Chuyên đề rutin từ hoa hòe

M CL C Ch ng T NG QUAN 1.1 Đ I C NG FLAVONOID 1.1.1 Khái ni m 1.1.2 C u trúc hóa học 1.1.3 Phơn lo i 1.1.4 Tính ch t 1.1.5 Chi t xu t [1] 1.2 CÂY HÒE 1.2.1 Đặc điểm cơy 1.2.2 Phơn bố thu hái 1.2.3 ThƠnh phần hóa học 1.2.4 ng dụng y học 1.3 RUTIN 1.3.1 Cơng th c hóa học vƠ tính ch t 1.3.2 Định tính vƠ định l ợng 1.3.3 Tác dụng d ợc lý 10 1.3.4 ng dụng 11 1.3.5 Các ph Ch ng pháp chi t xu t rutin từ hòe hoa 11 ng QUÁ TRÌNH CHI T XU T, TINH CH RUTIN 14 2.1 Nguyên v t li u 14 2.1.1 Nguyên li u 14 2.1.2 Hóa ch t vƠ dung mơi 14 2.1.3 Trang thi t bị 14 2.2 Quy trình chi t rutin từ hoa hòe 15 2.3 Kiểm nghi m 18 Ch ng BÀN LU N 20 TÀI LI U THAM KH O 23 DANH M C HÌNH VẼ Hình 1.1 C u trúc chung c a flavonoid .2 Hình 1.2 C u trúc có dị vịng oxy Hình 1.3 Cơng th c c u t o c a rutin Hình 2.1 Nụ hịe khơ 14 Hình 2.2 S đ chi t xu t rutin từ nụ hoa hòe 15 Hình 2.3 Rutin k t tinh 17 Hình 2.4 Tinh thể rutin vƠ bƣ d ợc li u 17 Hình 2.5 K t qu định tính 19 Hình 2.6 Hình nh đo điểm ch y 19 Ch 1.1 Đ I C ng T NG QUAN NG FLAVONOID 1.1.1 Khái ni m Flavonoid lƠ nhóm ch t quan trọng s n phẩm tự nhiên, đặc bi t lƠ nhóm chuyển hóa th c p có c u trúc polyphenolic, đ ợc tìm th y rộng rƣi lo i qu , rau, vƠ số đ uống nh t định Các hợp ch t nƠy có ho t tính sinh học vƠ ho t tính chống oxy hóa liên quan đ n b nh khác nh ung th , alzheimer, x vữa động m ch, Flavonoid có liên quan đ n lo t tác dụng thúc đẩy s c khỏe vƠ lƠ thƠnh phần thi u nhiều ng dụng dinh d ỡng, d ợc phẩm, mỹ phẩm khác đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống gơy đột bi n vƠ chống ung th k t hợp với kh điều chỉnh ch c enzym t bƠo Chúng đ ợc bi t lƠ ch t c ch m nh với nhiều enzym, ví dụ xanthin oxidase, cyclo oxygenase, lipoxygenase vƠ phosphoinositid-3-kinase Trong tự nhiên, hợp ch t flavonoid lƠ s n phẩm chi t xu t từ thực v t vƠ đ ợc tìm th y nhiều ph n cơy Các flavonoid đ ợc tìm th y thực phẩm vƠ đ uống có ngu n gốc thực v t nh hoa qu , rau, trƠ, ca cao vƠ r ợu vang chúng đ ợc định nh flavonoid ch độ ăn kiêng Các flavonoid có vai trị khác ho t tính sinh học thực v t, động v t, vi khuẩn Trong thực v t, flavonoid đ ợc bi t đ n lƠ đ ợc t ng hợp vị trí cụ thể vƠ chịu trách nhi m mƠu sắc vƠ h ng th m c a hoa, vƠ trái cơy để thu hút thụ ph n giúp n y mầm vƠ bƠo tử, lớn lên vƠ phát triển c a cơy non Các flavonoid b o v cơy tr ng khỏi stress sinh học vƠ phi sinh học khác vƠ ho t động nh lọc tia cực tím độc đáo 1.1.2 C u trúc hóa học Các flavonoid có c u t o c b n g m vòng benzen A vƠ B nối với qua m ch carbon (Hình 1.1) [1] Hình 1.1 C u trúc chung c a flavonoid Xét mặt nguyên sinh ng i ta xem c u trúc c a flavonoid g m phần: Phần C6-C3 (vòng B vƠ carbon) xu t phát từ acid shikimic d n đ n d n ch t phenylpropan; phần C2-C2-C2 (vòng A)xu t phát từ đ n vị acetat d n đ n acid triacetic.Trong đa số tr ng hợp m ch carbon đóng vịng với vịng A vƠ t o nên dị vịng có oxy (vịng C) (Hình 1.2) [1] Hình 1.2 C u trúc có dị vịng oxy 1.1.3 Phơn lo i Flavonoid đ ợc phơn thƠnh nhóm khác phụ thuộc vƠo carbon cu vịng C mƠ vịng B đ ợc gắn vƠo vƠ m c độ bƣo hòa vƠ oxy hóa c a vịng C Các flavonoid mƠ vịng B đ ợc liên k t vị trí c a vòng C đ ợc gọi lƠ isoflavonon Những hợp ch t mƠ vòng B đ ợc liên k t đ ợc gọi neoflavonoid, vịng B đ ợc liên k t vị trí vị trí đ ợc chia nhỏ thƠnh nhiều phơn nhóm nhỏ dựa đặc điểm c u trúc c a vịng C Các phơn nhóm nƠy g m: flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, flavanol catechin, anthocyanin vƠ chalcon [1] Flavon lƠ phơn nhóm quan trọng c a flavonoid flavon có mặt rộng rƣi lá, hoa, qu nh glucosid Cần tơy, rau mùi tơy, ớt đỏ, hoa cúc, b c hƠ, vƠ b ch qu lƠ ngu n c a flavon Luteolin, apigenin vƠ tangeritin thuộc phơn lớp nƠy Vỏ trái cơy họ cma quýt giƠu flavon polymethoxy hóa, tageretin, nobiletin, vƠ sinensetin Chúng có liên k t đơi vị trí vƠ vƠ keton vị trí c a vòng C Phần lớn flavon rau vƠ trái cơy có nhóm hydroxy A, hydroxy hóa vị trí khác, hầu h t vị trí c a vịng vị trí c a vịng A vị trí 3’ vƠ 4’ vịng B thay đ i theo phơn lo i rau trái cơy [5] Flavanon lƠ phơn nhóm quan trọng khác th ng có t t c lo i trái cơy họ cam, chanh, nho Hesperitin, naringenin vƠ eriodictyol lƠ ví dj cho phan nhóm nƠy Flavanon có liên quan tới nhiều lợi ích s c khỏe b i đặc tính quét gốc tự Các hợp ch t nƠy chịu trách nhi m cho vị đắng c a n ớc ép vƠ vỏ trái cơy họ cam quýt Các flavonoid họ cam có tác dụng d ợc lý nh chống oxy hóa, chống viêm, h lipid máu vƠ gi m cholesterol Flavanon đ ợc gọi lƠ dihydroflavon, có vịng C bƣo hịa, khơng giống nh flavon liên k t đơi vị trí vƠ lƠ bƣo hịa vƠ đơy lƠ khác bi t nh t c u trúc nhóm flavonoid Trong 15 năm qua số l ợng flavanon đƣ tăng đáng kể [3] Isoflavonoid lƠ phơn nhóm r t đặc bi t vƠ lớn c a flavonoid Isoflavonoid đ ợc phơn bố h n ch giới thực v t vƠ đ ợc tìm th y đ u t ng vƠ lo i cơy họ đ u khác Một số isoflavonoid đƣ đ ợc báo cáo lƠ có mặt vi khuẩn Chúng đ ợc tìm th y có vai trị quan trọng nh tiền ch t cho phát triển c a phytoalexin t ng tác vi khuẩn thực v t Isoflavonoid thể hi n tiềm chống l i nhiều b nh t t Các Isoflavonoid nh genistein vƠ daidzein th ng đ ợc coi lƠ phytoestrogen b i ho t tính estrogen mơ hình động v t [2] 1.1.4 Tính ch t Các flavonoid có mƠu thay đ i từ đỏ cam đ n vƠng nh t vƠ không mƠu tùy thuộc vƠo số nối đôi liên hợp nh flavon có mƠu vƠng r t nh t cho đ n không mƠu, chalcon vƠ auron mƠu vƠng đ m đ n đỏ cam, d n ch t isoflavon, flavanon, khơng có liên k t đơi nên khơng có mƠu Riêng anthocyanidin có mƠu thay đ i theo pH môi tr ng [1] Về độ tan, flavonoid có độ tan khơng giống nhau, th ng flavonoid glycosid vƠ flavonoid sulfat phơn cực nên khơng tan tan dung mơi hữu c , tan đ ợc n ớc, c n n ớc Trong aglycon flavonoid tan dung môi hữu c , không tan n ớc Các d n ch t flavonoid có nhóm 7- OH th ng d tan kiềm loƣng [1] Một số ph n ng dùng định tính flavonoid [1]:  Ph n ng với FeCl3 cho mƠu lục, xanh, nơu tùy thuộc số nhóm OH;  Ph n ng với kiềm cho mƠu thay đ i từ vƠng đ n đỏ cam phụ thuộc vƠo n ng độ vƠ nhóm flavonoid;  Ph n ng cyanidin(Mg/HCl) ph n ng xác định có mặt c a nhóm th dựa vƠo ph n ng khử hóa mƠ cho mƠu đỏ cam, đỏ th m đỏ t i;  Ph n ng với acid sulfuric đ m đặc: flavon, flavonol cho mƠu vƠng đ m Chalcon vƠ auron cho mƠu đỏ, đỏ thắm, đỏ t đỏ cam r i đỏ thắm i Flavanon cho mƠu  Ph n ng ghép đôi với muối diazoni: d n ch t flavonoid có nhóm OH vị trí ph n ng với muối diazoni t o thƠnh d n ch t azoic vƠng cam đ n đỏ  Sắc ký lớp mỏng sắc ký gi y, phát hi n v t sắc ký dựa vƠo mƠu sắc c a v t sắc ký ánh sáng th ng, huỳnh quang ánh sáng tử ngo i tr ớc vƠ sau tác dụng với kiềm h amoniac 1.1.5 Chi t xu t [1] Khơng có ph ng pháp chung nƠo để chi t xu t flavonoid chúng r t khác độ tan n ớc vƠ dung môi hữu c Các flavonoid glycosid th ng d tan dung môi phơn cực, flavonoid aglycon d tan dung môi phơn cực Các d n ch t flavon, flavonol có OH tự vị trí tan đ ợc dung dịch kiềm loƣng, dựa vƠo để chi t Ví dụ để chi t rutin hoa hịe ta dùng dung dịch kiềm Na2CO3 loƣng để hoƠ tan flavonoid khỏi nguyên li u, sau acid hố HCl để k t t a l i rutin Thông th ng để chi t flavonoid glycosid, ng i ta ph i lo i ch t thơn dầu ether dầu hỏa sau chi t n ớc nóng methanol ethanol hay hỗn hợp CHCl vƠ ethanol C n n ớc th n ng độ khác vƠ ng chi t đ ợc phần lớn flavonoid Hỗn hợp CHCl3 vƠ c n hay dùng để chi t d n ch t methoxy flavonoid Các ch t anthocyanin th ng bền vững nh t lƠ acyl anthocyanin đ ợc acyl hoá với acid aliphatic ng i ta th ng chi t methanol có mặt c a acid y u nh acid acetic, tartric citric thay HCl Có tác gi dùng l ợng nhỏ acid m nh d bốc h i lƠ trifluoroacetic acid (0,5-3%) để chi t polyacylanthocyanin ph c t p acid nƠy dể bốc h i trình lƠm đ m đặc Dịch chi t đem lƠm đ m đặc d ới chơn không nhi t độ th p (40-70oC) Đối với ch t d bị bi n đ i thuộc nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid nên lƠm đông khô Đôi để tinh ch táchflavonoid, ng t a Sau thu t a ng i ta dùng muối chì để k t i ta tách chì cách sục dihydrosulfid flavonoid đ ợc gi i phóng Để phơn l p ch t flavonoid ng i ta áp dụng ph ng pháp sắc ký cột Ch t h p phụ thông dụng lƠ bột polyamid Có thể dùng ch t khác nh bột cellulose, silicagel, magnesol, polyvinylpyrolidon Silicagel dùng để tách ch t flavanon, isoflavon, methyl vƠ acetyl flavon vƠ flavonol, khai triển CHCl3 vƠ hỗn hợp CHCl3 với ethyl acetat ether benzen vƠ hỗn hợp benzen với ethyl acetat hay methanol Polyamid dùng để tách t t c lo i flavonoid, khai triển ethanol methanol với độ c n gi m dần, số hỗn hợp dung mơi khác Muốn có đ n ch t tinh t cần ph i sắc ký cột l i vƠi lần sắc ký ch hoá Các flavonoid dimer, trimer tách sephadex LH-20 1.2 CÂY HÒE 1.2.1 Đặc điểm cơy Tên khoa học: Styphnolobium japonicum (L.) Schott Tên đ ng nghĩa: Sophora japonica L Schott Cơy hòe thuộc lo i cơy nhỡ, cao ậ 10m Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, có ậ 17 chét Hoa nhỏ, hình cánh b ớm chùm đầu cƠnh, có mƠu vƠng trắng hay lục nh t, đƠi hình chng gần nh nhẵn Qu lƠ giáp dƠi h i cong, nhẵn, thắt l i không h t, đầu qu có mũi nhọn ngắn H t h i dẹt, mƠu nơu vƠng bóng Mùa hoa qu : hoa vƠo tháng đ n tháng 8, qu vƠo tháng đ n tháng 11 [1] 1.2.2 Phơn bố thu hái Cơy Hòe phơn bố nhiều B n, Triều Tiên vùng Đông Nam Á nh Trung Quốc, Nh t Vi t Nam cơy hòe đ ợc tr ng vƠ mọc hoang nhiều tỉnh đ t n ớc ta Các tỉnh có tr ng nhiều lƠ: Thái Bình, Nam Định, HƠ Nam, Bắc Giang, Thanh Hóa, Ngh An, HƠ Tĩnh, v.v Thu ho ch lúc nụ ch a nhiều ho t ch t, từ tháng đ n tháng Hái hoa vƠo bu i sáng tr i khô Ngắt chùm hoa, tuốt lơy hoa r i ph i nắng s y để b t ho t enzym ly gi i liên k t glycosid [1] D ợc li u đ t chuẩn ph i có mƠu vƠng, vị đắng, cánh hoa vƠng nơu đƠi hoa vƠng nh t, không mốc, độ ẩm không 12% Hoa đƣ n không 10%, t p ch t (cuống hoa, lá) không 2%, ph i ch a nh t 20% rutin 1.2.3 ThƠnh phần hóa học ThƠnh phần hóa học ch y u c a cơy hòe lƠ flavonoid, ngoƠi số hợp ch t khác: - Lá ch a 6,6% flavonoid toƠn phần 4,7% lƠ rutin - Vỏ qu ch a 10,5% flavonoid toƠn phần 4,3% lƠ rutin, ngoƠi cịn có sophoricosid, sophora biosid vƠ số flavonoid khác Trong qu xanh có flavonoid, ngoƠi rutin cịn có kemppherol-3-sophorosid, henistein - Các ph n khác nh gỗ, thơn, h t, có flavonoid khác đƣ đ ợc phơn l p vƠ đƣ bi t c u trúc hóa học nh ng khơng có ý nghĩa thực t - Hoa hịe có 14 flavonoid đ ợc phát hi n, ngoƠi rutin cịn có quercetin, betulin triterpenoid nhóm lupan, sophoradiol lƠ d n ch t c a nhóm olean HƠm l ợng rutin hoa lƠ khác tùy thuộc vƠo điều ki n khí h u, th nh ỡng, tr ng trọt, cách thu hái, vƠ th i gian thu hái Thông th ng thu hái vƠo lúc nụ hịe cịn non hƠm l ợng rutin đ t cao nh t Nụ hòe n ớc ta ch a 25 - 35% rutin DĐVN V quy định hƠm l ợng rutin đƣ đ ợc s y khô 1.2.4 60oC gi không đ ợc th p h n 20% ng d ng y học Nụ hòe vƠ hoa hòa với tên gọi hòe m vƠ hòe hoa th ng đ ợc sử dụng nhiều lĩnh vực: dùng hƣm uống hƠng ngƠy, y học dùng lƠm thuốc, công nghi p chi t xu t dùng để chi t xu t rutin Trong y học ngoƠi vi c sử dụng hoa hòe ng i ta dùng ph n khác c a cơy nh qu với tên gọi hòe giác, nh ng h n Theo quan điểm c a y học c truyền, vị hịe hoa cịn thuộc nhóm huy t : Tính bình, vị đắng, quy kinh can vƠ đ i trƠng, có cơng l ng huy t huy t dùng tr ng hợp huy t nhi t gơy ch y máu nh ch y máu cam, lỵ, trĩ, băng kinh, băng huy t, đ i ti n máu; nhi t bình can: dùng tr ng hợp can hỏa th ợng viêm 1.3 RUTIN 1.3.1 Cơng th c hóa học vƠ tính ch t Rutin lƠ flavonoid thuộc nhóm flavon đ ợc phơn l p lần từ cơy cửu lý h ng (Ruta graveolens L.) năm 1842 b i Veyss Đ n năm 1904, Schnidt xác định rõ cơng th c hóa học c a rutin Đ n năm 1962 đƣ đ ợc t ng hợp toƠn phần Rutin có cơng th c phơn tử C27H30O16 vƠ c u t o phơn tử: Ptl: 610,51 Hình 1.3 Công th c c u t o c a rutin - Tính ch t v t lý: Tinh thể hình kim mƠu vƠng nh t hay vƠng h i xanh lục, không mùi, không vị Khi để ánh sáng s m mƠu Tinh thể k t tinh ng m phơn tử n ớc lƠm khô 110oC vƠ 10 mmHg Rutin khan mƠu nơu 95 - 97oC.LƠm khan 12 gi 125oC - Nhi t độ nóng ch y: 242oC - Độ tan: rutin khó tan n ớc l nh(1/10000), tan n ớc sôi (1/200), khó tan c n l nh (1/650),tan c n sôi (1/60), tan methanol, isopropanol vƠ dung dịch kiềm loƣng, không tan aceton, ether, cloroform, benzen, ether dầu h o vƠ acid [1] 1.3.2 Định tính vƠ định l ng  Định tính rutin [1]  Ph n ng cyanidin: dung dịch rutin c n thêm bột Mg vƠ acid HCl 10% cho mƠu tím đỏ  Ph n ng với dung dịch NaOH cho mƠu vƠng từ nh t đ n đ m tùy thuộc vƠo độ kiềm vƠ th i gian, đặc bi t ph n ng với dung dịch natri hydroxyd 1% cho mƠu vƠng chanh  Ph n ng với dung dịch sắt (III) clorid cho mƠu xanh lục  Sắc ký lớp mỏng: - B n mỏng sillicagel GF250 - Dung môi khai triển: Ethyl acetat – Acid formic – nước (8:1:1)  Định l ợng Để xác định hƠm l ợng ch phẩm d ợc li u dùng ph - Ph ng pháp sau: ng pháp cơn: nguyên tắc lƠ chi t xu t rutin c n sau th y phơn rutin dung dịch acid loƣng đ ợc quercetin, lọc l y t a, s y r i vƠ tính hƠm l ợng rutin - Ph ng pháp đo quang: rutin hòa tan ethanol cho cực đ i h p thụ, vƠ ph n ng t o mƠu với kiềm vƠ số thuốc thử khác - Ph ng pháp đo iod - Ph ng pháp sắc ký lỏng hi u cao (HPLC) 1.3.3 Tác d ng d c lý Rutin có ho t tính vi tamin P, t c lƠ có tác dụng lƠm bền vững thƠnh m ch, lƠm gi m tính th m c a mao m ch, tăng bền vững c a h ng cầu Rutin có ho t tính c a vitamin P b i c u trúc có nhóm OH phenolic tự Theo Paris, Vairel rutin có ho t tính c a vitamin P m nh nh t Theo Pawot, c ch tác dụng c a rutin lƠ có tác dụng c ch phá h y c a adrenalin, adrenalin lƠ tăng s c chịu đựng c a mao m ch lƠm bền vững thƠnh m ch Rutin lƠm h tr ng lực c chẵn, chống co thắt, chống phóng x tia X, chống viêm cầu th n c p C ch chống viêm lƠ rutin c ch đ sinh t ng hợp prostaglandin 10 ng D ng muối natri c a rutin có tác dụng lƠm gi m nhẹ phù nề tĩnh m ch bị viêm Sau bị oxy hóa, rutin có tác dụng lƠm tăng đ 1.3.4 - ng huy t c a thỏ ng d ng Rutin đ ợc sử nhiều lĩnh vực nh y học, công ngh bao mƠu, nhuộm thực phẩm - Trong y học, ru tin đ ợc dùng phòng vƠ chống bi n cố c a x vữa động m ch, cá tr ng hợp suy y u tĩnh m ch, xu t huy t nh tử cung xu t huy t ho máu, ch y máu cam LƠ thuốc điều trị trĩ, chống dị ng th p khớp NgoƠi cnf đ ợc dùng tr b c x , lƠm cho v t th - ng hợp t n th ng ngoƠi da ng chóng lƠnh sẹo Trong khoa mắt, đ ợc dùng cho tr ng hợp viêm võng m c có xu t huy t, ch y máu đáy mắt - Rutin dùng đ n độc phối hợp để nơng cao hi u qu điều trị nh : + Phối hợp vitamin C: lƠm tăng c ng tác dung c a vitamin C đặc bi t lƠ kh h p thu vƠo c quan khác dung biểu hi n t n th ng mao m ch, xu t huy t d ới da, võng m c, tăng huy t áp + Phối hợp với Nicotinamid: dùng biểu hi n ch c hay thực t n c a suy tĩnh- b ch m ch, giƣn tĩnh m ch nguyên phát, c n đau trĩ + Phối hợp với Vincamin: dùng chữa ch ng rối lo n tơm thần, c i thi n trí nhớ, ch c thần kinh giác quan ng i giƠ + NgoƠi phối hợp với cholin, khellin, papaverin 1.3.5 Các ph ng pháp chi t xu t rutin từ hịe hoa 11 Có nhiều ph ng pháp Ta chi t rutin n ớc nóng, dung dịch kiềm c n  Ph ng pháp T.R.Seshadri: Hoa hòe chi t xu t dung dịch n ớc ch a hỗn hợp natri hydroxyd vƠ acid boric (tỷ l 1:2) Lọc , acid hóa dịch chi t thu đ ợc rutin với hi u xu t 13%  Ph ng pháp Rusu,Mircea, Eugenia: Nụ hòe hoa hòe thêm methanol - n ớc vƠo, bỏ bƣ thu đ ợc thể huyền phù Sau cho hỗn hợp isopropanol - dầu (tỷ l 1:1) vƠo, đem lọc thu đ ợc rutin thô Rutin thô đ ợc xử lý natri hydrocarbonat - amoniac Tinh ch l i lần ethanol  Ph s y khô ng pháp c a Nguy n Văn ĐƠn - Đỗ T t Lợi: Cơn 200 g hoa hòe đƣ 60 - 70oC, thêm vƠo lít n ớc, đun sơi gi Lọc nóng qua v i, vƣ l i đun với l ợng n ớc vƠ lọc ( lƠm lần) Gộp chung t t c dịch lọc, để nguội có rutin k t t a vƠng (thô) K t tinh l i rutin thơ cách hịa tan n ớc sơi, lọc nóng, để nguội Rutin l i k t t a ( lƠm lần), lọc l y s n phẩm, s y khô 70oC s thu đ ợc bột rutin mƠu vƠng th m K t qu thu đ ợc 24g rutin, đ t hi u su t 12%  Chi t dung dịch kiềm: hoa hòe giƣ d p Rửa HCl 0,5% r i rửa n ớc cho h t axit Chi t dung dịch Na2CO3 1% natri borat 1-3% Rutin s tan nhiều có ch c phenol phơn tử Rút dịch chi t vƠ ti p tục chi t cho đ n h t Rutin (3-4 lần) Gộp dịch chi t l i, dùng HCl điều chỉnh đ n pH=2 ta có Rutin k t t a Lọc Tinh ch : Rửa t a n ớc đ n pH=4-5 HoƠ tan, k t tinh l i c n  Chi t n ớc: n ớc sơi: lít hoƠ tan g rutin N ớc 20oC: lít hịa tan 0,13 g rutin Vì v y chi t rutin từ hoa hoè n ớc nóng sau để nguội rutin s t a nh ng ph ng pháp nƠy hi u su t th p 12  Chi t c n: dùng c n 90o để chi t Đun sôi c n với hoa hoè gi Rút dịch chi t, c t thu h i c n Ta s thu đ ợc rutin t a, lƠm nh v y vƠi lần đ n h t rutin (n u dùng Soxchlet để chi t đỡ tốn dung môi, hi u su t cao) K t tinh l i c n, tẩy mƠu than ho t ta có rutin tinh t Ph ng pháp chi t c n cho hi u su t cao, tỷ l rutin hoa hoè lên đ n 20-30% 13 Ch ng QUÁ TRÌNH CHI T XU T, TINH CH RUTIN 2.1 Nguyên v t li u 2.1.1 Ngun li u Nụ hịe khơ đ ợc Vi n nghiên c u vƠ phát triển s n phẩm tự nhiên (IRDOP) cung c p Hình 2.1 N hịe khơ 2.1.2 Hóa ch t vƠ dung mơi - Dung dịch HCl 0,5%; - Dung dịch HCl 10%; - Dung dịch Na2CO3 2% - Ethanol 96o - Than ho t; thị pH - Thuốc thử flavonoid: FeCl35%; bột Mg, Amoniac, KOH10% 2.1.3 Trang thi t bị 14 - Cốc có mỏ lo i lít, 200ml, 500ml - B p cách th y, b p n - Lọc hút chơn không, ph u lọc s , gi y lọc lo i - T l nh, t s y - Xô nhựa 5l, v i lọc - Máy đo điểm ch y, kính lúp, kính hiển vi, đèn soi UV 2.2 Quy trình chi t rutin từ hoa hòe Rutin đ ợc chi t xu t, tinh ch từ nụ hoa hòe theo s đ sau: Nụ hịe Xử lý Bột thơ DD HCl 0,5% Ngơm rửa đ n pH 6-7 Bột nụ hoa DD NaOH 2% o G n, lọc (50 -60 C) Dịch chi t kiềm DD HCl 10% Khu y đ n pH 2, r i lắng g n, lọc, rửa t a đ n pH 6-7 Rutin thô than ho t/ ethanol Tinh ch , lọc nóng, thêm n ớc, k t tinh, lọc, s y Rutin tinh thể Kiểm nghi m Hình 2.2 S đ chi t xu t rutin từ n hoa hòe 15  Chuẩn bị nguyên li u: Nụ hịe khơ đƣ đ ợc nhặt lo i bỏ cƠnh, lá, đ t cát Đem rửa s ch s y khô, vƠ xay thƠnh bột mịn  Lo i t p ch t tan acid: Cơn 250g bột nụ hoa hòe, lƠm ẩm với acid hydrocloric 0,5% 30 phút để bột d ợc li u tr ng n L u ý không để khô q ớt q Sau b sung lít acid HCl 0,5% vƠo bột nụ hoa hòe đƣ đ ợc lƠm ẩm, ngơm th i gian gi , cách gi khu y lần Sau th i gian ngơm ti n hƠnh lọc v i vƠ rửa phần bột d ợc li u n ớc đ n pH = 6-7 thu đ ợc bột nụ hoa L u ý lần rửa nên vắt ki t để gi m thiểu th i gian, số lần rửa để đ t đ ợc pH mong muốn  T o dịch chi t rutin kiềm Để hịa tan rutin có bột nụ hoa 1, dung dịch kiềm nhẹ natricarbonat 2% đ ợc thêm vƠo với tỷ l 1: T c lƠ lít Na2CO3 2% đƣ đ ợc thêm vƠo bột nụ hoa 1, khu y kỹ nhi t độ 50 -60oC đ n dung dịch có mƠu nơu đ m Lọc nóng l y dịch lọc Phần bƣ d ợc li u ti p tục thêm 1,5 lít dung môi Na2CO3 2% vƠo chi t lần nhằm l y c n ho t ch t rutin Gộp dịch lọc lần thu đ ợc dịch chi t kiềm  T o rutin thô Trong giai đo n nƠy dịch chi t đ ợc ti n hƠnh acid hóa đ n pH = dung dịch HCl 10% để k t t a rutin Quá trình k t t a rutin đ ợc thực hi n cách cho từ từ dung dịch HCl 10% vƠo dịch chi t kiềm, đ ng th i khu y kỹ r i dùng thị pH xác định kho ng giá trị pH dung dịch cho đ n thu đ ợc pH = dừng l i Sau hỗn hợp đ ợc để l nh cách cho vƠo t l nh để gi m th i gian k t t a rutin Sau rutin k t t a h t ti n hƠnh g n, lọc hút chơn không, vƠ rửa t a thu đ ợc đ n pH = -7 K t qu thu đ ợc giai đo n nƠy lƠ rutin thô 16  Tinh ch rutin Rutin thô đ ợc cho thêm ethanol 96o với tỷ l rutin thơ : c n = 1:6, sau đun nóng cách th y vƠ khu y tay đ n rutin thô tan gần nh hoƠn toƠn Than ho t tính đ ợc cho thêm vƠo hỗn hợp với tỉ l kho ng 1,5% vƠ ti p tục đun đ n sôi phút để h p phụ t p ch t Lọc hút chơn không đ ợc sử dụng để lo i bỏ phần than ho t ch a t p ch t vƠ thu đ ợc dịch lọc ch a rutin Dịch lọc đ ợc cô cách th y bay h i đ n 1/3 thể tích, b sung 1/5 thể tích n ớc vƠ để yên lắng qua đêm để t l nh nhi t độ phòng để rutin đ ợc k t tinh (Hình 2.3) L u ý để t l nh trình k t tinh x y nhanh h n Rutin k t tinh đ ợc lọc hút chơn không thu l y tinh thể đem s y 60o (Hình 2.4) Hình 2.3 Rutin k t tinh Hình 2.4 Tinh thể rutin vƠ bƣ d 17 c li u 2.3 Kiểm nghi m  Ph n ng với h i amoniac Rutin gặp h i NH3 có thay đ i mƠu sắc với mƠu vƠng đ m lên quan sát đ ợc mắt th ng (Hình 2.5.A.)  Ph n ng cyanidin (ph n ng Shinoda) Ph n ng có mặt nhơn γ-penzopyron rutin Cho dịch chi t vƠo ống nghi m, sau cho thêm 0,1 g Mg, thêm giọt HCl đ m đặc, xu t hi n mƠu h ng cánh sen sau tím đỏ (Hình 2.5.B.)  Ph n ng với dung dịch sắt (III) clorid 5% Cho dịch chi t vƠo ống nghi m, thêm vƠi giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc s xu t hi n mƠu xanh đen (Hình 2.5.C)  Ph n ng với NaOH 20% Thêm giọt dung dịch natri hydroxyd 20 % , xu t hi n t a vƠng cam, t a s tan l ợng d thuốc thử (Hình 2.5 D)  Sắc kí lớp mỏng B n mỏng: Silica gel GF254 Dung môi khai triển: Ethyl acetat ậ Acid formic ậ n ớc (8:1:1) Dung dịch thử: Dung dịch rutin hịa tan EtOH nóng Ti n hƠnh ch y sắc ký thu đ ợc v t sắc ký (Hình 2.5.E)  Quan sát rutin d ới kính hiển vi Rutin d ng tinh thể hình kim, có mƠu vƠng (Hình 2.5.F) 18  Đo điểm ch y Hình 2.5 K t qu định tính Tinh thể rutin sau s y khô đ ợc đem đo điểm ch y có nhi t độ nóng ch y 242oC (Hình 2.6) Hình 2.6 Hình nh đo điểm ch y 19 Ch Nhiều ph ng BÀN LU N ng pháp chi t xu t đƣ đ ợc thực hi n để chi t xu t rutin tối u từ m u thực v t khác Các kỹ thu t từ chi t xu t dung môi truyền thống cho đ n hi n đ i nh chi t xu t lỏng siêu tới h n, chi t xu t lỏng áp lực, chi t xu t có hỗ trợ vi sóng,chi t xu t có hỗ trợ siêu ơm Những ph ng pháp nƠy g m pha: pha lỏng dung môi vƠ pha rắn ch a hợp ch t Q trình chi t xu t có giai đo n: tr ng n vƠ lƠm ẩm nguyên li u thực v t; giai đo n chuyển ch t tan từ thực v t vƠo dung môi nh khu ch tan vƠ áp lực thẩm th u Các ph ng pháp đ ợc lựa chọn phụ thuộc vƠo hi u su t vƠ độ tinh t c a rutin Ph ng pháp chi t xu t h i l u nhi t lƠ ph ng pháp th ng liên quan đ n tăng nhi t độ, đun sôi, vƠ h i l u kho ng th i gian Ph ng pháp nƠy th ng đ ợc sử dụng rộng rƣi đ n gi n vƠ d v n hƠnh Tuy nhiên hi u su t chi t rutin th p q trình ion hóa, th y phơn oxy hóa sau th i gian dƠi chi t xu t Ph ng pháp nƠy cần ph i sử dụng l ợng lớn dung mơi hữu c , v y đ ợc x p vƠo nhóm khơng thơn thi n với môi tr ng Th i gian chi t xu t vƠ nhi t gia tăng m c lƠm gi m hi u su t vƠ ch t l ợng rutin Ph ng pháp chi t xu t k t hợp siêu ơm có hi u su t tăng kho ng 50% 40oC 1h so với chi t xu t h i l u nhi t nhiên ph 80oC 2h [6] Tuy ng pháp nƠy cho th y không n định c a rutin chi t xu t với n ớc t o thƠnh gốc tự lƠm phơn gi i rutin chi t VƠ vi c chi t xu t dung môi methanol cho hi u qu chi t xu t cao h n vƠ ti t ki m đ ợc th i gian chi t Ph ng pháp c hóa học đƣ đ ợc đ a vƠo sử dụng hi u qu vƠ nhanh chóng chi t xu t rutin Sự ti n c a ph ng pháp nƠy lƠ k t hợp c a lực hóa học vƠ c học d ới h thống không dung môi nhi t độ th p h n r t nhiều Lực c học đ ợc áp dụng để phá vỡ t bƠo thực v t để khu ch 20 tán rutin hóa ch t đ ợc thêm vƠo để thúc đẩy ph n ng trung hòa rutin vƠ tác nhơn nh natri carbonat, natri tetraborat Vì rutin lƠ acid y u có pKa kho ng 4,3 không n định dung dịch kiềm Ph ng pháp nƠy có hi u qu cao với hợp ch t có độ hịa tan th p n ớc nh rutin (12,5g/100ml) D ới tác dụng c a base s chuyển rutin thƠnh d ng muối Vi c sử dụng dinatri tetraborat giúp b o v nhóm OH phenolic c a rutin khỏi q trình oxy hóa [7] Ph ng pháp sử dụng vi sóng, c ch sử dụng nhiều điểm ch a rõ ròng nhiên ph ng pháp nƠy đƣ đ ợc sử dụng để chi t rutin cho hi u su t chi t xu t tốt h n Soxhlet (360 phút) vƠ siêu ơm (30 phút) th i gian chi t ngắn h n (6 phút) [8] Ph ng pháp sử dụng hỗ trợ c a h ng ngo i giúp lƠm nóng dung mơi ti p xúc với m u để tách ch t cần phơn tích Hi u su t c a ph pháp nƠy khơng cao vi sóng nh ng ph ng ng pháp nƠy d th c hi n vƠ rẻ h n nh không bị chi u x Ph ng pháp chi t lỏng áp lực có u điểm sử dụng áp su t cao để đẩy nhanh tốc độ chi t xu t Vi c k t hợp chi t lỏng áp lực dựa ion hóa đ ợc đánh giá có triển vọng phát triển chi t xu t vƠ phát hi n rutin, quercetin cơy thuốc Sau chi t xu t, ti p tục tinh s ch rutin để thu đ ợc rutin đ m đặc h n, tinh t h n N ng độ rutin đ ợc tăng lên cách lo i bỏ nhiều thƠnh phần thực v t khác nh đ ng, protein, kim lo i, Vi c sử dụng cột nhựa styrene để rửa trôi rutin vƠ ti p theo lƠ k t tinh rutin 41oC 12h Quy trình nƠy có chi phí th p vƠ thu đ ợc 92% t ng l ợng rutin với độ tinh t 95% Kỹ thu t nƠy đ ợc gọi lƠ chi t pha rắn Nh v y với u nh ợc điểm c a ph ng pháp vƠ kỹ thu t đƣ đ a ra, để áp dụng cho quy trình chi t xu t quy mô lớn, số kỹ thu t đ ợc đ a vƠo nh sử dụng thi t bị cánh khu y, ngơm quay ngơm 21 tuần hoƠn k t hợp siêu ơm để tăng ti p xúc dung môi, đẩy nhanh trình hịa tan d ợc ch t; VƠ áp dụng ph ng pháp chi t với dinatri borat natri carbonat đóng vai trị t o muối d tan vƠ b o v rutin tránh bị oxy hóa Sau chi t xu t sử dụng cột nhựa styrene để rửa trôi rutin vƠ k t tinh rutin 41oC 12h Hoặc n u sử dụng dung môi ethanol để tinh ch cần c t bình chơn không tuần hoƠn để b o v môi tr chi phí 22 ng vƠ ti t ki m TÀI LI U THAM KH O Bộ môn d ợc li u (2011), BƠi gi ng d ợc li u; Bộ môn D ợc li u tr ng Đ i học Y- D ợc thƠnh phố H Chí Minh vƠ Bộ môn D ợc Li u tr ng Đ i học D ợc HƠ Nội, t p 1, tr 259-261, 270-272, 290- 294 Aoki T, Akashi T & Ayabe S (2000), Flavonoids of leguminous plants: structure, biological activity, and biosynthesis, J Plant Res, 113, 475ậ 488 Iwashina T (2013), Flavonoid properties of five families newly incorporated into the order Caryophyllales (Review), Bull Natl Mus Nat Sci, 39, 25ậ51 Linuma M, Tanaka T, Hamada K, et al (1987), Revised structure of neoflavone in Coutarea hexandra, Phytochemistry, 26, 3096ậ3097 Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C, Jiménez L (2004), Polyphenols: food sources and bioavailability, Am J Clin Nutr, May; 79(5):727-47 Zhao, Y., Bao, C., Mason, T.J., (1991), A study of the isolation of effective compositions from traditional Chinese medicinal plants In: Ultrasonics International 91 Proceedings, Butterworths, pp 87ậ90 Jovanovic, S.V., Steenken, S., Tosic, M., Marjanovic, B., Simic, M.G., 1994 Flavonoids as antioxidants J Am Chem Soc 116, 4846ậ4851 Zhang, F., Yang, Y., Su, P., Guo, Z.K., 2009 Microwave-assisted extraction of rutin and quercetin from the stalks of Euonymus alatus (Thunb.) Sieb Phytochem Anal 20, 33ậ37 23 ... soi UV 2.2 Quy trình chi t rutin từ hoa hịe Rutin đ ợc chi t xu t, tinh ch từ nụ hoa hòe theo s đ sau: Nụ hòe Xử lý Bột thô DD HCl 0,5% Ngơm rửa đ n pH 6-7 Bột nụ hoa DD NaOH 2% o G n, lọc (50... papaverin 1.3.5 Các ph ng pháp chi t xu t rutin từ hòe hoa 11 Có nhiều ph ng pháp Ta chi t rutin n ớc nóng, dung dịch kiềm c n  Ph ng pháp T.R.Seshadri: Hoa hòe chi t xu t dung dịch n ớc ch a hỗn... lúc nụ hòe non hƠm l ợng rutin đ t cao nh t Nụ hòe n ớc ta ch a 25 - 35% rutin DĐVN V quy định hƠm l ợng rutin đƣ đ ợc s y khô 1.2.4 60oC gi không đ ợc th p h n 20% ng d ng y học Nụ hòe vƠ hoa hòa