casein hay gelatin, khả sinh amylase thêm tinh bột tan, khả sinh lipase thêm dầu ăn thị màu, khả sinh H2S thêm Pb acetate, Người ta thường dùng môi trường EMB (Eosin Methylene Blue) để giám biệt vi khuẩn đường ruột Mơi trường có thành phần sau: Peptone-10g; Lactose-5g; Saccharose-5g K2HPO4- 2g; EosinY-0,4g; Methylene Blue-0,065g; Nước cất-1000ml; pH=7,2 Môi trường ức chế vi khuẩn Gram (+) số vi khuẩn Gram (-) Từ mơi trường kiểm tra thêm vài thí nghiệm với khuẩn lạc xuất phân lập nhiều loại vi khuẩn đường ruột Gram (-) theo sơ đồ sau đây: a- Lên men lactic, sinh acid b- Sinh acid mạnh,khuẩn lạc chiếu sáng thấy có màu tía, phản quang có màu lục ánh kim Escherichia coli bb-Sinh acid yếu, khuẩn lạc có màu nâu gụ Enterobacter,Serratia, Klebsiella, Hafnia aa- Không lên men lactic, không sinh acid, khuẩn lạc vô màu Proteus, Salmonella, Shigella Môi trường chọn lọc (Selective medium): Dùng môi trường chọn lọc để phân lập nhóm vi sinh vật riêng biệt từ quần thể vi sinh vật tự nhiên Dựa vào yêu cầu dinh dưỡng đặc biệt nhóm vi sinh vật tính mẫn cảm khác hóa chất, với chất kháng sinh mà đưa thêm vào mơi trường chất tương thích, nhằm ức chế sinh trưởng nhóm vi sinh vật khác giúp cho phân lập nhóm vi sinh vật cần nghiên cứu Có mơi trường chọn lọc thiết kế dựa nhu cầu dinh đưỡng đặc biệt nhóm vi sinh vật định Ví dụ dùng cellulose hay dầu parafin làm nguồn carbon phân lập nhóm vi sinh vật phân hủy celluose hay phân hủy parafin, dùng protein làm nguồn nitrogen để phân lập vi sinh vật sản sinh proteinase, dùng môi trường không chứa nitrogen để phân lập vi sinh vật cố định nitrogen Ví dụ mơi trường vô đạm Ashby dùng để phân lập vi khuẩn Azotobacter có thành phần sau: Mannit-1%; KH2PO4-0,025%, MgSO4.7H2O-0,02%; NaCl0,02%; CaSO4.2H2O-0,01%; CaCO3-0,5% Cũng có loại mơi trường chọn lọc thêm 10% phenol làm ức chế sinh trưởng vi khuẩn vi nấm lại phân lập xạ khuẩn Nếu thêm vào môi trường Bi sulphat ức chế vi khuẩn Gram (+)và phần lớn vi khuẩn Gram (-), lại phân lập vi khuần thương hàn (Salmonella typhi) Thêm vào mơi trường Brilliant green hay Crystal violet ức chế vi khuẩn Gram (+) lại phân lập vi khuẩn Gram (-) Trêm vào môi trường Streptomycin ức chế nhiều loại vi khuẩn lại phân lập vi nấm Thêm vào mơi trường Na propionate ức chế nấm sợi lại phân lập nấm men Trong Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering) người ta thường xuyên sử dụng môi trường chọn lọc chứa kháng sinh xác định để tách chủng mang gene tái tổ hợp Trong thực tế có mơi trường vừa môi trường chọn lọc, vừa môi trường giám biệt Ví dụ để phân lập tụ cầu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) người ta thêm vào môi trường 7,5% NaCl, Mannit thị màu acid-kiềm Vi khuẩn vừa chịu nồng độ NaCl cao , vừa chuyển hóa mannit thành acid Staphylococcus aureus Sau số chất bổ sung vào môi trường (MT) chọn lọc cần thiết để phân lập số nhóm vi sinh vật định: Potassium tellurite (MT Mueller tellurite) để phân lập Corynebacterium diphtheriae; Tellurite Crystal violet (MT Mitis-salivarius) để phân lập Streptococcus; Na azide (MTAzide glucose) để phân lập Streptococcus; Phenylethanol (MT Phenylethanol) để phân lập Staphylococcus Streptococcus; Nước ép cà chua (MT nước ép cà chua) để phân lập vi khuẩn lactic từ nước bọt; Desoxycholate, citratee (MT Desoxycholate citratee) để phân lập vi khuẩn đường ruột Gram(-); Mật(bile),citratee, brilliant green (MT SS) để phân lập Salmonella Shigella; Malachite green dye (MT Lowenstein-Jensen) để phân lập Mycobacterium; Chloramphenicol (MT Emmon) để phân lập nấm; Rose Bengal Streptomycin (MT Martin) để phân lập nấm Corynebacterium diphtheriae Ngồi loại mơi trường kể cịn có loại mơi trường đặc biệt khác Đó Mơi trường phân tích (assay medium) dùng để định lượng vitamin, chất kháng sinh Đó Mơi trường khử (reduced medium) dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí Đó Mơi trường ni cấy mơ (Tissue-culture medium) chuyên phục vụ cho việc nuôi cấy tế bào mô động, thực vật, dùng để nuôi cấy tế bào nhóm vi sinh vật chuyên ký sinh virút, Chlamydia, Rickettsia, Spirochete Một số virút Rickettsia không phát triển môi trường nhân tạo mà phải nuôi cấy phôi gà, tế bào thận khỉ, thể động vật thực nghiệm Dưới vài gợi ý quan trọng chuẩn bị môi trường nuôi cấy Rất nhiều đường dễ bị phân giải trình khử trùng pH kiềm (đặc biệt với có mặt photsphate peptone), làm cho màu môi trường chuyển thành màu nâu sản phẩm tạo thành ức chế sinh trưởng vi sinh vật Để tránh tình trạng đó, người ta khử trùng mơi trường pH acid nhẹ khử trùng riêng biệt đường Tất kim loại vi lượng dễ dàng tạo nên muối photphat không tan kết tủa môi trường ni cấy Điều tránh cách bổ sung thêm nhân tố có lực với kim loại (metal-chelating agenets) EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) hay NTA (Nitrilotriacetic acid) acid cacboxylic citratee hay tartrate Việc thêm nhân tố có hiệu hai mặt Một mặt, ngăn chặn kết tủa kim loại vi lượng, mặt khác hoạt động giống bể chứa kim loại đó, cách làm giảm tính độc nhờ giảm nồng độ tự chúng (tới mức mà vi sinh vật sử dụng được) Ở mơi trường pH >7, kim loại kiềm thổ Ca Mg (dưới dạng vi lượng) dễ dàng kết tủa với diện photphate (hay có mặt ion Carbonate sử dụng mơi trường đệm bicacbonat, hay có sẵn nước cứng) tạo nên hàm lượng muối không tan cao Những kết tủa đơi khó thấy mắt thường, đặc biệt bình ni cấy lắc thể tích nhỏ mơi trường Để tránh điều này, mơi trường khử trùng pH acid (pH điều chỉnh sau), hay muối photphat khử trùng riêng rẽ với môi trường kết hợp sau làm nguội Cần ý đa số môi trường cổ điển sử dụng trước năm 60 kỷ trước thường không bao gồm nguyên tố vi lượng Sự thêm vào thường khơng cần thiết ngun tố vi lượng có chứa sẵn muối khơng tinh sử dụng để chuẩn bị cho môi trường Môi trường chuẩn bị với muối tinh cao nên không đáng ngạc nhiên thất bại việc tạo nhiều sinh khối sản phẩm không bổ sung nguyên tố vi lượng vào mơi trường Một ví dụ điển hình môi trường cổ điển M9 sử dụng rộng rãi cho sinh trưởng E.coli nghiên cứu di truyền Môi trường không cung cấp thuận lợi nguyên tố vi lượng cho phát triển E.coli vài hệ, sau chúng sinh truởng chậm lại cuối ngừng lại Môi trường nuôi cấy (Culture medium) Môi trường nuôi cấy chất dinh dưỡng pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển sản sinh sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng dùng nghiên cứu vi sinh vật trình sản xuất sản phẩm vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng yếu tố quan trọng công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật Môi trường nuôi cấy Nguyên tắc pha chế môi trường nuôi cấy  1) Chọn chất dinh dưỡng thích hợp: Nói chung mơi trường dinh dưỡng cần đáp ứng nhu cầu vi sinh vật nguồn C, nguồn N, nguồn muối khoáng, nguồn nhân tố sinh trưởng nước Vì loại hình dinh dưỡng vi sinh vật phức tạp, vi sinh vật khác có u cầu khơng giống chất dinh dưỡng có nhiều cơng thức pha chế môi trường nuôi cấy “Sách Danh lục môi trường nuôi cấy” (A Compilation of Culture Media) xuất từ năm 1930 ghi tới 2500 loại môi trường nuôi cấy khác Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tự dưỡng hoàn toàn pha chế từ hợp chất vơ Ví dụ để ni cấy vi khuẩn Thiobacillus thiooxidans gồm có thành phần sau (g/l): (NH4)2SO4 -0.4; MgSO4.7H2O - 0,5; FeSO4 - 0,01; KH2PO4 - 4; CaCl2 - 0,25; S- 10; pH: 7,0, khử trùng 121° C 20 phút Các vi khuẩn sử dụng CO2 khơng khí (hay hòa tan nước) để cung cấp nguồn carbon Với vi sinh vật tự dưỡng quang việc cung cấp chất dinh dưỡng cần tiết cần chiếu sáng để cung cấp lượng cho chúng Đối với vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp chất hữu nhu cầu dinh dưỡng nhóm khác khác Để nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coli dùng mơi trường đơn giản sau (g/l): Glucose - 5; NH4H2PO4- 1; MgSO4.7H2O - 0,2; K2HPO4 - 1; NaCl - 5; pH: 7,0-7,2, khử trùng 112 ° C 30 phút Nhưng cũngcó vi khuẩn dị dưỡng u cầu mơi trường ni cấy phức tạp Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus bifidus cần mơi trường sau (trong lít môi trường đậm đặc gấp đôi) : K 2HPO4 - 5g; Na-Acetat - 50g; NZ Case Peptone- 10g; Lactose- 70g; Alanin, Cystin, Tryptophan- loại 0,4g; Asparagin- 0,2g; Xanthin, Adenin, Guanin, Uracin - loại 0,02g; Dung dịch Muối B- 10ml; PyridoxinHCl - 2,4mg ; Tiamin-HCl - 0,4mg; Riboflavin- 0,4mg; Acid nicotinic- 1,2mg; Ca-Pentotenat - 0,8mg ; Biotin- 8,0 mcg (microgram); Acid folic- 20 mcg; Acid p-aminobenzoic- 20 mcg; Tween 80 - 1g Điều chỉnh pH đến 6,8 Thêm thao tác vô trùng 100ml dung dịch Acid ascorbic 1% lọc qua nến lọc vi khuẩn Điều chỉnh đến pH 6,5 Lại thêm thao tác vô trùng Sữa người loại kem cho nồng độ đạt 2% Dung dịch Muối B có thành phần sau (g/l): MgSO 4.7H2O-10; FeSO4.7H2O-0,5; NaCl-0,5; MnSO4.2H2O- 0,337 Thông thường để thay cho nhân tố sinh trưởng người ta thường dùng Peptone (thay cho aminoacid) cao nấm men (thay cho nhân tố sinh trưởng) Môi trường thường dùng để nuôi cấy vi khuẩn dị dưỡng Môi trường Cao thịt-Pepton với thành phần sau (g/l): Cao thịt (Beef extract) - 5; Peptone- 10; NaCl- 5; pH: 7,0-7,2; khử trùng 121 °C 20 phút Môi trường để nuôi cấy vi khuẩn Brevibacterium spp có thành phần sau (g/l): Cao nấm men (Yeast extract)-10; Glucose- 20; CaCO3 - 20 Người ta chia môi trường nuôi cấy thành nhiều loại khác Căn vào thành phần mơi trường ta có: mơi trường thiên nhiên, môi trường tổng hơp Môi trường thiên nhiên (complex medium): loại môi trường chứa chất hữu thiên nhiên khơng biết rõ thành phần hóa học thành phần hóa học khơng ổn định, cịn gọi mơi trường khơng xác định hóa học (chemically undefined medium) Các mơi trường Cao thịt-Pepton, môi trường Mạch nha, môi trường LB (Luria-Bertani) ví dụ loại mơi trường Thành phần môi trường LB sau (g/l): Peptone - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0; khử trùng 121 0C 21 phút Cao thịt nước chiết thịt cô đặc lại Cao thịt chứa chất đạm hữu cơ, đường, vitamin, muối khoáng- tất dễ tan nước Peptone dạng thủy phân protease hay acid thịt, casein, gelatin sau làm khơ lại thành dạng bột Peptone chứa phong phú chất đạm hữu cơ, có số vitamin đường Cao nấm men dịch tự phân (autolysate) tế bào nấm men cô đặc lại Cao nấm men chứa phong phú vitamin nhóm B, có chứa chất đạm hữu đường Ngồi loại nói mơi trường thiên nhiên cịn chế tạo từ nguyên liệu khác nước chiết khoai tây, nước chiết giá đậu, nước chiết đất, nước chiết rơm rạ, nước chiết lông vũ bột ngô, cám gạo, sữa, huyết thanh, nước ép cà rốt, nước dừa Vi sinh vật ưa phân (coprophilous microorganisms) dùng nước phân làm chất dinh dưỡng Giá thành môi trường thiên nhiên thường thấp, không sử dụng phịng thí nghiệm mà cịn sử dụng xí nghiệp lên men công nghiệp Bảng 13.17: Thành phần số loại peptone dịch thủy phân protein Chế phẩm(CP) Phản ứng Biure Các thành phần protein) (1) (% (2) (3) 6.7 7.4 3.2 1.7 5.2 4.9 7.8 9.2 2.4 2.3 3.0 2.7 2.1 Peptone Pharmacon + Peptone Vitte + Peptone Canbaum + Peptone Gee + Peptone Roche + CP thủy phân nhờ pepsin + CP thủy phân nhờ trypsin + Dịch thủy phân gluten - 0 00 Dịch thủy phân gelatin - 0 00 Chú thích: 3.5 4.1 0.2 4.5 5.3 2.1 2 3 1 (1)- Các polypeptid cao phân tử kết tủa tannin có mặt 2% H SO (2)- Các polypeptid kết tủa tannin mơi trường có phản ứng trung tính (3)- Các aminoacid tự peptid không bị ết tủa tannin Môi trường tổng hợp (synthetic medium): loại mơi trường có thành phần hóa học biết rõ cịn gọi mơi trường xác định hóa học (chemically defined medium) Ví dụ mơi trường Gause thích hợp cho Xạ khuẩn với thành phần sau (g/l): Tinh bột tan - 20; KNO - 1; NaCl - 0,5; K 2HPO4 3H2O- 0,5; K2HPO4 3H2O- 0,5; FeSO4 7H2O- 0,01, pH: 7,2-7,4; khử trùng 121 0C 21 phút Mơi trường tổng hợp có giá thành cao loại môi trường vi sinh vật phát triển tương đối chậm, nói chung thích hợp sử dụng phạm vi phịng thí nghiệm Có vi khuẩn địi hỏi môi trường tổng hợp đơn giản, chẳng hạn vi khuẩn Escherichia coli với môi trường sau đây: K2HPO4-7,0g; KH2PO4-2,0g; (NH4)2SO4-1,0g; MgSO4-0,1g; CaCl2-0,02g; Glucose-4-10g; Nguyên tố vi lượng (Fe,Co,Mn,Zn,Cu,Ni,Mo)-mỗi loại 2-10μg; Nước cất- 1000ml Es cherichi a coli Có vi sinh vật địi hỏi mơi trường tổng hợp phức tạp (và đắt tiền) Sau ví dụ mơi trường tổng hợp dùng để nuôi cấy vi tảo Euglena: acid glutamic-6g; acid aspartic-4g; Glycine-5g; Sacchaose-30g; Acid malic-1,04g; Acid boric-1,14mg; Thiamine HCl-12mg; KH2PO4- 0,6g; MgSO4-0,8g; CaCO3-0,16g; (NH4)2CO3- 0,72g; FeCl3-60mg; ZnSO4- 40mg; MnSO4-6mg; CuSO4- 0,62mg; CoSO4- 5mg ; (NH4)2MoO4- 1,34mg; Nước 1000ml Một ví dụ khác môi trường tổng hợp để nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides: K 2HPO4- 0,6g; KH2PO4- 0,6g; NH4Cl3g; MgSO4- 0,1g; Glucose- 25g; Na acetate- 20g; Các amino acid- loại 100-200μg (gồm có alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophane, tyrosine, valine); Purinevaf Pyrimidine – loại 10mg (gồm có adenine, guanine, uracil,xanthine); Vitaminmỗi loại 0,01-1mg (gồm có biotin, folate, nicotinic acid, pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine, ribolavine, thiamine, pantothenate, paraaminobenzoic acid) Nguyên tố vi lượng - loại 2-10μg; Nước cất- 1000ml  Căn vào trạng thái môi trường người ta chia thành môi trường đăc, môi trường bán đặc môi trường dịch thể Môi trường đặc (solid medium): loại môi trường làm đơng đặc lại nhờ có bổ sung thêm thạch (agar-agar), gelatin hay silica gel Môi trường đặc phải đảm bảo yêu cầu sau đây: - Không bị vi sinh vật nuôi cấy sử dụng Rau câu vàng -Giữ trạng thái đặc nhiệt độ nuôi cấy vi sinh vật Dễ hịa tan đun nóng (thường điều chỉnh lượng chứa chất làm đặc môi trường) -Nhiệt độ để làm đặc môi trường khơng q thấp -Chất làm đặc mơi trường khơng có hại đôi với vi sinh vật -Chất làm đặc không bị phá hủy khử trùng môi trường -Giữ trạng thái suốt môi trường -Giá thành không cao, pha chế môi trường dễ dàng Thạch sản phẩm chế tạo từ Rau câu vàng (Gracilaria verucosa) hay tảo biển khác thuộc chi Gracilaria hay Gelidium Thạch có chứa khoảng 70% agarose khoảng 30% agaropectin Để làm tan thạch cần đun môi trường đến 100 0C để làm giữ môi trường thạch trạng thái lỏng cần giữ nhiệt độ khoảng 50-60 0C (trong nồi cách thủy) Để làm cho môi trường đặc lại cần hạ nhiệt độ xuống 40-450C Tùy chất lượng thạch mà làm môi trường người ta cho vào với tỷ lệ 15-20g/l Khi cần nuôi cấy vi sinh vật mơi trường thạch có pH từ trở xuống cần điều chỉnh mơi trường tới pH trung tính trước khử trùng, sau điều chỉnh lại đến pH thích hợp (nếu khơng thạch có bị thủy phân điều kiện pH thấp nhiệt độ cao) Hình 13.4: Robert Koch (1843-1910) Người nghĩ đến sử dụng môi trường đặc nghiên cứu vi sinh vật Robert Koch tình cờ thấy khuẩn lạc vi khuẩn củ khoai tây ông dùng lát khoai tây để làm môi trường phân lập vi khuẩn vào năm 1881 Người dùng gelatin để chế tạo môi trường đặc vào năm trợ lý Koch, ông Frederick Loeffler Việc dùng thạch để làm chất đông đặc cô Minora Tarazaemon phát hiện; nấu thức ăn với tảo biển để nguội cô thấy thức ăn đông đặc lại (1882) Người dùng thạch thay gelatin môi trường nuôi cấy vợ Walther Hess (một trợ lý khác Koch) - bà Fannie Eilshemius Hess Sau vài đặc điểm chủ yếu Thạch Gelatin: Đặc điểm Thạch Gelatin Nồng độ thường dùng (%) 1,5-2,0 5-12 Nhiệt độ hòa tan ( C) 96 25 Nhiệt độ đông ( C) 40 20 pH Hơi acid Acid Chất khoáng (%) 16 14-15 CaO (%) 1,15 MgO (%) 0,77 N (%) 0,4 18,3 Vi sinh vật sử dụng làm chất dinh Tuyệt đại đa số không sử Nhiều vi sinh vật sử dưỡng dụng dụng Mơi trường bán đặc (semisolid medium): Môi trường bán đặc môi trường chứa 0,2-0,7% thạch thường sử dụng để quan sát khả di động vi sinh vật, quan sát hiệu giá thực khuẩn thể (phage) Môi trường dịch thể (liquid medium): Môi trường dịch thể hay môi trường lỏng môi trường không bổ sung chấy làm đơng đặc mơi trường Để thơng khí phải dùng tới máy lắc hay nồi lên men có hệ thống thổi khí vơ trùng (vơ khuẩn) hệ thống khuấy đảo làm tan bọt khí Mơi trường dịch thể việc sử dụng nghiên cứu phịng thí nghiệm cịn sử dụng rộng rãi sản xuất lớn nhà máy lên men công nghiệp - Căn vào mục đích sử dụng người ta chia môi trường nuôi cấy thành nhiều loại khác Môi trường sở (minimum medium): Các vi sinh vật có u cầu dinh dưỡng khơng giống nói chung chất dinh dưỡng giống Môi trường sở môi trường có chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng, phát triển đa số vi sinh vật Môi trường sở thông dụng Môi trường cao thịt - peptone Môi trường sở dùng làm thành phần cho môi trường đặc biệt, tùy theo yêu cầu nhóm vi sinh vật mà bổ sung thêm chất dinh dưỡng cần thiết Mơi trường làm giàu hay cịn gọi môi trường gia phú (enrichment medium): Trên môi trường sở cho thêm số chất dinh dưỡng đặc biệt để thích hợp với việc ni cấy số nhóm vi sinh vật Các chất bổ sung thêm máu, huyết thanh, cao nấm men, mô động vật hay thực vật Ví dụ để ni cấy vi khuẩn Bordetella pertussis người ta dùng môi trường sở Difco 0048 bổ sung thao tác vô trùng máu thỏ (đã lọc qua nến lọc) sau khử trùng môi trường 15 phút 121 0C, cho nồng độ cuối 15% Bo rdetella pertussis Môi trường giám biệt (differential medium) Môi trường giám biệt dùng việc giám định loài vi sinh vật khác để xác định vị trí phân loại chúng Các môi trường giám biệt phương pháp sử dụng trình bày Tập I (Thế giới vi sinh vật) Chẳng hạn xác định khả sinh protease bổ sung casein hay gelatin, khả sinh amylase thêm tinh bột tan, khả sinh lipase thêm dầu ăn thị màu, khả sinh H 2S thêm Pb acetat, Người ta thường dùng môi trường EMB (Eosin Methylene Blue) để giám biệt vi khuẩn đường ruột Mơi trường có thành phần sau: Peptone-10g; Lactose-5g; Saccharose-5g K 2HPO4- 2g; EosinY-0,4g; Methylene Blue-0,065g; Nước cất-1000ml; pH=7,2 Môi trường ức chế vi khuẩn Gram (+) số vi khuẩn Gram (-) Từ mơi trường kiểm tra thêm vài thí nghiệm với khuẩn lạc xuất phân lập nhiều loại vi khuẩn đường ruột Gram (-) theo sơ đồ sau đây: a- Lên men lactic, sinh acid b- Sinh acid mạnh,khuẩn lạc chiếu sáng thấy có màu tía, phản quang có màu lục ánh kim Escherichia coli bb-Sinh acid yếu, khuẩn lạc có màu nâu gụ Enterobacter,Serratia, Klebsiella, Hafnia aa- Không lên men lactic, không sinh acid, khuẩn lạc vô màu Proteus, Salmonella, Shigella Môi trường chọn lọc (Selective medium) Dùng môi trường chọn lọc để phân lập nhóm vi sinh vật riêng biệt từ quần thể vi sinh vật tự nhiên Dựa vào yêu cầu dinh dưỡng đặc biệt nhóm vi sinh vật tính mẫn cảm khác hóa chất, với chất kháng sinh mà đưa thêm vào mơi trường chất tương thích, nhằm ức chế sinh trưởng nhóm vi sinh vật khác giúp cho phân lập nhóm vi sinh vật cần nghiên cứu Có mơi trường chọn lọc thiết kế dựa nhu cầu dinh đưỡng đặc biệt nhóm vi sinh vật định Ví dụ dùng cellulose hay dầu parafin làm nguồn carbon phân lập nhóm vi sinh vật phân hủy celluose hay phân hủy parafin, dùng protein làm nguồn nitrogen để phân lập vi sinh vật sản sinh proteinase, dùng môi trường không chứa nitrogen để phân lập vi sinh vật cố định nitrogen Ví dụ mơi trường vô đạm Ashby dùng để phân lập vi khuẩn Azotobacter có thành phần sau: Mannit-1%; KH 2PO4-0,025%, MgSO4.7H2O-0,02%; NaCl-0,02%; CaSO4.2H2O-0,01%; CaCO3-0,5% Cũng có loại mơi trường chọn lọc thêm 10% phenol làm ức chế sinh trưởng vi khuẩn vi nấm lại phân lập xạ khuẩn Nếu thêm vào môi trường Bi sulphat ức chế vi khuẩn Gram (+)và phần lớn vi khuẩn Gram (-), lại phân lập vi khuần thương hàn (Salmonella typhi) Thêm vào môi trường Brilliant green hay Crystal violet ức chế vi khuẩn Gram (+) lại phân lập vi khuẩn Gram (-) Trêm vào môi trường Streptomycin ức chế nhiều loại vi khuẩn lại phân lập vi nấm Thêm vào mơi trường Na propionat ức chế nấm sợi lại phân lập nấm men Trong Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering) người ta thường xuyên sử dụng môi trường chọn lọc chứa kháng sinh xác định để tách chủng mang gen tái tổ hợp Trong thực tế có mơi trường vừa môi trường chọn lọc, vừa môi trường giám biệt Ví dụ để phân lập tụ cầu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) người ta thêm vào môi trường 7,5% NaCl, Mannit thị màu acid-kiềm Vi khuẩn vừa chịu nồng độ NaCl cao , vừa chuyển hóa mannit thành acid Staph ylococcus aur eus Sau số chất bổ sung vào môi trường (MT) chọn lọc cần thiết để phân lập số nhóm vi sinh vật định: Potassium tellurite (MT Mueller tellurite) để phân lập Corynebacterium diphtheriae; Tellurite Crystal violet (MT Mitis-salivarius) để phân lập Streptococcus; Na azide (MTAzide glucose) để phân lập Streptococcus; Phenylethanol (MT Phenylethanol) để phân lập Staphylococcus Streptococcus; Nước ép cà chua (MT nước ép cà chua) để phân lập vi khuẩn lactic từ nước bọt; Desoxycholate, citrate (MT Desoxycholate citrate) để phân lập vi khuẩn đường ruột Gram(-); Mật(bile),citrate, brilliant green (MT SS) để phân lập Salmonella Shigella; Malachite green dye (MT Lowenstein-Jensen) để phân lập Mycobacterium; Chloramphenicol (MT Emmon) để phân lập nấm; Rose Bengal Streptomycin (MT Martin) để phân lập nấm Corynebacterium diphtheriae Ngồi loại mơi trường kể cịn có loại mơi trường đặc biệt khác Đó Mơi trường phân tích (assay medium) dùng để định lượng vitamin, chất kháng sinh Đó Môi trường khử (reduced medium) dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí Đó Mơi trường ni cấy mô (Tissue-culture medium) chuyên phục vụ cho việc nuôi cấy tế bào mô động, thực vật, dùng để ni cấy tế bào nhóm vi sinh vật chuyên ký sinh virút, Chlamydia, Rickettsia, Spirochete Một số virút Rickettsia không phát triển môi trường nhân tạo mà phải nuôi cấy phôi gà, tế bào thận khỉ, thể động vật thực nghiệm Dưới vài gợi ý quan trọng chuẩn bị môi trường nuôi cấy Rất nhiều đường dễ bị phân giải trình khử trùng pH kiềm (đặc biệt với có mặt photsphate peptone), làm cho màu môi trường chuyển thành màu nâu sản phẩm tạo thành ức chế sinh trưởng vi sinh vật Để tránh tình trạng đó, người ta khử trùng môi trường pH acid nhẹ khử trùng riêng biệt đường Tất kim loại vi lượng dễ dàng tạo nên muối photphat không tan kết tủa mơi trường ni cấy Điều tránh cách bổ sung thêm nhân tố có lực với kim loại (metal-chelating agents) EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) hay NTA (Nitrilotriacetic acid) axit cacboxylic citrate hay tartrate Việc thêm nhân tố có hiệu hai mặt Một mặt, ngăn chặn kết tủa kim loại vi lượng, mặt khác hoạt động giống bể chứa kim loại đó, cách làm giảm tính độc nhờ giảm nồng độ tự chúng (tới mức mà vi sinh vật sử dụng được) Ở mơi trường pH >7, kim loại kiềm thổ Ca Mg (dưới dạng vi lượng) dễ dàng kết tủa với diện photphate (hay có mặt ion carbonate sử dụng môi trường đệm bicarbonat, hay có sẵn nước cứng) tạo nên hàm lượng muối không tan cao Những kết tủa khó thấy mắt thường, đặc biệt bình ni cấy lắc thể tích nhỏ mơi trường Để tránh điều này, mơi trường khử trùng pH axit (pH điều chỉnh sau), hay muối photphat khử trùng riêng rẽ với môi trường kết hợp sau làm nguội Cần ý đa số môi trường cổ điển sử dụng trước năm 60 kỷ trước thường không bao gồm nguyên tố vi lượng Sự thêm vào thường khơng cần thiết nguyên tố vi lượng có chứa sẵn muối không tinh sử dụng để chuẩn bị cho môi trường Môi trường chuẩn bị với muối tinh cao nên không đáng ngạc nhiên thất bại việc tạo nhiều sinh khối sản phẩm không bổ sung ngun tố vi lượng vào mơi trường Một ví dụ điển hình mơi trường cổ điển M9 sử dụng rộng rãi cho sinh trưởng E.coli nghiên cứu di truyền Môi trường không cung cấp thuận lợi nguyên tố vi lượng cho phát triển E.coli vài hệ, sau chúng sinh truởng chậm lại cuối ngừng lại GS Nguyễn Lân Dũng Thứ 2, ngày 18/02/2013 11:16 1.2.2 Phân loại Staphylococcus theo men Coagulase: Trên phương diện gây bệnh tụ cầu khuẩn chia làm hai nhóm chính: có men Coalugase khơng có men Coagulase 1.2.2.1 Tụ cầu có men Coagulase: Nhờ men coagulase mà mơi trường ni cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng Do vi khuẩn gọi tụ cầu vàng Các vi khuẩn quan trọng nhóm là: + Staphylococcus aureus +Staphylococcua intermedius 1.2.2.2 Tụ cầu khơng có men Coagulase: - Do khơng có men coagulase nên mơi trường ni cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà Trên lâm sàng thường gọi vi khuẩn tụ cầu trắng Các vi khuẩn nhóm kể: + Staphylococcus epidermidis + Staphylococcus saprophyticus + Staphylococcus haemolyticus + Staphylococcus capitis + Staphylococcus simulans + Staphylococcus hominis + Staphylococcus warneri - Cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không diện người 1.2.3 Phân loại Staphylococcus kháng nguyên: - Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn khó khăn Các kháng nguyên bề mặt tế bào quan tâm - Acid teichoic : kháng nguyên ngưng kết chủ yếu tụ cầu làm tăng tác dụng hoạt hóa bổ thể Đây chất bám dính tụ cầu vào niêm mạc mũi Acid gắn polysaccharid vách tụ cầu vàng Đây kháng nguyên O - Protein A : protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng 100% chủng tụ cầu vàng có protein ... nuôi cấy (Culture medium) Môi trường nuôi cấy chất dinh dưỡng pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển sản sinh sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng. .. khác Môi trường sở (minimum medium): Các vi sinh vật có u cầu dinh dưỡng khơng giống nói chung chất dinh dưỡng giống Môi trường sở môi trường có chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng, ... Vì loại hình dinh dưỡng vi sinh vật phức tạp, vi sinh vật khác có yêu cầu không giống chất dinh dưỡng có nhiều cơng thức pha chế mơi trường nuôi cấy “Sách Danh lục môi trường nuôi cấy? ?? (A Compilation