KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNGCỦA NẤM MEN

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN Saccharosemyces cerevisiae TRONG QUÁ TRÌNH NI CẤY MẺ L.T.P Hoa, L.T.D My, N.T Nghĩa, N.T.M Nương, L.H Phương, T.L Tri Khoa Cơng nghệ Hóa Học Thực Phẩm Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh Số 1, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu tìm quy luật chung ảnh hưởng hàm lượng muối bổ sung môi trường lên động học sinh trưởng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) q trình ni cấy mẻ Q trình lên men thực phịng thí nghiệm với việc bổ sung hàm lượng muối 1%, 5%, 10% 20% vào môi trường nuôi cấy Dựa vào thơng số động học tính tốn, nhận thấy hàm lượng muối 1% bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng lớn nhất, hàm lượng 5% 10% có tốc độ tăng trưởng thấp nấm men phát triển 20% nấm men bị ức chế khơng có phát triển GIỚI THIỆU Saccharomyces cerevisiae loại nấm men đơn bào, có khả phân chia nhanh Tế bào S cerevisiae có hình trịn hay hình trứng, đường kính từ – 10 µm (F Horst 2012) Thành tế bào S cerevisiae chủ yếu cấu tạo lớp bên gồm b-glucan chitin, lớp bên sợi cấu tạo từ a-manan (highly glycosylated) liên kết với protein (mannoproteins) (Soares, E V 2011) Nó sinh trưởng cách nảy chồi sinh bào tử Nguồn dinh dưỡng chủ yếu cacbon từ đường, nguồn nito từ acid amine muối amon (F Horst 2012) Nấm men S cerevisiae sử dụng rộng rãi cơng nghệ sản xuất bánh mì, lên men bia, rượu,… Và nhiều nghiên cứu cho thấy S cerevisiae lồi sinh vật thí nghiệm dễ sử dụng Thứ nhất, S cerevisiae dễ nuôi cấy quy mô lớn, dễ dàng phát triển cách sử dụng kỹ thuật lên men đơn giản môi trường phát triển rẻ tiền, đồng thời sinh khối cao (Kapoor and Viraraghava 1995) Thứ hai, S serevisiae dễ dàng lấy từ ngành công nghiệp khác so với loại khác Thứ ba, S serevisiae an tồn Thứ tư, S cerevisiae dễ dàng cho thao tác mặt di truyền hình thái (Wang, J., & Chen, C 2006) Vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng hàm lượng muối NaCl bổ sung môi trường nuôi cấy lên động học sinh trưởng nấm men Saccharomyces serevisiae trình ni cấy mẻ Natri clorua chất có ảnh hưởng nhiều đến Saccharomyces cerevisiae (Watson 1970) Cụ thể làm thay đổi tốc độ sinh trưởng (Norkrans 1966), hiệu suất tạo sinh khối (Ross & Morris 1962), ảnh hưởng đến lag phase đường cong sinh trưởng (Phaff, Mrak & Williams 1952) thành phần tế bào nấm men (Combs et al 1968) Khi có mặt NaCl tốc độ sinh trưởng nấm men Saccharomyces cerevisiae bị giảm Nguyên nhân cần nguồn chất lượng cao có mặt muối nấm men thực chế để tự bảo vệ (Watson 1970) NaCl gây kìm hãm tăng trưởng ảnh hưởng tiêu cực đến khả tồn tế bào nấm men (Norkrans 1966) Ở nồng độ NaCl 10% w/v gây ngừng tăng trưởng nấm men Đồng thời nồng độ NaCl tăng lên tổng số lượng tế bào giảm xuống Các tế bào nấm men tiếp xúc với nồng độ NaCl cao thì có mức tăng trưởng thấp khả sống sót thường cao nấm men điều kiện muối thấp (Logothetis et al 2010) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vi sinh vật: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae dạng đơng khơ (thuộc thương hiệu Mauripan loại 10g/gói) sử dụng suốt trình nghiên cứu Cà chua mua chợ Đường cát Biên Hịa gói 1kg Hóa chất: Peptone hóa chất khác NaOH, H2SO4, Methylen blue, cồn, có sẳn phịng thí nghiệm Thiết bị: Kính hiển vi điện tử, buồn đếm hồng cầu, máy lắc, máy khuấy từ, mycropipet, máy ly tâm, bếp hồng ngoại, Môi trường nhân giống Chuẩn bị 100g cà chua rửa sạch, thêm 1000ml nước cất Đun sôi 30 phút Thu nhận phần dịch Bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml Sau bổ sung vào hỗn hợp 200g đường saccharose 1g peptone thu môi trường M1d Môi trường M1d điều chỉnh pH dung dịch 0.1N H 2SO4 0,1N NaOH, phân phối bình ni cấy tiệt trùng 121 0C 15 phút Nấm men (0.1g) hoạt hóa nhân giống 100 ml mơi trường M1d nhiệt độ phịng 24 máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 rpm (hoặc thiết bị có khuấy từ) Điều kiện ni cấy nấm men Sau q trình nhân giống, lấy 10ml nấm men cho vào 190ml mơi trường M1d có bổ sung NaCl tiệt trùng Q trình ni cấy mẻ tiến hành nhiệt độ phòng lắc 120 rpm thiết bị có khuấy từ Trong suốt q trình ni cấy, thứ 0, tiêu: (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi, % sucrose Brix kế kiểm tra ghi nhận biểu diễn thành bảng đồ thị Tính tốn thơng số động học sinh trưởng nấm men rút kết luận Phương pháp nghiên cứu Khảo sát động học sinh trưởng nấm men môi trường nuôi cấy mẻ Xác định mật độ tế bào vi sinh vật, tỷ lệ tế bào sống, tỷ lệ tế bào nảy chồi phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Tiến hành nhuộm xanh methylene blue để đếm số lượng tế bào chết (các tế bào chết bắt màu với methylen blue), tổng số tế bào, số tế bào nảy chồi, số tế bào sống Cách tiến hành: Pha loãng huyền phù nấm men Trộn 1ml huyền phù (đã pha lỗng) với 50 µl dung dịch 0.2% methylen blue (pha D.W) 30 giây Lắc dung dịch máy lắc Đậy buồng đếm phiến kính vng Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt giọt huyền phù nấm men cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính vng) Dịch huyền phù vào buồng đếm nhờ chế mao dẫn Buồng đếm chuẩn bị có vùng khơng gian nằm buồng đếm phiến kinh vuông trám đầy huyền phù nấm men, rãnh xung quanh khơng bị dính ướt Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm vật kính x10 x40 để quan sát Điều chỉnh cường độ ánh sáng cửa trập để quan sát rõ ràng tế bào lẫn đường kẻ Ta chọn năm ô lớn theo đường chéo (các ô đánh dấu x) để đếm Sử dụng máy ảnh kỹ thuật số để chụp hình buồng đếm vật kính x10 (hoặc x40) để sau sử dụng đếm số lượng tế bào nấm men máy tính Kết đếm mật độ tế bào có giá trị vịng – phút sau cho mẫu vào buồng đếm; phải đếm tế bào nằm ô vuông hai đường kẻ kề chọn ô (thường chọn cạnh bên trái ô vng) Ở độ pha lỗng, sau đếm ta số tế bào năm ô lớn a (mỗi độ pha loãng nên lúc đặt vị trí để có hai lần quan sát với mẫu) Số tế bào nấm men (N) 1.0 ml mẫu: N = (a/b×400/0.1)×103×10n Trong đó: N: số tế bào 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm a: số tế bào ô vuông lớn b: số ô vuông nhỏ ô vuông lớn (16×5=80) 400: tổng số vng nhỏ 25 ô vuông lớn 0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa ô trung tâm 103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = ml) 10n: độ pha loãng mẫu (lưu ý tính độ pha lỗng phải bao gồm lượng methylene blue cho vào mẫu) Đo % sucrose brix kế Lấy 1ml dung dịch huyền phù nấm men sau pha loãng cho vào ống ly tâm Đun cách thủy 1000C 10 phút Sau đem ly tâm 3000 vòng 10 phút Cho giọt ly tâm vào bề mặt brix kế đọc số đo brix kế Ghi nhận % sucrose thời điểm Tính tốn thơng số động học sinh trưởng nấm men n= Nt = = N µ (tính hai thời điểm) YN/S Với: n: số hệ td: thời gian số tế bào nhân đôi (thời gian hệ) Nt: số tế bào thời điểm t N0: số tế bào thời điểm bắt đầu (giờ thứ 0) µ: số tốc độ sinh trưởng (ở xem tốc độ gia tăng số lượng tế bào đơn vị số lượng tế bào) YN/S : hiệu suất tạo thành tế bào (tính theo chất đường) St: nồng độ chất (đường) thời điểm t S0: nồng độ chất (đường) thời điểm Các số liệu đo đạc thông số động học sinh trưởng biểu diễn bảng đồ thị bao gồm: (1) bảng số liệu trình lên men, (2) đồ thị diễn tả đường cong sinh trưởng nấm men, (3) xác định thời gian hệ log phase, (4) số tốc độ sinh trưởng (µ) log phase (5) Y N/S giai đoạn trình lên men KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN (i) Đường cong sinh trưởng nấm men Hình 1: Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae Theo hình 1, nồng độ 1% NaCl, tốc độ sinh trưởng nấm men cao nghiên cứu Vì nồng độ cịn thấy nên khơng ảnh hưởng nhiều đến tốc độ sinh trưởng nấm men Tại nồng độ 5% NaCl 10% NaCl, thời gian thích nghi (pha lag) dài khoảng - Bởi nồng độ muối cao tác động đến màng nguyên sinh chất tế bào nấm men nên tốc độ sinh trưởng chậm Còn trường hợp 20% NaCl nấm men bị tiêu diệt hồn tồn Từ đó, ta thấy tốc độ sinh trưởng nấm men bị ảnh hưởng mơi trường ni cấy có bổ sung NaCl, cụ thể nồng độ muối cao tốc độ sinh trưởng giảm (S Sassan 2016) Nguyên nhân cần nguồn chất lượng cao có mặt muối nấm men thực chế để tự bảo vệ (Watson 1970) Theo J Bautista nấm men S cerevisiae bị tiêu diệt nồng độ NaCl 12,2%, khoảng 8,5% - 12,2% khơng có tăng trưởng theo W Praphailong, nồng độ NaCl tối đa để nấm men phát triển 7.5% (W Praphailong el at 1997) Tại nồng độ NaCl 1% 5% đường cong sinh trưởng kéo dài Đúng với khảo sát Ross Morris, nồng độ muối tăng lên 8% tăng thời gian pha lag giảm thời gian pha log (Ross & Morris 1962, tltkhinh N) Hình 2: Cơ chế tác động NaCl đến tế bào nấm men Hình 3: Đồ thị biểu diễn động học sinh trưởng pha log S cerevisiae điều kiện môi trường nuôi cấy bổ sung NaCl (ii) Đồ thị pha log Bảng 1: Thông số động học sinh trưởng nấm men S cerevisiae môi trường có bổ sung NaCl Thí nghiệm Chiều dài pha Log (L) Thời gian hệ (Td) 1%-NaCl 5%-NaCl 10%-NaCl 20%-NaCl 7h 7h 5h - 6.05 h 11.93 h 15.68 h - Tốc độ sinh trưởng thực tế (µtt) 0.1146 0.0581 0.0442 - Tốc độ sinh trưởng theo đồ thị pha Log (µL) 0.1153 0.0562 0.0447 - Theo kết thực nghiệm ta thấy, nồng độ 1% 5% NaCl thời gian pha log diễn (7 giờ) thời gian bắt đầu pha log nồng độ 1% NaCl nhanh tốc độ sinh trưởng cao Tại 10% NaCl, thời gian bắt đầu pha log chậm chiều dài pha log ngắn 5% NaCl Còn 20% NaCl, nấm men bị tiêu diệt nên không xuất pha log Thời gian hệ tăng dần tăng nồng độ NaCl (iii) Hàm lượng đường Hình 4: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường cịn lại q trình ni cấy S cerevisiae điều kiện mơi trường có bổ sung NaCl Bảng 2: Thông số hiệu xuất thu sinh khối nấm men Thí nghiệm Hiệu suất YX/S (tế bào.ml-1.S-1) 1%-NaCl 5%-NaCl 10%-NaCl 20%-NaCl 15x105 9x105 4.6x105 - Theo kết thí nghiệm, mức độ sử dụng chất nấm men nồng độ 1% NaCl lớn hiệu suất thu sinh khối cao (15x10 (tế bào.ml-1.S-1)) Cịn trường hợp 10% NaCl mức độ sử dụng chất chậm, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp (4.6x105 (tế bào.ml-1.S-1)) Khi nồng độ muối tăng lên oxy hịa tan vào dung dịch giảm làm cho lượng oxy cần thiết cho hoạt động sống nấm men bị thiếu từ giảm suất trình lên men (Norkrans, B 1966) Sự diện NaCl môi trường nuôi cấy gây áp suất thẩm thấu Nấm men Saccharomyces có số chế khác để chống lại áp suất thẩm thấu, cần nguồn lượng carbon để thực Nhu cầu bổ sung nguồn lượng carbon giải thích hàm lượng glucose tiêu thụ tăng lên nồng độ muối thấp Đồng thời nồng độ muối cao hơn, hàm lượng glucose tiêu thụ báo cáo giảm (E Casey et al 2013) (iv) Phần trăm tế bào nấm men sống Hình 5: Đồ thịtế biểu lệ tếnấm bàomen nấmởmem S cerevisiae sốngnhau Nhìn chung, phần trăm bàodiễn sốngtỷcủa nồng độ muối khác điều kiện mơi trường ni cấy có bổ sung NaCl cao pha log, ngoại trừ 20% NaCl thời điểm nghiên cứu phần trăm tế bào sống có xu hướng giảm xuống nồng đồ NaCl tăng lên Tại điều kiện môi trường 5% NaCl thời gian tế bào sống dài tính từ thời điểm bắt đầu đến kết thúc pha log Với 1% NaCl phần trăm tế bào sống pha log có giá trị cao Cịn trường hợp 20% NaCl, nấm men bị tiêu diệt nên phần trăm tế bào sống giảm theo thời gian (v) Phần trăm tế bào nấm men nảy chồi Hình 6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ tế bào nấm mem S cerevisiae nảy chồi điều kiện mơi trường ni cấy có bổ sung NaCl Dựa vào đồ thị ta nhận thấy rằng, nồng độ 1% NaCl phần trăm tế bào nảy chồi cao, 5% 10% NaCl phần trăm tế bào nảy chồi thấp Vậy tăng nồng độ NaCl phần trăm tế bào nảy chồi giảm dần KẾT LUẬN Từ kết thực nghiệm chúng tơi nhận thấy rằng, mơi trường ni cấy có sử dụng 1% NaCl hiệu suất thu sinh khối cao, trình sinh trưởng nấm men diễn mạnh nhanh Cịn mơi trường có nồng độ 5% NaCl 10% NaCl tốc độ sinh trưởng diễn chậm, hiệu suất sinh khối thấp Do trường hợp thường dùng để làm chậm trình sinh khí CO q trình sản xuất bánh mì Tóm lại nồng độ NaCl mơi trường ni cấy tăng đến 10% ức chế sinh trưởng nấm men Saccharosemyces cerevisiae, giảm hiệu suất thu hồi sinh khối CO2 Bautista-Gallego, J., Arroyo-Lopez, F N., Durán-Quintana, M C., & GarridoFernandez, A (2008) Individual effects of sodium, potassium, calcium, and magnesium chloride salts on Lactobacillus pentosus and Saccharomyces cerevisiae growth Journal of Food Protection, 71(7), 1412-1421 Shokoohi, S., Tsigounis, K., Urmaza, L M., & Perez, A Z (2016) The effect of stress due to sodium chloride exposure on the growth of Saccharomyces cerevisiae The Expedition, Norkrans, B (1966) Studies on marine occurring yeasts: Growth related to pH, NaCl concentration and temperature Archiv Fur Mikrobiologie, 54(4), 374–392 Praphailong, W., & Fleet, G H (1997) The effect of pH, sodium chloride, sucrose, sorbate and benzoate on the growth of food spoilage yeasts Food Microbiology, 14(5), 459-468 Casey, E., Mosier, N S., Adamec, J., Stockdale, Z., Ho, N., & Sedlak, M (2013) Effect of salts on the co-fermentation of glucose and xylose by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae Biotechnology for biofuels, 6(1), 83 10