Khảo sát đặc tính có lợi của Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ

Bài viết Khảo sát đặc tính có lợi của Bacillus được phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ tại Cần Giờ tiến hành nghiên cứu đặc tính có lợi của chủng Bacillus phân lập từ các ao nuôi tôm nước lợ ở huyện Cần Giờ nhằm tuyển chọn để sử dụng trong các chế phẩm sinh học cho tôm.

The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CĨ LỢI CỦA BACILLUS ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI TÔM NƯỚC LỢ TẠI CẦN GIỜ Lê Thị Phụng1,*, Trần Thị Mai Phƣơng2, Đinh Thị Thùy Trâm1, Nguyễn Văn Chí2 Trường Đại học Tài ngun Mơi trường, 236B Lê Văn Sỹ, phường 1, quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP HCM, 227 Nguyễn Văn Cừ, Phường 4, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh * Email: ltphung@hcmunre.edu.vn TĨM TẮT Bacillus nhóm vi khuẩn có lợi diện đa số chế phẩm sinh học sử dụng nuôi trồng thủy hải sản, đặc biệt nuôi tôm Khả cạnh tranh Bacillus subtilis vi khuẩn gây bệnh trước tiên số lượng tế bào vi khuẩn Ngoài ra, Bacillus subtilis cịn có khả tiết chất kháng sinh sinh học có tác dụng ức chế, cạnh tranh phát triển tiêu diệt số loài vi khuẩn gây bệnh Ở nước ta chế phẩm vi sinh dùng nuôi trồng thủy hải sản phải nhập ngoại, giá thành cao Trong nghiên cứu này, chủng Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ huyện Cần Giờ khảo sát đặc điểm sinh trưởng chủng mang đặc tính có lợi làm sở cho việc ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học Từ khóa: Bacillus, chế phẩm sinh học, Vibrio parahaemolyticus, ao nuôi tôm, huyện Cần Giờ MỞ ĐẦU Hiện nay, chất kháng sinh sử dụng phổ biến nhiều lĩnh vực, chủ yếu dùng ngăn ngừa điều trị hình thức viêm nhiễm vi khuẩn gây nhiều đối tượng khác bao gồm người nuôi trồng thủy sản Số lượng loại kháng sinh ngày bắt đầu thời điểm mà kháng sinh không đủ để điều trị bệnh nhiễm khuẩn loài thủy sản Thêm vào hội chứng hoại tử gan tụy cấp tôm Vibrio parahaemolyticus gây gây thiệt hại nặng nề cho ngành thủy sản chưa có thuốc phịng trị đặc hiệu, nên cần có biện pháp phịng chống thích hợp Do đó, đòi hỏi nhà khoa học phải liên tục nghiên cứu tìm hướng hiệu tiềm đầy hứa hẹn sản xuất chế phẩm sinh học có tác dụng thay chất kháng sinh Bacillus nhóm vi khuẩn có mặt chủ yếu chế phẩm sinh học có đặc tính có lợi như: tổng hợp chất có hoạt tính sinh học: vitamin, acid amin, kháng sinh, enzym protease, α-amylase số enzyme có lợi khác Nó cịn có khả làm ổn định pH, trung hòa độc tố, cung cấp số men cần thiết để giúp cho trình hấp thu dưỡng chất tốt hơn: Enzyme amylase: thủy phân tinh bột sản phẩm chứa tinh bột thành đường glucose; Enzyme protease: xúc tác trình thuỷ phân liên kết peptide phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối amino acid; Lipase: xúc tác trình thủy phân liên kết ester chất béo tạo thành glycerol acid béo [1] Ngồi ra, Bacillus subtilis cịn có khả tiết chất kháng sinh sinh học có tác dụng ức chế, cạnh tranh phát triển tiêu diệt số loài vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn Vibrio harveyi [2] 86 Hội nghị Khoa học Cơng nghệ lần thứ - SEMREGG 2018 Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc tính có lợi chủng Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ huyện Cần Giờ nhằm tuyển chọn để sử dụng chế phẩm sinh học cho tôm VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, thực khảo sát đặc tính có lợi sinh 10 chủng Bacillus sp phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ Cần Giờ phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM Chủng vi sinh vật gây bệnh: Chủng Vibrio parahaemolyticus Vp2 gây hoại tử bệnh gan tụy cấp tôm cung cấp Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II 2.1.2 Thiết bị Cân điện tử, Nồi hấp khử trùng Autoclave, Máy đo pH, Microplate reader, Tủ cấy vô trùng, Máy lắc ổn nhiệt, Tủ ủ vi sinh, Máy quang phổ kế, Máy ly tâm lạnh Z216MK, Tủ lạnh 2.1.3 Vật liệu Môi trường nuôi cấy Luria Bertani (LB): Trypton 10g, Yeast Extract g, NaCl 10 g, Nước cất vừa đủ lít Mơi trường TSA (Tryptone Soy Agar): Trypton Water 22,5 g, Pepsoy g, Agar 26 g, Nước cất vừa đủ lít, pH 7,3 Môi trường TSB % NaCl (Tryptone Soy Broth): Trypton Water 22,5 g, Pepsoy g, NaCl 25 g, Nước cất vừa đủ lít, pH 7,3 Mơi trường Landy: Glucose 20g, Cao nấm men 1g, L- sodium glutamate g, MgSO4 0,5 g, KCl 0,5 g, KH2PO4 g, FeSO4 0,15 mg, MnSO4 0,5 mg, CuSO4 0,16 mg, Nước cất vừa đủ lít, pH 7,0-7,6 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc tính có lợi 2.2.1 Khả sinh 2,5- Diketopiperazines có hoạt tính kháng khuẩn Nhằm tối ưu q trình thu nhận 2,5- Diketopiperazines có hoạt tính kháng khuẩn, tiến hành nuôi khảo sát chủng Bacillus subtilis mơi trường Landy có điều kiện pH, nhiệt độ, tốc độ lắc, độ mặn môi trường ban đầu thay đổi để xác định điều kiện thích hợp cho nuôi cấy Chúng tiến hành khảo sát bốn môi trường nuôi TSB, Landy, M9, Opt để thu dịch ngoại bào có khả kháng V parahaemolyticus cao Nghiên cứu thực tăng sinh chủng B subtilis mơi trường LB 12 giờ, sau bơm % dịch nuôi sang môi trường cần khảo sát: TSB, Landy, M9, Opt Dịch nuôi 37 oC, lắc 200 vòng/phút 24 Sau 24 ni, thu dịch ly tâm 12000 vịng/phút, oC, 10 phút [3] Tiếp theo, kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn mẫu dịch thu V parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp 2.2.2 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy Nhằm xác định khoảng pH tối ưu môi trường nuôi cấy lên hoạt tính kháng khuẩn Bacillus, chúng tơi tiến hành khảo sát pH môi trường nuôi cấy Nghiên cứu thực tăng sinh chủng B subtilis môi trường LB Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy với pH sau: 4, 5, 6, 7, 8, 9, thành phần môi trường Đem hấp khử trùng 121 ºC, atm Sau 87 The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018 đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống % nuôi điều kiện lắc 37 ºC với tốc độ lắc 200 vịng/phút Thu canh trường ni cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm 12000 vòng/phút, oC, 10 phút thu dịch để loại tế bào [4] Tiếp theo, chúng tơi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn mẫu dịch thu V parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp 2.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn Bacillus, tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi cấy Nghiên cứu thực tăng sinh chủng B subtilis môi trường LB Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy để nuôi cấy Đem hấp khử trùng 121 ºC, atm Điều chỉnh nhiệt độ sau: 28 oC, 30 oC, 37 oC Sau đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống % nuôi điều kiện lắc 37 ºC với tốc độ lắc 200 vịng/phút Thu canh trường ni cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm 12000 vòng/phút, oC, 10 phút thu dịch để loại tế bào [4] Tiếp theo, chúng tơi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn mẫu dịch thu V parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp pha lỗng hai lần liên tiếp 2.2.4 Khảo sát độ mặn môi trường ni Nhằm xác định độ mặn thích hợp cho hoạt tính kháng khuẩn Bacillus, chúng tơi tiến hành khảo sát độ mặn môi trường nuôi cấy Nghiên cứu thực tăng sinh chủng B subtilis môi trường LB Đồng thời, tiến hành pha môi trường Landy với độ mặn sau: 0,5 % NaCl, % NaCl, 1,5 % NaCl, % NaCl, thành phần môi trường Đem hấp khử trùng 121 ºC, atm Sau đó, cấy vi khuẩn với tỉ lệ nạp giống 1% nuôi điều kiện lắc 37 ºC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Thu canh trường nuôi cấy sau 18 giờ, thu dịch ly tâm 12000 vòng/phút, oC, 10 phút thu dịch để loại tế bào [4] Tiếp theo, kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn mẫu dịch thu V parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết sinh 2,5 - Diketopiperazines Bacillus sp V.parahaemolyticus V.parahaemolyticus Bacillus sp Bac 88 Bacillus sp Bacillus sp Bac Hội nghị Khoa học Công nghệ lần thứ - SEMREGG 2018 Bacillus sp V.parahaemolyticus V.parahaemolyticus Bacillus sp Bacillus sp Bac Bacillus sp Bac 10 Bacillus sp Bacillus sp Bac V.parahaemolyticus V.parahaemolyticus Bacillus sp Bacillus sp Bac Hình Khả đối kháng chủng Bacillus Vibrio parahaemolyticus Hình cho thấy khả sinh 2,5 - Diketopiperazines đối kháng chủng Bacillus Vibrio parahaemolyticus, đó, Bacillus sp Bac có khả ức chế phát triển Vibrio parahaemolyticus lớn so với Bacillus sp Bac 4, Bacillus sp Bac Bacillus sp Bac 10 Bacillus sp Bac khơng có khả ức chế phát triển Vibrio parahaemolyticus Đây đặc tính quan trọng có ý nghĩa Bacillus phân lập từ tự nhiên ứng dụng việc sản xuất chế phẩm sinh học phịng trị bệnh cải thiện mơi trường nuôi tôm 3.2 Khả chịu pH Sau thu nhận chế phẩm 2,5-DKP từ môi trường Landy với độ pH khác 4, 5, 6, 7, 8, sau 18 nuôi cấy, kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định hoạt tính kháng khuẩn (AU/ml) theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp Kết thu được: Kết từ hình hoạt tính kháng V parahaemolyticus Bacillus subtilis pH: 5, 6, 400 AU/ml, pH pH 100 AU/ml, pH4 Bacillus subtilis khơng thể phát triển Nên ta kết luận khoảng pH 5, 6, tốt cho Bacillus subtilis phát triển sinh 2,5-DKP có hoạt tính cao So sánh với khoảng pH điều kiện ao nuôi tôm nước lợ nước ta 7,5 - 8,2, điều cho thấy chủng Bacillus subtilis có khả chịu khoảng pH rộng phù hợp với điều kiện ao nuôi tôm nước ta, thích hợp để sản xuất chế phẩm sinh học 89 The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018 Hình Hoạt tính kháng V parahaemolyticus Bacillus subtilis pH khác 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ Tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi cấy khác nhau: 28 oC, 30 oC 37 oC Thử nghiệm khả kháng khuẩn chủng Vibrio parahaemolyticus Kết thu được: Hình Hoạt tính kháng V parahaemolyticus Bacillus subtilis nhiệt độ khác Từ kết trên, hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus Bacillus subtilis Bac 37 oC 400 AU/ml, 28 oC 30 oC 200 AU/ml Kết tương đồng với kết nghiên cứu khả kháng khuẩn giếng thạch [5] cho thấy nhiệt độ thích hợp cho q trình ni cấy Bacillus subtilis sinh 2,5-DKP kháng Vibrio parahaemolyticus 37 oC Nên ta 90 Hội nghị Khoa học Cơng nghệ lần thứ - SEMREGG 2018 kết luận 37 oC nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis Bac phát triển sinh 2,5-DKP có hoạt tính cao 3.4 Khả chịu mặn Bacillus Tiến hành khảo sát nồng độ muối môi trường nuôi cấy khác nhau: 0.5 %, %, 1.5 %, % Thử nghiệm khả kháng khuẩn chủng V parahaemolyticus, kết thu được: Hình Hoạt tính kháng V parahaemolyticus Bacillus subtilis độ mặn khác Hình cho thấy Bacillus subtilis có hoạt tính kháng V parahaemolyticus khoảng nồng độ muối từ 0,5-2,0 %, 0,5 % NaCl cho hoạt tính kháng V parahaemolyticus cao Như từ kết nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chủng vi sinh vật tạo chế phẩm sinh học ứng dụng phịng chống bệnh hiệu tơm tùy theo nồng độ muối môi trường nuôi KẾT LUẬN Từ chủng Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm huyện Cần Giờ, nghiên cứu chọn 04 chủng có khả kháng với V parahaemolyticus, chủng Bacillus Bac có khả sinh 2,5-DKP kháng V parahaemolyticus cao Đồng thời, 2,5-DKP có đặc điểm sinh trưởng phù hợp với điều kiện nuôi tôm nước ta khoảng chịu pH (5-7), chịu mặn tương đối (0-2 %), nhiệt độ thích hợp cho trình ni cấy sinh 2,5-DKP 37 oC Việc nghiên cứu đặc tính có lợi Bacillus bước đầu phịng thí nghiệm có giá trị mang tính ứng dụng cho việc nghiên cứu điều kiện sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nuôi tôm nước ta TÀI LIỆU THAM KHẢO Altan, A - Isolation and Molecular Characterization of Extracellular Lipase and Pectinase Producing Bacteria from Olive Oil Mills, İzmir Institute of Technology, 2004 Nguyễn Thị Ngọc Huyền - Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio, Luận văn tốt nghiệp, Ngành Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ, 2012 91 The fourth Scientific Conference - SEMREGG 2018 Phạm Văn Ty - Công nghệ sinh học - công nghệ vi sinh môi trường, 2006, Nxb Giáo dục, TP HCM Arici, M., Bilgin, B., Sagdic, O and Ozdemir, C - Some characteristics of Lactobacillus isolates from infant faeces, Food Microbiology (2004) 19-24 S Remya Reghunath ctv, Isolation and Identification of Bioactive Molecules Produced by Entomopathogenic bacteria, Acinetobacter calcoaceticus, 2017 INVESTIGATION OF BENEFICIAL PROPERTIES OF BACILLUS ISOLATED FROM BRACKISH WATER SHRIMP PONDS IN CAN GIO Le Thi Phung1,*, Tran Thi Mai Phuong2, Dinh Thi Thuy Tram1, Nguyen Van Chi2 Ho Chi Minh University for Natural Resouces and Environment, 236B Lê Văn Sĩ Str., Dist Tân Bình, HCMC University of Science, Vietnam National University HCMC, 227 Nguyen Van Cu Str., Dist 5, HCMC * Email: ltphung@hcmunre.edu.vn ABSTRACT Bacillus is a group of beneficial bacteria that presents in the majority of biological products for aquaculture, especially for shrimp.Competitiveness of Bacillus subtilis towards the harmful bacteria firstly is the number of bacterial cells Beside, Bacillus subtilis is capable of secreting biological antibiotics that inhibit the growth and destruction of some pathogenic bacteria In our country, microbial products used in aquaculture must be imported with a very high price In this research, the strains of Bacillus isolated from brackish shrimp ponds of Can Gio district were examined for the growth characteristics of the strains with beneficial properties as the basic for the production of biological products Keywords: Bacillus, probiotic, Vibrio parahaemolyticus, shrimp ponds, Can Gio district 92 ... vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đặc tính có lợi chủng Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm nước lợ huyện Cần Giờ nhằm tuyển chọn để sử dụng chế phẩm sinh học cho tôm VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN... tượng nghiên cứu Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, thực khảo sát đặc tính có lợi sinh 10 chủng Bacillus sp phân lập từ ao ni tơm nước lợ Cần Giờ phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh Hóa - Trường Đại học... phân lập từ ao nuôi tôm huyện Cần Giờ, nghiên cứu chọn 04 chủng có khả kháng với V parahaemolyticus, chủng Bacillus Bac có khả sinh 2,5-DKP kháng V parahaemolyticus cao Đồng thời, 2,5-DKP có đặc