BO GIAO DUC VA DAO TAO BO QUOC PHONG HQC VIEN QUAN Y |TRƯỜNG ĐẠI HỌC DIEU DUONG ‘ NAM ĐỊNH VU THE HUNG
NGHIÊN CỨU NONG DO TNF-a, IL-6, IL-10 VA MOI LIEN QUAN CUA CHUNG 6 BENH NHAN
SOT XUAT HUYET DENGUE Chuyén nganh: Sinh ly bénh
MA sé: 60.72.04
LUAN VAN THAC Si Y HOC
Người hướng dẫn khoa học:
TS.BS VŨ XUÂN NGHĨA
HÀ NỘI - 2012
Trang 2
LOI CAM ON
Tôi xin trân trong cam on Đảng ủy, Ban giám hiệu và các phòng ban, bộ môn Trường Đại học điều dưỡng Nam Định đã tạo mọi điều kiện cho tôi được đi học tập và thực hiện luận văn
Tôi xin trân trọng cam ơn Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân V, bộ môn Sinh lý bệnh, trung tâm Y dược Học, và các cơ quan của Học viện Quân V đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn này
Tôi xin cảm ơn TS.BS Vũ Xuân Nghĩa - Phó chủ nhiệm bộ môn Sinh lý bệnh - Trưởng phòng DŠ - Trung tâm Y - Dược - Học viện Quân V đã tạo điều kiện thuận lọi, tận tình hướng dẫn giúp đỡ cho tôi thực hiện để tài và hoàn thiện luận văn này
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn — Chủ nhiệm bộ môn, các thây cô bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân Y, cán bộ phòng D5, D3 Trung tâm Y - Dược - học Học viện Quân Y đã tận tụy và dành thời gian qHj báu giúp đố tôi trong quá trình thực hiện và hoàn chỉnh luận văn
Nhân dịp này chúng tôi chân thành cảm ơn các bạn bè, dong nghiệp đã ủng hộ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài
Tôi dành tình cảm biết ơn sâu sắc tới gia đình, bỗ mẹ và vợ con đã luôn động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu đê hoàn thành luận văn
Hà Nội - tháng 9 năm 2012
Trang 3— athe thas dae ve WER cà VÌ ri get
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này có sử dụng một phần kết quả các dấu hiệu lâm sàng, cận lâm sàng, chẩn đoán trong dé tai cap thành phố: Nghiên cứu phân bố tập tính muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus, phát hiện virus
Chikungunya, virus Dengue 6 Hà nội Đề xuất biện pháp phòng chỗng Tất cả các số liệu về nồng độ các cytokine TNF-œ; IL-6 và IL-10 trong luận văn là trung thực và chưa công bố trong bất kỳ công trình nào và tôi là
người thực hiện chính
TÁC GIÁ
Trang 4———— Lam MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt trong luận văn Danh mục các bảng Danh mục các hình 0v À2 015 1
CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN TÀI LIỆU -5 5°-e<ccs<ecssecs<cse 3 1.1 Tình hình sốt xuất huyết DĂ€ngU€ oecseeessessenSSeeseessessesssesseeseesse 3 1.1.1 Tình hình sốt xuất huyết Dengue trên Thế giới và khu vực 3
1.1.2 Tình hình sốt xuất huyết do virus Dengue tại Việt Nam 4
1.1.3 Vector truyền bi: 4
1.2 Đặc điểm cấu trúc sinh học phân tử của DENV .« 5
1.2.1 Câu trúc đại thễ -ccckvvsittkEErrrttririrrrrrrrirrerriree 5 1.2.2 Cấu trúc bộ gen (genoim€) . -.2 + 2 ccscscrscrzerscrsersrrsersrreee 5 1.3 Cơ chế bệnh sinh trong SXH do nhiễm DENV e-«- 7 1.3.1 Các giả thuyết về cơ chế bệnh sỉnh - -2-©s©5sesvcveer 7 1.3.2 Vai trò cuả các cytokine trong cơ chế bệnh sinh SXH Dengue l2 1.3.3 Vai trd cla TNF-a, IL-6 va IL-10 trong sốt Dengue và xuất huyét DengUe - Ác HH HH HH Hà H01 T810 04 1011611 1000 15 1.4 Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng SXH-D -«s «<-<s<<se 19 1.5 Các phương pháp chân đoán sốt xuất huyết Dengue 20
1.5.1 Dựa vào lâm sàng và cận lâm sàng -+ssetererreeereresreee 20 1.5.2 Phân lập virus che 181112x66 "— 20
Trang 5—
1.5.4 Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện DENYV 21
CHUONG 2: DOI TUQNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1 Đối tượng nghiên cứu e s22 ©ssseseerassrsrierssestoseserer 22 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng : ¿-cs-ccvsxcstsrrezrertrrrrrrrrrkr 22 2.1.2 Số lượng đối tượng trong các nhóm 5-5 ccsvzvccccccee 22 2.2 Phương pháp nghiên CỨU -esse<sse<seSeSSSeSSESSSSeSSESSESEssesssessesse 23
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu -¿-5- 5+ +x+xexekkeEkesxetkkrrkrrrrrrerrrrerrke 23
2.2.2 Các chỉ tiêu lâm sàng - HH ng Hy 23 2.2.3 Các xét nghiệm cận lâm sảng -« - kg Hiệu 23 2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng 5 HH HH, 24 2.3 Định lượng các cytokine TNE-ơ, IL-6 và EL-1( ««‹««< 25
2.3.1 Vật liệu, thiết bị dùng để định lượng TNF-ø, !L-6 và IL-10 25
2.3.2 Nguyên lý kỹ thuật định lượng các cytokine 27
2.3.3 Các bước tiến hành c2cccerrretrtrtirrrriirrrrriiiirrrrie 28
2.3.4 Tiến hành phản ứng ELISA định lượng cytokine 29
2.4 Sơ đồ nghiên cứu .-s« s<cesscessteeeerrreerorrrrrttsoeressrerssee 31 2.5 Phân tích và sử lý SO SO ViGU sscsssscosscossssnsecsssessssessseeressesscssnesessssessees 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU .-. -ccccceeesesssee 33
3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu .-« es‹-«e 33
3.2 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trong các nhóm nghiên cứu 34 3.3 Nong d6 TNF-a, IL-6 va IL-10 trong đối tượng nghiên cứu 37
3.4 Liên quan của TNF-ơ, IL-6 và IL-10 với một số đặc điểm lâm sàng
ở các nhóm bệnhh -scscsso sen v2S2S 906360000002008800000000004085 40
3.5 Mối liên quan của TNF-ơ, IL-6 và IL-10 với một số đặc điểm cận
lâm sàng trong các nhóm nghiên CỨU «eseeseeeeeesesssssstsesrssesee 44
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN e« 5<ceseevsssrsrretrte.00000n.00n 54
4.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu .-e -esesseeessseee 54
Trang 6i MIB aie ri Me
4.3 Đặc điểm cận lâm sàng ở đối tượng nghiên cứu 57 4.4 Nồng độ các cytokine TNE- a, IL-6 và IL-10 ở các nhóm đối tượng
nghiÊn CỨUu 5< có ss s2 ọ09909908696098838940007040094900099840046060 59 4.5 Mối liên quan TNE-ơ, IL-6 và IL-10 với đặc điểm lâm sàng và cận
lam sang 6 bénh mhan SXH-D cccscscceccssssesssersccscssserseceensssenseses 61 „800/007 — 68
9108.19.1005 70
Trang 7he ke a3, e0 1t BIảI đg AST ALT CD4 CD8 CHIKV cDNA DENV DNA DF | DHF DSS ELISA EDTA ECL E/M Immuno-PCR IL- KN KT MAC-ELISA SXH SXH- D
CAC CHU VIET TAT
: Aspartate Amino Transferase
: Alanine Aminno Tranferase : Cluster of differentiation 4,
T helper Cell Surface Glycoprotein
: Cluster of differentiation 8, T Cell co- recetor Transmenbrane Glycoprotein : Chikungunya virus : Covalently closed circular DNA : Dengue virus : Deoxyribonucleic acid : Dengue fever
: Dengue haemorrhagic fever
: Dengue Shock Syndrome
:Enzyme-linked immunosorbent assay ( Thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme)
Trang 8aici RNA RT- PCR PCR _ WHO RIA T Cell TNE- : Ribonucleic acid
Trang 9SS SEO~=~S~CO OO SE KKeeõ DANH MUC CAC BANG
Bang Tén bang Trang
3.1 Đặc điểm tuôi giữa nhóm bệnh và nhóm chứng . -s- 33
3.2 Đặc điểm giới ở nhóm bệnh và nhóm chứng .-. -:5- +: 33 3.3 Đặc điểm về mức độ sốt ở bệnh nhân nghiên cứu . -.- 34 3.4 Dac điểm về thời điểm sốt ở bệnh nhân nghiên cứu 35
3.5 Đặc điểm về các dâu hiệu xuât huyết, gan to, hạch to ở bệnh nhân
H015: 8: 0 35 3.6 Đặc điểm cận lâm sàng ở các nhóm nghiên cứu - 36 3.7 Tỷ lệ phát hiện DENV-RNA và các kháng thể kháng DENV ở bệnh
nhân SXXH-D << HH“ HH TH HH TH ni 37 3.8 Nông độ các cytokine TNF-ø, IL-6 và IL10 ở nhóm chứng 37 3.9 Nông độ các cytokine trong các nhóm nghiên cứu - ‹- 38 3.10 Liên quan nồng độ cytokine TNF-œ, IL-6 và [L-10 với thời điểm sốt 40 3.11 Mối lién quan cdc TNFa, IL-6 va IL-10 với mức độ SỐT - - 4I 3.12 Mối liên quan cytokine với biểu hiện xuất huyết . - 42 3.13 Mối liên quan cia TNF-a, IL-6 và IL-10 với các biểu hiện xuất huyết
CU MIEN ooo 42
3.14 Liên quan của nồng độ TNE-o, IL~6 và IL-10 với dấu hiệu gan to 43 3.15 Liên quan của nồng độ TNE-o, IL-6 và IL-10 với dâu hiệu hạch to 43
3.16 Mối liên quan nồng độ TNF-œ, IL~-6 và IL-10 với mức độ giảm tiểu GHI .— - ,ÔỎ 44
thanh học của virus Dengue «sen 45
Trang 10PP gD ab be Tén bang Trang 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 3.26 Tương quan nồng độ TNF-œ, IL-6 và IL-10 với Hematocrit ở nhóm "008900101 50 Mỗi tương quan của cytokine với tiêu cầu trong nhóm DHF 51
Trang 11{ 4 H j a i 7 1 i d ị 4 ] 4 i i i ị 4 : q i 4 ] i Ha DANH MỤC CÁC HÌNH
Hinh Tên hình Trang
1.1 Mô hình minh họa hình thể và cấu tạo DENV 5-ccccsrssccee 6
1.2 Sơ đồ bộ gen của DENV ¿2s xxx Treo 6
1.3 Sơ đồ sinh các cytokin do tác động của virus Dengue - 13 1.4 Sơ đồ mạng lưới và tác dụng của các cytokine trong cơ chế bệnh sinh
sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue :-22scccccccscrrrerrkerree I4 2.1 AviBion Human TNF-a ELISA Kit cia hang Orgenium - Phan lan
dùng trong nghiÊn CỨU - sọ nen tr 26 2.2 Các vật dụng để tiến hành định lượng cytokine, IgG, IgM 26
2.3 Hệ thống máy đọc kết quả ELLISAA -©22©7s-5+cxe2rxccxtsrerrrvrex 27
2.4 Sơ đồ pha loãng chuẩn theo hướng dẫn của nhà sản XuẤ, 28
3.1 Phân bố giới tính giữa các nhóm 5 ©2s22vvecvvrervererrerrrrrerree 34
3.2 Nồng độ TNF-ơ trong các nhóm nghiên cứu . c«ccecesvree 38 3.3 Nong d6 IL-6 trong cdc nhém nghién cứu -. -«c«ccsercerrrcee 39 3.4, Nông độ IL-10 trong các nhóm nghiên cứu -c«-cs+csscxee 39 3,5 Liên quan nồng độ TNF- ơ và thời điểm sốt ccc.ecerree 41 3.6 Sự biến đổi nồng độ TNF-ơ với tình trạng nhiễm các týp Dengue 47 3.7 Tương quan nồng độ TNF-øơ với Hematorit trong nhóm DF 48 3.8 Mối tương quan nồng độ TNE- ơ với tiểu cầu ở nhóm DE 30
Trang 122N Em giá dế, l DAT VAN DE
Sốt xuất huyết (SXH) là bệnh nhiễm trùng gây dịch nguy hiểm, tỷ lệ tử
vong cao, do virus Dengue (DENV) và một số virus khác trong đó có virus
Chikungunya (CHIKV) gây ra Với lịch sử phát hiện trên 200 năm, sốt xuất huyết Dengue là bệnh dịch phố biến trên Thế giới, tập trung nhiều ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, đã trở thành nguyên nhân chính khiến trẻ em phải
nhập viện và tử vong ở nhiều quốc gia Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã
nhận định bệnh sốt xuất huyết Dengue đang có xu hướng gia tăng và diễn
biến phức tạp, đặc biệt ở khu vực Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương
[73],{74] Tại Việt Nam, SXH Dengue (SXH-D) được phát hiện năm 1958, đến nay đã trở thành dịch bệnh lưu hành trên diện rộng Bệnh xảy ra quanh
năm, nhưng thường xảy ra vào mùa mưa, khu vực dịch chủ yếu là Miền Nam,
Miền Trung và gần đây dịch SXH-D cũng xuất hiện cả ở Miền Bắc
Virus Dengue là nguyên nhân gây ra sốt Dengue (DF), sốt xuất huyết Dengue (DHF) và hội chứng sốc Dengue (DSS) Hiện nay, DENV được xác định có 4 týp huyết thanh là DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4
Mặc dù bệnh SXH-D đã được biết từ lâu nhưng cơ chế sinh bệnh đến
nay vẫn chưa thật rõ ràng Gần đây, theo những giả thuyết về cơ chế miễn dịch người ta thấy rằng do đặc điểm di truyền của virus, do đáp ứng miễn dịch của cơ thể, gây tăng cường sản xuất các cytokine, các tự kháng thể Sự lắng đọng các phức hợp miễn dịch, hoạt hóa bé thé, tăng giải phóng các chất trung
gian hóa học gây tổn thương nội mô, tăng tính thấm thành mạch Ngoài ra, tổn thương gan và hệ thống miễn dịch cũng đã được phát hiện trong nhiễm DENV [62] Đây là những cơ chế chính liên quan tới bệnh sinh sốt xuất
Trang 13sede dM Di aii i BERR nt; 2
Nhiều nghiên cứu gần day cho thấy, biến đổi có chiều hướng tăng quá
mức của các cytokine ở bệnh nhan SXH-D nhu: TNF-a, IL-6, IL-10, IL-8, IL-
1, IFN-a chúng có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của SXH-D [Š7],162] Bởi vay, TNF-a, IL-6 va IL-10 ciing có khả năng có thể trở thành những dấu ấn sinh học quan trọng có giá tri trong chân đoán, điều trị và tiên lượng bệnh sốt xuất huyết Dengue [10]
Để làm rõ vai trò của các cytokine TNF-a, IL-6, IL-10 va mdi liên quan của chúng với các dấu hiệu lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân SXH-D, cần có những nghiên cứu làm rõ hơn vai trò của các cytokine trong cơ chế bệnh sinh của SXH-D Hiện nay, ở Việt Nam vẫn chưa có những nghiên cứu về
nồng d6 cia TNF-o, IL-6 va IL~10 va vai trò của chúng trong bệnh sinh sốt
xuất huyết Dengue Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài * Nghiên cứu nồng độ
TNE-œ, IL-6,IL-10 và mối liên quan của chúng ở bệnh sốt xuất huyết Dengue” với hai mục tiêu
1 Xác định nồng độ TNF-œ, IL-6 và IL-10 ở bệnh nhân sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue
Trang 14
CHUONG 1:
TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Tình hình sốt xuất huyết Dengue
1.1.1 Tình hình sốt xuất huyết Dengue trên Thế giới và khu »ực
| Những trận dịch sốt xuất huyết đầu tiên đã được ghi nhận xây ra vào những năm từ 1778-1780 ở Châu Á, Châu Phi và Bắc Mỹ [73].[74] Biểu hiện lâm sàng của sốt xuất huyết thường được mô tả : sốt cao, nổi ban đỏ, đau cơ khớp, đau đầu, xuất huyết tùy theo mức độ (dạng chấm, nốt, mảng, tụ máu, xuất huyết nội tạng ) Những trường hợp bệnh nặng có thể gây tràn dịch màng phổi, màng bụng, xuất huyết nặng, sốc dẫn đến tử vong Virus Dengue là thủ phạm đầu tiên được phát hiện gây dịch bệnh sốt xuất huyết, sau đó là virus Chikungunya Cả hai đều được lây truyền qua muỗi Aedes Sự xuất hiện gần như đồng thời của các trận dịch sốt xuất huyết trên ba lục địa khác nhau, chứng _ tổ rằng virus gây bệnh cũng như vector truyền bệnh là muỗi Aedes đã phân bố
rộng rãi trên Thế giới [73], [74]
Tỷ lệ mắc bệnh sốt xuất huyết trên Thế giới đã gia tăng mạnh mẽ trong những năm gần đây Trước năm 1970, chỉ có 9 quốc gia có dịch lưu hành, hiện nay đã trở thành dịch trên gần 100 quốc gia ở Châu Phi, Châu Mỹ, khu vực phía đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương Trong đó Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất WHO ước tính mỗi năm có khoảng từ 50 đến 100 triệu người mắc bệnh
SXH-D [73],[74]
- Trong vụ dịch, ty lệ mắc bệnh ở trẻ em thường là 40-50% nhưng cũng
Trang 15ok ee a, SO nahin Ae 6` 4
- Mỗi năm có khoảng 500.000 trường hợp sốt xuất huyết Dengue cần
nhập viện, phần lớn trong số đó là trẻ em Tỷ lệ tử vong chung vào
khoảng 2,5%
- Nếu không được điều trị, tỷ lệ tử vong do sốt xuất huyết Dengue có
thể vượt quá 20% Với phương thức điều trị tích cực hiện đại, tỷ lệ tử vong
còn dưới 1%
Tại Đông Nam Á, dịch SXH-D cũng xuất hiện tại nhiều nước như Thái
Lan, Phillipin, Bangladesh, An D6, Indonesia, Myanmar [74] Số ca mắc bệnh trong những năm gần đây đã tăng nhanh chóng, từ 63.672 ca năm 2000 lên 355314 ca năm 2010 Số ca tử vong cũng tăng từ 656 (2000) lên 1980 (2010)
Năm 2010 số ca nhiễm SXH-D ở Indonesia có tới 80065 ca mắc, Thái Lan có
57948 và Sri Lanka cũng có tới 27142 ca mặc bệnh
1.1.2 Tình hình sốt xuất huyết do virus Dengue tai Việt Nam
Sốt xuất huyết tại Việt Nam được ghi nhận do DENV tir nam 1958 [4], [73] Cho đến nay đã trở thành dịch bệnh lưu hành, tập trung chủ yếu ở Miền
Nam, Miền Trung và thường xảy ra vào mùa mưa Những năm gần đây còn lan ra Miền Bắc và Tây Nguyên [18-23],[30][31] Tình hình SXH-D ở nước ta có diễn biến ngày càng phức tạp, số ca mắc tăng cao sau mỗi năm Theo báo cáo của Bộ Y tế năm 2009 địch xảy ra ở 35 địa phương và chỉ 4 tháng
đầu năm đã có 14107 ca mắc bệnh [1] Năm 2010 có 40 Tỉnh, Thành phố có
dịch với 16635 ca mắc trong 5 tháng đầu năm, tới tháng 10 đã có 88620 ca' mắc [2],[3] va cả năm 2010 có tới 120.000 ca mắc, trong đó có 120 tử vong
[16] Các nghiên cứu cũng cho thấy trong các vụ dịch các týp DENV-I và
DENV-2 gây bệnh chủ yếu
1.1.3 Vector truyền bệnh
Mudi Aedes aegypti và Aedes albopictus đã được xác nhận là vector
truyền bệnh chủ yếu ở hằu hết các khu vực bệnh lưu hành [24],[32] Khi muỗi
Trang 16
5
muỗi khoảng § đến 11 ngày, sau đó muỗi có khả năng truyền bệnh cho người
Khi virus vào cơ thể người, chúng lưu hành trong máu từ 2 đến 7 ngày Trong khoảng thời gian này, nếu muỗi 4eđes hút máu người nhiễm thì virus được truyền cho muỗi Người là ỗ chứa virus chính, ngoài ra có nghiên cứu gần đây cho thấy ở Malaysia có một loài khi sống ở các khu rừng nhiệt đới cũng mang virus Dengue [74] Do những biến đổi về môi trường, xã hội, sự giao lưu thông thương giữa các quốc gia, đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự lan tràn của virus thông qua mudi Aedes Ciing vi thé ma những chủng virus có độc lực cao có điều kiện lan rộng gây nguy hiểm cho người bệnh, và công tác phòng chống bệnh gặp nhiều khó khăn [33],[69].[73] Những nghiên cứu về tập tính của muỗi tại Việt Nam cũng đã được công bố có vai trò quan trọng trong
chiến lược phòng chống bệnh SXH-D [24]
— 1⁄2, Đặc điểm cấu trúc sinh học phân tử của DENV
1.2.1 Cầu trúc đại thể
DENV thuộc một loại Arbovirus chị Flavivirus ho Flaviviridae c6 kich
thước 40-50 nm Cấu tạo của chúng gồm một lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 30nm, mang một chuỗi đơn RNA(+) và được bao quanh bởi lớp lipid kép Lớp vỏ bao bọc ngoài virus có các nhú bề mặt, chúng có khả năng kết dính và trung hòa độc tố Cầu trúc của vỏ gồm protein cấu trúc vỏ và màng [33]
(hình 1.1)
1.2.2 Cấu trúc bộ gen (genome)
Bộ gen của virus Dengue thuộc hệ gen RNA, có chiều dài 11 kb tương ứng 3400 acid amin Nó bao gồm một khung đọc mở đơn mã hóa cho các
protein của virus Khung đọc mở này mã hóa cho các protein có độ lớn 3396, 3391, 3390 và 3386 acid amin tương ứng với các DENV týp [, týp l1, týp II và
typ IV [33] Trình tự các protein được mã hóa là 5-C-prM-E-NSI-NS2A- NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3 Trong đó, một phan tu dau của bộ gen mã
Trang 176
lại [33] Đầu 5 có khoảng 100 nucleotit và đầu kết thúc 3` có khoảng 400-700
nucleotit là những vùng không mã hóa (hình 1.2) Phức hợp vỏ màng Yếu tố trung hòa Lipid màng Vùng kết dính : Hình 1.1 Mô hình mình họa hình thể và cau tao DENV [71] Flavivirus genome Genomic polyprotein S'¢€ | HH | 3’-OH aoe 7 wy Vy vy we yi ei C ES NS1|NS2A|NS2B NS3 |NHA| [NS48] NSS”
Ỷ Signal peptidase $Golgi protease wÿýNS3protease
Hình 1.2 Sơ đồ bộ gen của DENV [72)
Virus Dengue hình thành một phức hệ khác biệt so với các virus thuộc
chi Flavivirus do đặc điểm kháng nguyên và đặc điểm sinh học Mặc dù cả 4
týp đều tương tự nhau về mặt kháng nguyên, nhưng sự khác biệt giữa các týp này vấn đủ để tạo ra khả năng miễn dịch chéo Tòn tại kháng thê của hiện
tượng miễn dịch này yếu, chỉ kéo dài một vài tháng sau khi nhiễm một tro g4
typ virus, do đó khả năng tái nhiễm rất cao [4],[6] Cho dù có miễn dịch với tý
Trang 18
virus đã mắc, nhưng vẫn có thể mắc các týp virus khác Cả bốn týp DENV đều có liên quan tới các vụ dịch sốt Dengue, trong các vụ dịch biểu hiện lâm sàng rất đa dạng, có thể bị sốt Dengue, sốt xuất huyết Dengue hoặc sốc Dengue gây tử vong Ở nước ta, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy có sự lưu hành của
ca 4 typ DENV [18],[19],[20][21],[22],[23]
1.3 Cơ chế bệnh sinh trong SXH do nhiễm DENV 1.3.1 Các giả thuyết về cơ chế bệnh sinh
Virus Dengue có thể gây nhiều thể bệnh khác nhau, song cơ chế bệnh
sinh sốt xuất huyết Dengue vẫn chưa giải thích được một cách đây đủ Hiện nay có 2 giả thuyết chính được đưa ra:
- Giả thuyết về độc lực học của virus: Theo giả thuyết này các týp Dengue có độc lực mạnh thì gây bệnh nặng có xuất huyết, có thê có sốc và tử vong Dengue huyết thanh có thể được phân loại thành những kiểu gen khác nhau trên cơ sở khác biệt về số lượng các nucleotit trên bộ gen của virus Các typ virus Dengue cé thé don thuan, hay kết hợp lưu hành dịch thường xuyên trong cùng một vùng Trong một vụ dịch có một týp huyết thanh gây ra, có thể phân lập được những chủng virus có độc lực liên quan đến mức độ nặng hay nhẹ của bệnh
Protein vỏ E là thành phần chính của bề mặt virus, nó là một glycoprotein tương ứng với kháng nguyên đặc hiệu riêng của từng týp virus Dengue Nó chứa các yếu tố quyết định kháng nguyên quan trọng như yếu tố ngưng kết hồng cầu, yếu tố trung hòa độc tố Các yếu tố này gây ra các đáp ứng
miễn dich trong vật chủ bị nhiễm virus Các đột biến trong protein E có thể ảnh
hưởng đến độc lực của virus Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có bằng chứng
về môi liên quan giữa cấu trúc phân tử và mức độ nặng nhẹ của bệnh Cơ sở
phân tử của độc lực virus Dengue vẫn còn chưa sáng tỏ [33] Việc xác định
kiểu gen những chủng có độc lực cao cũng có vai trò quan trọng trong chân
Trang 19
8
- Gia thuyét vé mién dich hién nay duge nhiéu người chấp thuận: Những
nghiên cứu gần đây đã lý giải được khá nhiều điều trước đây chưa rõ trong cơ
chế bệnh sinh của SXH-D Theo giả thuyết này, bệnh nhân sốt xuất huyết
Dengue có xuất huyết và sốc thường do tái nhiễm DENV hoặc cùng nhiễm các
týp DENV và do đáp ứng miễn dịch bệnh lý của cơ thẻ
Virus Dengue có 4 týp huyết thanh là các typ L, H, IH và IV Mặc dù 4 týp có tính kháng nguyên khác nhau, nhưng chúng có một số nhóm quyết định kháng nguyên chung, đó là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu Do vậy, chúng có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các týp [4],[33] Một người nhiễm một
trong 4 týp có thể miễn dịch với týp đó Tuy nhiên kháng thể này yếu, chỉ tồn
tại một thời gian ngắn Do vậy, một người đã nhiễm Dengue vẫn có thể tái
nhiễm týp đã mắc Điều này lý giải cho việc chưa thể tạo ra vaccin cho phòng bệnh sốt xuất huyết trong thời gian gần đây [54]
Trong cơ chế miễn dịch, phức hợp miễn dịch hình thành không có khả
năng bảo vệ mà lắng động ở nội mô, hoạt hóa bỗ thể, kích hoạt phân ứng viêm
Quá trình này dẫn đến tốn thương tế bào nội mô mạch máu, tăng tính thấm thành mạch, gây thoát huyết tương gây cô đặc máu Tổn thương tế bào nội mô mạch máu, kích hoạt tiểu cầu, hoạt hóa các yếu tố đông máu, tạo điều kiện cho đông máu rải rác trong lòng mạch Như vậy, sự lắng đọng phức hợp miễn dịch có một phần trong bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue [40]
Những nghiên cứu gần đây còn phát hiện ra nhiều cytokine có nồng độ tăng cao ở người bệnh SXH-D như IFN-Y , TNE-o, IL-ó, IL-10 Cac cytokine
này đặc biệt tăng cao trong các trường hợp tái nhiễm [62] Khi nhiễm DENV đặc biệt là khi tái nhiễm, có thể thúc đẩy phản ứng miễn dịch làm cơ thể sản
sinh các tự kháng thé, tăng cường sản xuất các cytokine nhu IFN-Y, TNF-a, IL-
6, IL~10 Mối tương tác giữa chúng có vai trò nhất định trong cơ chế bệnh sinh
Trang 209
Theo Martina va céng su (2009) tổng hợp từ hơn 269 nghiên cứu có liên
quan về bệnh sinh SXH-D cho thấy: DENV có ái tính đối với tế bào và mô có
thể có tác động lớn đến hậu quả của nhiễm DENV [62] Tác giá đã chứng minh
các hệ thống cơ quan chịu tác động mạnh mẽ nhất của DENV là hệ thống miễn
dịch, gan và tế bào nội mô mạch máu Những tốn thương của các hệ thông này
có liên quan chặt chẽ đến cơ chế bệnh sinh SXH-D
- Hệ thống miễn dịch: Khi DENV xâm nhập vào cơ thể sẽ tấn công các
tế bào Langerhan, tế bào đuôi gai và các tế bào sừng Quá trình nhiễm virus
này sẽ được khuếch đại trong hệ thống bạch huyết thông qua đại thực bào và bạch cầu đơn nhân, từ đó lan tỏa trong máu và một số cơ quan gan, lách, tủy
xương Các bạch cầu đơn nhân được kích thích sản xuất globulin miễn dịch,
các chất trung gian hóa học gây viêm và cũng ảnh hưởng sâu sắc tới hệ thông đông máu Hệ thống bổ thể cũng được hoạt hóa, làm tăng cường các phản ứng
miễn dịch Trong đó, kháng thể kháng Anti-NS1 của DENV được coi là yếu tố
quan trọng nhất trong hình thức đáp ứng miễn dịch này Kháng thế chống NSI
của DENV sinh ra có thể hoạt hóa bổ thể C9, C5b Sự hoạt hóa đó kích hoạt
phản ứng tế bao dé san sinh cdc cytokine viêm, hay giải phóng quá mức NO dẫn đến tơn thương tế bào Ngồi ra, kháng thể NS1 của DENV cũng được
chứng minh có phản ứng chéo đối với tiêu cầu, gây phân ứng kháng tiểu cầu và
làm cho số lượng tiểu cầu giảm ở người bệnh SXH-D [62] Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của SXH-D
Nghiên cứu của King CA và cộng sự (2000) cũng cho thấy sự tăng cường sản xuất các cytokine liên quan tới tế bào mast, bạch cầu ái kiểm trên người bệnh nhiễm DENV [44] Phát hiện này đóng góp bổ sung cho các dòng
tế bào bị nhiễm DENV trong bệnh lý nhiễm DENV, điều mà trước đó mới chỉ
được biết đến trên bạch cầu đơn nhân Tế bào mast cư trú chủ yêu trong các mô
Trang 21Pe S 10
thành mạch trong các bệnh dị ứng Bạch cầu ái kiềm cũng chứa các hóa chất
làm tổn thương tế bào nội mô và hoạt mạch mạnh như histamin, serotonin, có khả năng gây tăng tính thắm thành mạch mạnh Người ta còn thấy sự hoạt hóa dòng tế bào này cũng kích thích tế bào tăng cường sản xuất các cytokine, làm nồng độ các cytokine tăng cao ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue, đặc biệt là trong sốt xuất huyết Dengue có sốc [44]
Một số nghiên cứu khác đã chứng minh vai trò của các tế bảo lympho T
va té bao lympho B Sự hoạt hóa tế bào lympho TCD4, TCD8, Thl, Th2 trong
nhiễm DENV, gây tăng giải phóng các cytokine cé vai tro quan trọng trong cơ
chế gây bệnh SXH-D đã được phân tích khá rõ ràng
Chaturvedi U.C và cộng sự (2000),(2009) đã cho thấy các thụ thể CD4 tăng cao trong nhiễm DENV, có vai trò chuyên dạng lympho T thành Th1 và Th2 Các tế bào này tăng cường sản xuất các cytokine ở các bệnh nhân sốt Dengue (DF) và sốt xuất huyết Dengue (DHF) Trong nghiên cứu cũng cho thấy các tế bảo mast và bạch cầu ái kiềm cũng được hoạt hóa bởi NO tăng cao khi nhiễm DENV Các tế bào hoạt hóa này giải phóng histamin làm tăng tinh thấm thành mạch, tạo điều kiện thuận lợi chuyển DF sang DHF cing voi các tác động của các cytokine cũng đang được sản xuất bởi Th1 và Th2 [48],[49]
Green S và cộng sự (1999) cũng cho thấy sự kích hoạt té bao lympho T va su tang cao quá mức các cytokine, đặc biệt là TNF-d trong các trẻ em Thái Lan mắc SXH-D Trong nghiên cứu này cho thấy rằng các thụ thé CD8 ting cao ở nhóm trẻ DHF so với trẻ DF, cùng với sự tăng cao của một số cyfokine
khác như IL-2, TNF-ơ, IFN- [S1]
Các bạch cầu đa nhân trung tính cũng được chứng minh chịu tác động
bởi DENV qua nghiên cứu của Lyngkaran và cộng sự (1995) Tác giả cho rằng
TNF-a phéi hop cing IL-1 làm tăng kết dính giữa tế bào nội mô, làm cho cả tế
bào nội mô và bạch cầu đa nhân trung tính đều thiệt hại Đó cũng có thể là lý
do gây giảm bạch cầu trong SXH-D [60]
Trang 22Se a H1
Như vậy, hầu như các tế bào miễn dịch đều chịu tác động trực tiếp hoặc
gián tiếp của DENV Những tế bào này được hoạt hóa, sản xuất ra các kháng thể, các chất trung gian hóa học, hoạt hóa bổ thể và các cytokine có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của SXH-D
- Virus Dengue trong tế bào gan và tế bào Kupffer cũng được phát hiện ở những người nhiễm Dengue và hiện tượng hoại tử tế bào gan cũng được phát hiện [62] Hiện tượng gan to trên lâm sàng, enzyme AST, enzyme ALT tăng cao cũng được mô tả trong bệnh lý nhiễm DENV [4],[10],[37].[47],[59]
Sự tổn thương các tế bào gan có thể giải thích cho sự suy giảm các yếu tố đông máu và phát triển rối loạn đông máu, vì gan có vai trò trong việc sản sinh ra một số yếu tố đông máu như fibrinogen, prothrombin, yếu tố V, VII, IX và X Ngoài ra còn kéo theo nhiều rối loạn phức tạp khác, do gan còn có nhiều chức năng quan trọng khác nữa
- Tổn thương tế bào nội mạch gây tăng tính thấm thành mạch dẫn đến
thoát huyết tương là tổn thương cơ bản nổi trội nhất trong cơ chế bệnh sinh nhiễm DENV Nó bao gồm nhiều cơ chế: Vai trò gây tồn thương tế bào nội mô của phức hợp kháng nguyên - kháng thể NSI gây hoạt hóa bỗ thê cũng đã được mô tả [62] Ngoài ra còn có vai trò hỗ trợ thêm của các chất trung gian hóa học
được sinh ra trong quá trình nhiễm DENV Sự hoạt hóa các tế bào mast, bạch
cầu ái kiềm liên quan tới cơ chế dị ứng cũng có tác động gây tăng tính thấm thành mạch cũng đã được chứng minh [43],|48] Sự tăng kết dính tế bào nội
mô với bạch cầu đa nhân trung tính gây tôn thương tế bào nội mô, làm tăng tính thấm thành mạch cũng đã được mô tả [60] Các cytokine được sinh ra bởi
các tế bào miễn dịch do tác động trực tiếp hoặc gián tiếp của DENV, còn có khả năng tương tác với các chất trung gian hóa học trong viêm cấp tính như thrombin, histamin cũng đã được công bế trong nghiên cứu của Beynon (2008) Sự tương tác này cũng có phần trong cơ chế gây tồn thương tế bào nội mô và tăng tính thắm thành mạch trong SXH-D
Trang 23
12
1.3.2.Vai tro cua cac cytokine trong co ché bénh sinh SXH Dengue
Cac cytokine 1a cac protein hoc glycoprotein chung được sản xuất bởi
các tế bào bạch cầu viêm và một số tế bào khác Chúng không phải là kháng
thé Trong SXH-D chúng được sinh ra bởi các bach cầu đơn nhân, đại thực bào và một số tế bào khác trong lưới nội mô Các nghiên cứu đã chỉ ra các tế bao tua (Dendritic cell), các tế bào Langeshan ở da và khoảng kê tiếp xúc với
DENV đầu tiên [58],[62] DENV bám dính vào các thụ thể DC-SIGN, qua đó
xâm nhập vào tế bào chủ [27] Chúng nhân lên trong các tế bào, kích thích các tế bảo sản xuất hàng loạt các cytokine như IFN-aœ, TFN-œ, IL-10, IL-15, IL-8,
RANTES, MCP-1a, MCD-1 va NO Sy tang cao cdc cytokine, lam tang biéu
hién MHC lép | va Il, gay tang cudng nhan biét của các té bao lympho cac tế
bao TCD4, TCD8, té bao lympho B Cac té bao nay dugc hoat héa, san xuất “các cytokine IFN-a, TFN-a, IL-10, grazyme, perforin, Fas [48],[49] Cac té bào mono cũng tiếp nhận DENV qua Fc receptor Các mono bào cũng có tác dụng hoạt hóa lympho T, bản thân nó cũng sản xuat cdc cytokine IFN-a,
TNF-a, IL-10, IL-15, IL-8, RANTES, MIF No cfing kich thich cả tế bao NK
san xuat IFN-a, TNF-a Cac cytokine vao mau va phat huy cdc tac dụng sinh học gây ra bệnh cảnh SXH-D [68],[70] Các tế bào lympho B cũng được hoạt hóa sinh ra các kháng thể kháng lại kháng nguyên NS1 và kháng nguyên vỏ E của DENV Những kháng thể này lưu thông trong dòng máu, khi gặp kháng nguyên sẽ kết hợp tạo thành phức hợp miễn dịch có thể lắng đọng gây các tác
hại cho các tế bào nội mô mạch máu (hình 1.3)
Trang 2413 Dengue virus O TEs đuôi gai Mo 7 bao IFN-d, TNE-œ sí a" Suen >TO MCP.1a, MCP-1 a NO C Fe receptor ® Tế bào B ® EN-œ, TNE-œ Té bao lympho T—> L310, 1-15 1-18 B cells NK cells 4 4 IFNœ, TNF-œ —0enge amiNS1 + IFN, TNF-a LH > Derg ene j Tế bảo nôi mô V as TP nội mô °° O - ° @ ee - e QO e Complement at RT O Denguevius @}— WPhirc hop KN- ® sNSI KT Thoát dịch Hình 1.3 Sơ đồ sinh các qytokin do tác động của virus Dengue (http://dc231.4shared.com/img/Uvu_VS3h/preview_html ‘1c20be16.png)
Các cytokine sinh ra còn tương tác với nhau trong mạng lưới phức tạp
của chúng, để rồi lại kích thích các tế bào sản xuất làm nồng độ cytokine ting
cao hơn trong máu Mối liên quan phức tạp trong mạng lưới cytokine đã được
Bozza và cộng sự (2008) sơ đồ hóa trong hình 1.4 Trong sơ đồ này có thể thấy các tế bào mono khi bị DENV xâm nhập sẽ sản xuất ra hàng loạt các
cytokine, có tác động đến các hệ thống khác nhau gây ra các hậu quả quan
trọng trong bệnh sinh nhiễm DENYV
Sau khi được sinh ra, IL-12 tác động trực tiếp gây tăng các yếu tô đông,
máu, có thể dẫn tới đông máu rải rác nội mạch giai đoạn đầu Sau đó, theo qui
luật là xuất huyết do suy giảm các yếu to đông máu vì đã tăng huy động vào
quá trình đông máu Đông máu rải rác nội mạch cũng là một nguyên nhân
giảm tiểu cầu, càng tăng nguy cơ xuất huyết khi mà các yếu tô
Trang 25
14
giảm Giảm tiểu cầu còn chiu tac déng cla MCP-1, ?
được sinh ra bởi các tế bào mono nhiễm virus |
Tén thuong thanh mach do các yeu t6 MCP-1,
ra, các chất trung gian hóa học do các tế bào miễn d
Trang 26
l5
bào lympho T có vai trò làm cho nồng độ IFN- tăng rất cao trong máu Bản thân IFN-Y lại có tác động rất mạnh tới tế bào nội mô, gây tăng tính thấm thành mạch Các nghiên cứu ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue đều chứng minh IFN- tăng cao cá trong sốt Dengue và sốt xuất huyét Dengue [51 ],[65], nồng độ IFN- có thê tăng tới 52,5+7,2pg/ml [64]
Các tế bào TCD4, tế bào mono và Iympho B cũng tác động qua lại với nhau để cùng tăng hoạt động để tăng sản xuất kháng thẻ, các cytokine góp phần tạo dòng thác cytokine cũng được sản xuất từ các tế bào khác
1.3.3 Vai trò của TNF-a, IL-6 và IL-10 trong sốt Dengue và xuất huyết Dengue
- Cytokine TNF-a:
TNF-o 1a cytokine tiền viêm đã được nghiên cứu khá nhiều trong các bệnh lý viêm khác nhau Trong sốt Dengue và sốt xuất huyét Dengue, TNF-a được sinh ra bởi mono bào, đại thực bào khi các tế bào này bị virus xâm nhập [62] Tế bào Iympho cũng được chứng minh có khả năng sinh ra cytokine TNF-a va nhiéu cytokine khac [48],[58],[60],[62] Chaturvedi U.C (2009) da phat hién té bao Th1 sinh ra TNF-a, IFN- va IL-2 con té bào Th2 lại sinh ra IL-4, IL-6 va IL-10 TNF-a c6 trong lượng phân tử 17.000D [15],[ 28] Trong SXH-D nó được chứng minh sinh ra vào ngày 1-2 của sốt, tăng mạnh nhất ở giai đoạn cấp, đạt ngưỡng cao nhất vào khoảng ngày 5-6 của bệnh [47],|48], [60] Lyngkaran N nghiên cứu ở bệnh nhân SXH-D tại Singapore năm 1995 ghỉ nhận nồng độ TNF-œ lên tới 2,100g/1
Tác dụng của TNF-œ là kích thích IL-1 Nó gây tăng các phân tử kết dính và MHC lớp I trên tế bao nội mô, tăng kết dính bạch cau đa nhân trung
tính với tế bào nội mô, qua đó gây tổn thương thành mạch và bạch cầu đa
nhân trung tính đã được phát hiện [35] Bản thân TNF-œ là chất gây sốt nội
Trang 27
16
Nó kích thích GM-CSF, IFN-Y, cũng là các yếu tố hoạt hóa tế bào nội mô
mạch máu rất mạnh, gây tăng tính thắm thành mạch [15],[28],[60]
TNF-g còn tác dụng hợp đồng với IL-1, kích thích hoạt động của các tế bào miễn dịch như Th và tế bào trình diện kháng nguyên (APC) Hai cytokine nay phối hợp kích thích làm tăng hoạt hóa tế bào lympho T, tế bào lympho B gây tăng sản xuất các cytokine, các kháng thể Bản thân TNF-œ, hoặc phối
hop véi IL-1 kích thích tế bào nội mô sản xuất prostaglandin là yếu tố gây
viêm và các yếu tố tiền đông máu, gây đông máu rải rác trong lòng mạch
[15],[28]
Nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò của TNF-a trong sốt xuất huyết
do DENV Vai trò đặc biệt nhất của TNF-ơ được chứng minh là làm tổn
thương tế bào nội mô mạch máu gây tăng tính thấm thành mạch, gây thoát huyết tương làm cô đặc máu Cơ chế này đóng vai trò chủ đạo trong sốc sốt
xuất huyết DENV [10],[35],[60],[62] Việc theo déi chat ché TNF-a, IL-1, IL-
6 đã được khuyến cáo trong tiến triển lâm sàng của bệnh từ sốt xuất huyết Dengue sang sốc xuất huyết Dengue [38],[44],[48],[60}]
- Interleukin 6 (IL-6)
IL-6 cũng la mot cytokine tiền viêm, xuất hiện với nồng độ cao trong các bệnh lý viêm nói chung IL-6 được sinh ra từ nhiều tế bào khác nhau như: lympho bào T và B đã hoạt hóa, mono bào, tế bào nội mạc, tế bào gan và tế
bào xơ non Gen mã hóa cho IL-6 nằm NST thứ 7, có trọng lượng phân tử từ 22.000 đến 30.000D [15],[28] IL-6 có các hoạt tính đa dạng, nhưng chủ yếu
làm tăng tổng hop IL-1 va TNF-a, gay kich thích đáp ứng miễn dịch, nhất là đáp ứng miễn địch của gan trong giai đoạn đầu của viêm IL-6 kích thích tăng
sinh tế bào, tăng biệt hóa, tăng tiết kháng thể của tế bào lympho B Trước đây,
IL-6 duoc coi 1a interferon-82, vi ching có hoạt tính chéng virus va co phan
ứng chéo với TNF-a Đến nay, đã chứng minh tự IL-6 không có tác dụng
chống virrus mà tác dụng thông qua kích thích các tế bào miền dịch tăng sản
Trang 28TRUONG ĐẠI HỌC DIEU DUONG NAM: ĐỊNH 17 THƯ VIỆN saben | xuat TNF-a Voi đặc tính đó, nó được coi là cytokir
6 còn là chất gây sốt nội sinh Do đó, có thể nó cùng TNF-œ gây sốt cao ở
: SXH-D Nó còn kích thích phat triển tương bảo, tạo thuận lợi sản xuất các Ig
¡ miễn địch, tăng biểu lộ MHC lớp I trên nguyên bào xơ, cùng IL-2 thúc đây tế
! bảo gan sản xuất protein ở pha cấp, cùng với IL-3 tăng phát triển tế bào máu,
¡ gây biệt hóa CTL [15],[28]
Ở người bệnh SXH-D, IL-6 đã được chứng minh tăng muộn và chậm
hon TNF-a Nó tăng sinh vào khoảng ngày 3-4 của bệnh, đạt ngưỡng cao nhất vào khoảng ngày 5-7, sau đó giảm nhanh khi hết sốt [10],[37],[28].[44].[62]
Nghiên cứu ở người bệnh SXH-D tại Singapore (1995) đã cho thấy nồng độ
của IL-6 có thể đạt tới 7,400ug/1 vào khoảng ngày 5-6 của bệnh, sang ngày 7-
8 thì giảm nhanh [60]
— -Interleukin I0(L-10):
IL-10 là cytokine chống viêm, vai trò của nó cũng đã được xác định rõ trong nhiều nghiên cứu gần đây IL-10 có trọng lượng phân tử 17.000 - 21.000D do tế bào lympho T, lympho B đã hoạt hóa và tế bào mono tiết ra {15],[28] IL-10 được chứng minh xuất hiện muộn so TNF-ơ Nó thường xuất hiện cùng IL-6 vào ngày thứ 3-8 của SXH-D [43],[53]
Chức năng sinh học của IL-10 là : kích thích tế bao lympho B phat trién va san xuat khang thé, kich thich té bao mast, chuyén té bao Th thanh Th2,
giảm MHC lớp II, ức chế hoạt tính của tế bào trình diện kháng nguyên, giảm
trình diện kháng nguyên Nó có tác dụng ức chế sự sản xuất các cytokine tiền
viêm IL-1, IL-6, IL-8, TNF-ơ thông qua ức chế các tế bào sinh ra chúng
[15],[28],[64] Với đặc tính đó, nếu IL-10 tăng cao quá sẽ gây ức chế miễn _ dịch Vai trò chống viêm của IL-10 được công bế ở một số nghiên cứu khác,
IL-10 liên quan nhiều tới TNF-ơ và IL- 6 cũng đã được chứng mình Khi IL-
10 tăng cao nhất trên lâm sàng, thường gặp vào ngày Š -7, sốt bắt đầu giảm
Trang 29oe ata pete 0000050) thes LS ee A! 18 wen
[48],[49] Nghién citu su bién déi của IL-10 ở bệnh nhân sốt xuất huyết của Lyngkaran N (1995) cũng đã cho thấy IL-10 biến đổi theo mức độ của bệnh: ở bệnh nhân sốt xuất huyết do Dengue, nồng độ IL-10 có thể tăng lên 300- !_500pg/ml, người sốt Dengue nồng độ 300pg/ml, người nhiễm Dengue tăng ít hơn Nỗng độ IL-10 thường tăng cao nhất trước khi hạ sốt 1 - 2 ngày và giảm ¡_ nhanh sau giai đoạn hạ sốt [36]
Ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về biến đổi các cytokine trong sốt xuất huyết Dengue như:
- Nghiên cứu vai trò của cytokine trên 62 trẻ nhũ nhỉ bị sốt xuất SXH-D và 6 trẻ bình thường tại Bệnh viện Nhi đồng I thành phố Hồ Chí Minh, cho thấy nồng độ của IFN- Y, TNF-ơ, IL-6, IL-10 trong huyết thanh trẻ nhũ nhi SXH-D tăng cao hắn so với nhóm chứng Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy sản xuất quá mức các cytokine IFN-Y, TNF-o, IL-6, 1L~10 có thể giữ vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của SXH/sốc SXH-D ở trẻ nhũ nhi [10] Một nghiên cứu khác trên 443 trẻ lớn hơn (6-8 tuổi) tại Việt Nam cũng chứng minh sự tăng cao của cac cytokine kế trên trong các thê của SXH-D [37]
Với các nghiên cứu về cytokine và cơ chế tác động của các cytokine trong cơ chế bệnh sinh của SXH-D nêu trên, phần nào minh chứng và lý giải hai rối loạn cơ bản giữ vai trò chủ đạo thường gặp trong SXH-D là:
w Tăng tính thấm thành mạch:
Do phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể, lắng động phức hợp miễn dịch, kết hợp hoạt hóa bổ thể gây viêm mạch DENV nhân lên trong các bạch cầu đơn nhân kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học, tăng sản xuất các cytokine Các cytokine sản xuất tăng cao quá mức, gây hàng loạt các
biến đổi trong mạng lưới các cytokine Hệ lụy của chúng gây ra các biến đổi như:
+ Kích hoạt hóa bổ thể phát động miễn dịch bỗ sung, tăng các phản ứng
Trang 30i Ot Ott ae i + 19 i | + Giai phong thromboplastin tổ chức, kích hoạt hệ thông đông máu i
ị + Tên thương thành mạch, tăng tính thấm thành mạch gây thoát huyết
: tương làm giảm khơi lượng tn hồn, cơ đặc máu, dân đên các rôi loạn chuyền
|
: hóa có thể dẫn đến sốc [4]
ị * Rối loạn đông máu trong SXH-D là do:
ị + Tế bảo nội mạch bị tôn thương, tăng tính thấm thành mạch
+ Tiểu cầu giảm
+ Các yếu tố đông máu giảm do tiêu thụ vào quá trình tăng đông
J + Suy chức năng gan: Giảm tông hợp các yêu tô đông máu va các chức : năng sinh ly quan trọng khác của gan [4]
1.4 Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng SXH-D Thời kỳ toàn phát có các hội chứng sau:
- Hội chứng nhiễm khuẩn, nhiễm độc
+ Sốt: thường sốt cao đột ngột, kéo dài trung bình 4-7 ngày Khi hạ sốt, nhiệt độ thường xuống đột ngột, kèm theo huyết áp giảm, có thê gây sốc
+ Bạch cầu máu ngoại vi bình thường hoặc giảm, lympho bào tăng, tốc
độ lắng máu không tăng
- Hội chứng xuất huyết:
_ + Hội chứng xuất huyết thường gặp ở ngày thứ 4 đến ngày thứ 7 của bệnh, khi đang sốt cao hoặc hạ sốt Các dạng xuất huyết tự nhiên thường gặp là: xuất huyết dưới da, niêm mạc Trường hợp nặng có thể có xuất huyết tiêu hóa, xuất huyết tiết niệu, xuất huyết não-màng não
- Các triệu chứng khác tùy thuộc vào mức độ bệnh, có thể thấy:
+ Gan to >2cm dưới bờ sườn,
+ Hạch sưng: Hay gặp hơn ở sốt Dengue
+ Ban dát sân: Hiểm gặp ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue hay gặp ở
Trang 3120
+ Biểu hiện mất nước: Máu cô đặc hematfocrit tăng (tiêu chuẩn đánh giá : hematocrit tăng trên 45% hay tăng trên 20% so với bình thường)
ị + Tiểu cầu giảm theo các mức độ: nặng khi số lượng tiểu cầu dưới
ị 50G/I, tiểu cầu giảm trung bình 50- 70G/1 và tiểu cầu giảm nhẹ khi số lượng
' dưới 100G/I
1.5 Các phương pháp chẵn đoán sốt xuất huyết Dengue | 1.5.1 Dua vao lam sàng và cận lâm sàng
Ì 1.5.2 Phân lập virus
; Virus Dengue có thể được phân lập bằng cách nuôi cấy trong não chuột : và tế bào muỗi Các phương pháp nuôi cay té bao in vitro sử dung dong tế bảo
| mudi (C6/36) và các dòng tế bào động vật khác, nhạy hơn so với phương pháp in vivo, nhanh và đơn giản hơn Cho đến nay, phương pháp phân lập virus vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chân đoán virus [4],[29]
1.5.3 Chấn đoán huyết thanh học
Sử dụng kỹ thuật ELISA phát hiện trực tiếp kháng nguyên vỏ, màng và Antfi-NSI của virus Dengue Kháng thê kháng Anti-NS1 được tiết ra từ các tế
bào vật chủ tạo một phản ứng thê dịch mạnh Nhiều nghiên cứu đã sử dụng sự phát hiện Anti-NSI để phát hiện sớm nhiễm Dengue Nhiéu kit thương mại dùng để phát hiện Anti - NS1, dựa trên phản ứng kết hợp kháng nguyên -
khang thé đang được sử dụng rộng rãi.[5],[36]
Dùng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể IgM và IgG của DENV:
DENV- IgM 1a khang thé kháng protein màng M của DENV Nó được sinh ra
khi virus xâm nhập vào tế bào cơ thể DENV-IgM được sinh ra sau ngày sốt thứ 2-3, thường sau khi hết sốt thì giảm dần và kéo dài khoảng 20 ngày
Trang 32
21
nhạy và đặc hiệu cao, nhưng chỉ dùng được khi bệnh nhân sau sốt ngày thứ 4
- 5 hay lâu hơn, không thể dùng để chân đoán sớm 1.5.4 Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện DENV
- Kỹ thuật RT-PCR:
RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) là phương pháp có độ nhạy cao ding phat hién mRNA cia virus Vé co ban RT-PCR bao gồm hai bước: Phân ứng chuyển đổi RNA sang DNA và phản ứng khuếch đại PCR sử dụng cặp môi đặc hiệu RT-PCR có thê thực hiện trong một bước, :! trong đó toàn bộ các thành phần của các phản ứng được trộn đều trước phản ứng Mặc dù phương pháp RT-PCR một bước đơn giản và thuận tiện, giảm thiêu khả năng lây nhiễm, nhưng sản phẩm khong thé sir dung nhu cDNA được thực hiện trong RT-PCR hai budc [42],[46],[61]
- Kỹ thuật Realtime RT-PCR:
Đây là kỹ thuật phát hiện, định lượng mRNA của DENV Trong thử
Trang 3322 ‡ 7 ỹ $ CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ị 2.1 Đối tượng nghiên cứu
j 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đỗi tượng
Ị Chọn bệnh nhân theo tiêu chuẩn của WHO — 2009
| - Lâm sàng: Sốt cao đột ngột và liên tục từ 2 đến 7 ngày Và có từ 2 trở
ị lên trong các dấu hiệu sau:
Ị + Xuất huyết: có nghiệm pháp dây thắt (+), hoặc có xuất huyết tự nhiên
| dưới da, niêm mạc, hay xuất huyết nội tạng | + Nhức đầu, chán ăn, buồn nôn
+ Da sung huyết, phát ban
+ Đau cơ, đau khớp, nhức 2 hỗ mắt - Cận lam sang:
+ Hematocrit bình thường hoặc tăng ( Hct >45% hoặc trên 20% trị số
bình thường)
+ Tiểu cầu bình thường hoặc giảm + Bạch cầu thường giảm
+ Lựa chọn các bệnh nhân có một trong các tiêu chuẩn DENV- IgG(+),
DENV- IgM(+), cả DENV- IgM(+) và DENV- IgG(+) hoặc RNA(t) với
DENV
Các bệnh nhân được chia làm 2 nhóm: Nhóm sốt Dengue (DF) và sốt xuất huyết Dengue (DHF)
- Nhóm 3: Lựa chọn người khỏe mạnh có các chỉ số về tuôi, giới tương
tự như nhóm bệnh làm nhóm chứng
2.1.2 Số lượng đối tượng trong các nhóm
Trang 341= ae 23 - Nhóm DF có 38 bệnh nhân - Nhóm DHF có 36 bệnh nhân
Trong các bệnh nhân có 22 bệnh nhân có kết quả RT-PCR(+) với DENV (Typ 1 cé 4, typ II cé 8 và 10 đồng nhiễm cả 2 týp I và týp II) 21 bệnh nhân có DENV-IgM(+) 9 bệnh nhân có DENV-IgG(+) 22 bệnh nhân có cả
DENV-IgM(+) va DENV-IgG(+)
2.2 Phuong phap nghién ciru
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
- Phương pháp mô tả cắt ngang có đối chứng
- Chọn mẫu ngẫu nhiên có chủ đích
- Sử dụng phiếu điều tra theo mẫu phù hợp với mục đích nghiên cứu 2.2.2 Các chỉ tiêu lâm sàng
Sử dụng phiếu điều tra thiết kế theo mục đích nghiên cứu để thu thập
thông tin
- Tuổi, giới
- Thời gian sốt tính đến ngày khám, dùng nhiệt độ đo ở nách Chia mức
độ sốt thành 3 mức: Sốt nhẹ khi nhiệt độ đo được từ 37,5”C-38°C, 38°C< sốt
vừa <39C, sốt cao khi nhiệt độ đo được trên 39C
- Các dấu hiệu xuất huyết tự nhiên: Xuất huyết dưới da dạng ban, xuất huyết đưới niêm mạc: chảy máu chân răng, chảy máu cam, xuất huyết nội tạng: nôn ra máu, ỉa phân đen, đái máu
- Nghiệm pháp dây thắt (+)
- Đánh giá gan to trên lâm sàng: Bình thường gan không vượt quá bờ
sườn Khi bờ đưới gan vượt quá bờ sườn được xác định là gan to, có thêm kết quả siêu âm để chân đoán xác định
- Dấu hiệu hạch ngoại biên to
2.2.3 Các xét nghiệm cận lâm sàng
Trang 35Fa eee 25
+ Tién hanh xét nghiệm các chỉ số về máu tại khoa huyết học và khoa sinh hóa bệnh viện 103
+ Tách huyết tương làm chân đoán huyết thanh học và sinh học phân tử Mẫu đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút, sau đó tách huyết tương
chuyển vào 3 ống có nắp khóa Các mẫu được mã số hóa thống nhất, lưu trữ mẫu trong điều kiện nhiệt độ 4-8°C, chuyển về phòng thí nghiệm trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh Y - Dược học - HVQY trước 2 giờ kẻ từ khi tách mẫu
Tiến hành các xét nghiệm xác định mẫu huyết thanh nhiễm DENV bằng các kỹ thuật RT-PCR, xác định DENV-IgM, DENV-IgG băng các kít
SD - Standard diagnostic - INC ctia Han Quéc Tién hanh dinh luong TNF-a, IL-6 và IL-10 trên mẫu huyết thanh đã xác định do nhiễm DENV ngay hoặc
bảo quản ở - 80°C đến khi sử dụng Các kỹ thuật này đều được thực hiện tại
trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh Y - Dược học - HVQY 2.3 Dinh lượng các cytokine TNF-a, IL-6 va IL-10
2.3.1 Vật liệu, thiết bị dùng dé dinh lrong TNF-a, IL-6 và IL-10
- Bộ kít TNF-ơ, IL-6 va IL-10 của hãng AviBion - Orgenium cua Phần Lan dé dinh luong TNF-a, IL-6 va IL-10 trong mau huyét tương của các đối tượng đã chọn (Hình 2.1)
- Các dụng cụ cần thiết để thực hiện kỹ thuật: Pipet thường, pipet đa
kênh, đầu côn, nước cất 2 lần (Hình 2.2)
- Đọc kết quả ELISA bằng máy BECKMAN-COULTER-DTX 880 của Hoa kỳ, kết nối hệ thống vi tính tại D3 trung tâm nghiên cứu sinh Y - Dược
Trang 3626
Trang 37
Hinh 2.3 Hé thong mdy doc két qua ELISA
2.3.2 Nguyên lý kỹ thuật định lượng các cyfokine
Về nguyên lý kỹ thuật và các bước tiến hành định lượng TNF-œ, IL-6 và IL-10 tương tự như nhau, theo hướng dẫn của nhà sản xuất Chúng tôi mô tả điển hinh dinh lugng TNF-a :
Sử dụng AviBion - Human -TNF-a ELISA kit cia Phan lan
Nguyên lý kỹ thuật như sau:
- Kháng thé don dòng thứ nhất được có định trên nền giếng - Mẫu xét nghiệm được cho vào giếng và ủ
- Sau đó rửa sạch phần không bám dích đặc hiệu, khang the đơn dòng thứ hai được thêm vào, đây là kháng thê đã được gắn sẵn enzyme Horseradish :
Peroxidase (HRP) và được ủ một thời gian nhất định theo hướng dẫn
- Rửa sạch chất bám dính không đặc hiệu lần thứ 2 Tín hiệu màu đi
Trang 38
28
- Sau khi đã ủ đủ thời gian, phản ứng được đừng bằng dung dịch Stop
solution (H2SO, )
- Đọc kết quả trên máy đo quang học ở bước sóng 450nm Nguyên lý của kỹ thuật được minh họa tại phụ lục Í
2.3.3 Các bước tiến hành - Chuẩn bị mẫu
Thuốc thử và mẫu đề ở nhiệt độ phòng (18 - 25°C) trước khi sử dụng < Mẫu được rã đông trong nước đá trước khi làm xét nghiệm
- Pha loãng chuẩn thử nghiệm: Theo sơ đồ hướng dẫn của nhà sản xuất 300 ni chất TNF- ơ chuẩn - im pg /ml) 150 pl dich 1 mẫu 150pl 150pl 150pl 150pl 150pl 150gl dšššgšc 2 1000pg/ml 500 125 625 3125 15/625
Hình 2.4 Sơ đồ pha loãng chuẩn theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Chuẩn bị 8 ống tiêu chuẩn, mã hóa các ống
Ống-1: Cho 300ul chat TNF-a chuan (Standart 1000pg/ml) | Thêm 150ul Sample Diluent (dich pha mẫu) vào 7 ống khác Lấy 150pl
từ ống 1 chuyển sang ống 2 được dung dịch 500pg/ml N6i tiếp pha lỗng nhị
mơ tả trong sơ đồ ta được các ông có nòng độ giảm đi một nửa Lần lượt ống còn lại có nồng độ 250pg/ml, 125pg/ml, 62 pm Ö 31 Than 5,
Trang 39- Pha dung dịch rửa: Pha loãng (Wash buffer) với 475ml nước cất 2 lầi
- Biotinylated antibody và Avidin a
Trang 40chứng âm Tính toán giá trị hấp thụ trung bình c
Đường chuẩn được tạo ra bằng cách
sóng 450nm) thu được cho mỗi chuân :
với tương ứng với TNF-œ (pg/m]) trên trụ
nhờ phần mềm thống kê trong máy + Các giá trị nồng độ cytokine chứng sẽ được máy tính xử lý bằng ph