Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng lactobacillus plantarum nt1 5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: TỐI ƯU HỐ MƠI TRƯỜNG NI CẤY CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH SVTH : TRẦN THỊ KIỀU MSSV : 1053012348 KHOÁ: 2010 – 2014 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014 TỔNG QUAN TÀI LIỆU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Con đường biến dưỡng vi khuẩn lactic 1.1.3 Tổng quan Lactobacillus plantarum 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS 10 1.2.1 Các nghiên cứu giới 10 1.2.2 Các nghiên cứu nước 11 1.3 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 12 1.3.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 12 1.3.2 Thí nghiệm sàng lọc 14 1.3.3 Thí nghiệm tối ưu hóa 16 1.4 PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU 24 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2.2 Môi trường – hóa chất 24 2.2.3 Dụng cụ 24 2.2.4 Trang thiết bị 24 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Hoạt hóa chủng 25 2.3.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng L plantarum NT 1.5 26 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3.4 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho tăng trưởng L plantarum NT1.5 27 2.3.5 Sàng lọc yếu tố dinh dưỡng 28 2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman 30 2.3.7 Thí nghiệm khởi đầu 32 2.3.8 Tìm khoảng tối ưu yếu tố ảnh hưởng phương pháp leo dốc 32 Thí nghiệm bề mặt tiêu xác định giá trị tối ưu yếu tố ảnh 2.3.9 hưởng 33 2.3.10 Xác định thời gian tăng trưởng chủng L plantarum NT1.5 môi trường tối ưu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 35 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT 1.5 36 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 38 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG 39 3.4.1 Nguồn nitơ 39 3.4.2 Nguồn cacbon 41 3.4.3 Nguồn khoáng 42 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN 44 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU 48 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC 50 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN 52 3.9 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU 57 4.1 KẾT LUẬN 61 4.2 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 68 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iii TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cholesterol máu tăng làm tăng nguy bệnh tim đột quỵ, phần ba bệnh tim thiếu máu cục cholesterol cao Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính gây 2,6 triệu ca tử vong (4,5% tổng số) 29,7 triệu người gánh hậu Tổng số cholesterol máu cao nguyên nhân gây bệnh tật nước phát triển phát triển yếu tố nguy bệnh tim thiếu máu cục đột quỵ (WHO, 2013) Việc giảm cholesterol vấn đề quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim cs., 2004) Một giải pháp nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt tính probiotic vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol vấn đề thiết thực, nhiều nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu Trong năm gần có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…) có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005) Ngồi ra, vi khuẩn lactic cịn có khả giảm cholesterol cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno, 2007) Ngày việc sản xuất thực phẩm chức chứa vi khuẩn probiotic Lactobacilli có tầm quan trọng ngày tăng Những vi khuẩn có tác dụng kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Shahravy, 2012) Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 chứng minh có khả làm giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào khả sinh enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả chịu pH dày, kháng muối mật, kháng khuẩn,… (Dương Nhật Linh, 2013) Vì Lactobacillus plantarum NT1.5 ứng dụng để sản xuất chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm cholesterol Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học ngày tăng Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật quan tâm Do đó, nghiên cứu phát triển mơi trường nuôi cấy để tăng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TỔNG QUAN TÀI LIỆU cường sản xuất sinh khối dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu kinh tế (Shahravy, 2012) Vì chúng tơi thực đề tài “Tối ưu hóa mơi trường ni cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 phương pháp quy hoạch thực nghiệm” Nội dung thực hiện:  Xây dựng biểu đồ thể mối tương quan giá trị OD nồng độ tế bào tương ứng với giá trị OD  Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng L plantarum NT1.5, xác định thời gian tăng trưởng tối ưu vi khuẩn  Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho phát triển chủng L plantarum NT1.5  Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ nguồn khoáng  Xác định yếu tố ảnh hưởng đến q trình tăng sinh khối Lactobacillus plantarum NT1.5 thiết kế Plackett – Burman (P - B)  Xác định giá trị tối ưu thành phần dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy phương pháp Box-Behnken  Nuôi cấy thử nghiệm SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Giới thiệu Vi khuẩn lactic acid (LAB) nhóm vi khuẩn phổ biến tự nhiên ứng dụng nhiều ngành công nghiệp, chế phẩm sinh học an tồn cho người (David, 2013) Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic xếp: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus Họ II: Enterococceae Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus Vi khuẩn lactic vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào tử, phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm Những vi khuẩn có khả sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sống yếu, chúng vi sinh vật khuyết dưỡng nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin…, bình thường chúng khơng có cytochrome Vì vậy, chúng xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, gọi vi hiếu khí, có khả lên men điều kiện vi hiếu khí kỵ khí SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TỔNG QUAN TÀI LIỆU LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi niêm mạc ruột người động vật LAB bao gồm khoảng 20 chi chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus Streptococcus chi điển hình (Marcel, 2005) Trong tế bào chúng có dạng hình cầu Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hình que Lactobacillus a b Hình 1.1 Streptococcus a: Streptococcus kính hiển vi điện tử b: Streptococcus nhuộm Gram a b Hình 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus KHV điện tử b:Lactobacillus nhuộm Gram SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Tú Anh, Lê Thị Mỹ Linh, Nguyễn Văn Thanh (2003), “Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus casei”, Tạp chí Y học TP HCM, Chuyên đề Dược, 7(4), Tr 195-197 [2] Nguyễn Đăng Diệp, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên cứu thơng số thích hợp qui trình cơng nghệ lên men sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic", Tuyển tập công tác nghiên cứu Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB Nông Nghiệp [3] Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập Vi sinh vật học, NXB Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội [4] Nguyễn Văn Dự, Nguyễn Đăng Bình (2011), ” Quy hoạch thực nghiệm kỹ thuật”, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, Tr.9-26, 138-216 [5] Nguyễn Thành Đạt (2011), Cơ sở sinh học vi sinh vật tập 1, NXB Đại học Sư Phạm [6] Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2003), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, Tr 251-255 [7] Giang Thị Kim Liên (2009), Bài giảng Qui hoạch thực nghiệm (các phương pháp thống kê xử lý số liệu thực nghiệm), Trường Đại Học Đà Nẵng [8] Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic phân lập địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 24, Tr.221-226 [9] Dương Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung, Phạm Thị Minh Trang, Trần Cát Đông (2013), “Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam lần III “Cơng nghệ sinh học sống”, Tr 151 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO [10] Nguyễn Đức Lượng Cao Cường (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 1- thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [11] Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai (2012), phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra”, Tạp chí Khoa học, Pp 224-234 [12] Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phương Trang, Phạm Thị Hồng Tươi (2001), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43 [13] Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng, Võ Cẩm Quy (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh Tiếng Anh [14] Barthelmebs L., Divies C., and Cavin J F (2000), “Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two othe inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism”, Appl Environ Microbiol, 66: Pp 3368-3375 [15] Barthelmebs, L., Divies, C and Cavin, J-F (2001), “Molecular characterization of the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum”, Lait, 81:Pp 161-171 [16] Bevilacqua A., Corbo M R., Mastromatteo M and Sinigaglia M (2008), “Combined effects of pH, yeast extract, carbohydrates and di-ammonium hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic Lactobacillus plantarum strain, isolated from table olives, in a batch system”, World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp 1721–1729 [17] Daeschel M A and Nes I F (1995), Lactobacillus plantarum: physiology, genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New York, chap 21, Pp 721-743 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO [18] David M I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M M and Sherri A M (2013), “Natural Farming: Lactic Acid Bacteria”, College of Tropical Agriculture and Human Resources”, [19] David D., Tryon V V and Dennis J P (1989), “Metabolism of Mollicutes: the Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexose Monophosphate Shunt”, Journal of General Microbiology, Vol 135, Pp.683-691 [20] FAO/WHO(2001), “Report of a joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria”, Co´rdoba, Argentina [21] Farooq U., Anjum F M., Zahoor T., Rahman S U., Randhawa A., Ahmed A and Akram K (2012), “Optimization of lactic acid production from cheap raw material: sugarcane molasses”, Pak J Bot., 44(1):Pp.333-338 [22] Han B., Yu Z., Liu B., Ma Q and Zhang R (2011), “Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum YJG, isolated from the mucosa of the gut of healthy chickens”, African Journal of Microbiology Research, Pp 1147-1155 [23] Karlsson C., Ahrne S and Molin G ( 2009), “Probiotic therapy to men with incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a randomized controlled trial”, Atherosclerosis [24] Kleerebezem M., Boekhorst J., Kranenburg R V., Molenaar D., Kuipers O P., Leer R., Tarchini R., Peters S A., Sandbrink H M., Fiers M W E J., Stiekema W., Lankhorst R M K., Bron P A., Hoffer S M., Groot M N N., Kerkhoven R., Vries M., Ursing B., Vos W M and Siezen R J (2003), “Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1”, Proc Natl Acad Sci U.S.A, 100:Pp 1990-1995 [25] Lim H J., Kim S Y and Lee W K (2004), “Isolation of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use”, Veterinary Science SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO [26] Lonnermark E., Friman V and Lappas G (2009), “Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics”, J Clin Gastroenterol [27] Marcel D (2005), “Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Third Edition (Food Science and Technology)”, Library of congress Cataloging-in- publication Data, ISBN 0-203- 02673 X Master e-book ISBN [28] Nagarjun P A., Rao R S., Rajesham S and Rao L V (2005), “Optimization of Lactic Acid Production in SSF by Lactobacillus amylovorus NRRL B-4542 Using Taguchi Methodology”, The Journal of icrobiology, Pp 38-43 [29] Muhamad Nor N., Mohamad R., Ling Foo H and Rahim R A (2010), Improvement of Folate Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria Using Response Surface Methodology”, Food Technol Biotechnol, 48(2):Pp 243–250 [30] Nissen L., Chingwaru W and Sgorbati B (2009 ), “Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp Strains: a functional study in the small intestinal cell model”, Int J Food Microbiol, Pp 288-94 [31] Ooi L G and Liong M T (2010), “Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings”, International Journal of Molecular Sciences [32] Plackett R L and Burman J P (1946), “The Design of Optimum Multifactorial Experiments”, Biometrika, Pp 305-325 [33] Qin H., Zhang Z and Hang X (2009), “L.plantarum prevents enteroinvasive Escherichia coli-induced tight junction protein changes in intestinal epithelial cells”, BMC MicrobioJ, Pp 31;9;63 [34] Reichelt J L (2013), “The impact of Technical Exellence in Microbiology on the results obtained with Silage Inoculants and Bacterial Biopesticcides”, Bacterial Fermentation Pty Ltd [35] Shahravy A., Tababdeh F., Bambai B., Zamanizadeh H R and Mizani M (2012), “Optimization of probiotiic Lactobicillus casei ATCC 334 production using date SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO powder as cacbon source”, Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterl, Pp 273−282 [36] Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T and Mierau I (2006), “Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976”, World Journal of Microbiology & Biotechnology [37] Vamanu E cs (2009), “Studies regarding the production of probiotic biomass from Lactobacillus plantarum strains”, Archiva Zootechnica, Pp 92-101 [38] Vaquero, I., Marcobal, A and Muñoz, R (2004), “Tannase activity by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine”, International Journal of Food Microbiology , 96: Pp 199-204 [39] Waugh A W G., Foshaug R., Macfarlane S., Doyle J., Churchili T A., Sydora B C and Fedorakr R N (2009), “Effect of Lactobacillus plantarum 299v treatment in an animal model of irritable bowel syndrome”, Microbial Ecology in Health and Disease, Pp 33-37 [40] Ziarno M., Sekul E and Lafraya A A (2007), “Cholesterol assimilation by commercial yoghurt starter cultures”, Acta Sci Pol., Technol Aliment, Pp 83-94 Tài liệu web [41] Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum (2010) http://www.naturalnews.com/027845_probiotics_health.html##ixzz32e0f5rNg [42].WHO(2013), http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_text/en/index.html SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 67 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG  Thành phần môi trường MRS: − Peptone 10 g − Cao thịt 10 g − Cao nấm men g − Glucose 20 g − K2HPO4 g − Natri acetate g − MgSO4.7H2O 0,2 g − MnSO4.4H2O 0,2 g − Tween 80 mL − (NH4)citrate g − Nước 1000 mL  Thành phần môi trường MRSA: giống thành phần môi trường MRS bổ sung thêm 20g agar SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 68 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ Bảng 2.1 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến khả tăng trưởng L plantarum NT1.5 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 69 PHỤ LỤC Bảng 2.1 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố nguồn Nitơ khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 70 PHỤ LỤC Bảng 2.2.Kkết xử lí thống kê ANOVA yếu tố nguồn Cacbon khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 71 PHỤ LỤC Bảng 2.3 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố nguồn muối khoáng khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 72 PHỤ LỤC Đồ thị 2.1: Đồ thị ảnh hưởng chuẩn hóa SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 73 PHỤ LỤC Đồ thị 2.2 Pareto yếu tố ảnh hưởng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 74 PHỤ LỤC Bảng 2.4 Kết phân tích hồi quy phương sai cho thí nghiệm P-B SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 75 PHỤ LỤC Bảng 2.5 Kết phân tích hồi quy phương sai thí nghiệm khởi đầu SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 76 PHỤ LỤC Bảng 2.6 Kết phân tích hồi quy phương sai thí nghiệm Box-Behnken SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 77