Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng và đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết trên thực nghiệm của cao đặc tan thống phong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ HOÀNG YẾN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CAO ĐẶC TAN THỐNG PHONG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ HOÀNG YẾN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CAO ĐẶC TAN THỐNG PHONG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU- DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Hồng Cường HÀ NỘI 2022 LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin gửi cảm ơn Ban giám hiệu, phịng Sau đại học, tồn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy bảo tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu Trường Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người thầy giản dị, ln nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng bảo trực tiếp hướng dẫn, định hướng tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài, hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm đến ThS Nguyễn Thị Phượng đồng nghiệp Khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ acid uric thực nghiệm cao đặc phương thuốc Tan thống phong Tôi xin cảm ơn tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, ln giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn Cuối lời cảm sâu sắc tơi muốn gửi tới gia đình, bạn bè tồn thể đồng nghiệp ln bên cạnh, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Do kiến thức thân cịn hạn chế, nên luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận góp ý, chỉnh sửa từ q thầy cơ, bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2022 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Phương pháp định tính dược liệu SKLM 1.1.1 Phương pháp SKLM 1.1.2 Ứng dụng SKLM 1.2 Phương pháp định tính, định lượng HPLC 1.2.1 Phương pháp HPLC .4 1.2.2 Ứng dụng phương pháp HPLC .4 1.2.3 Định tính, định lượng BBR HPLC .5 1.3 Tổng quan acid uric máu 1.3.1 Khái niệm acid uric máu 1.3.2 Sinh chuyển hóa acid uric 1.3.3 Tăng acid uric máu bệnh lý liên quan 1.3.4 Mô hình dược lý gây tăng acid uric máu thực nghiệm 1.4 Phương thuốc Tan thống phong 1.4.1 Công thức 1.4.2 Nguồn gốc xuất xứ phương thuốc 1.4.3 Công năng, chủ trị phương thuốc 1.4.4 Tiêu chuẩn chất lượng 10 1.5 Thông tin vị thuốc 10 1.5.1 Hoàng bá 10 1.5.2 Thương truật 13 1.5.3 Ngưu tất .15 1.5.4 Hy thiêm 16 1.5.5 Tri mẫu 18 1.5.6 Mộc qua .20 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu .23 2.1.2 Động vật thí nghiệm 24 2.1.3 Thiết bị, máy móc, dụng cụ 24 2.1.4 Hóa chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Định tính vị thuốc thành phần sắc ký lớp mỏng định lượng berberin hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC 26 2.2.2 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc Tan thống phong .31 2.3 Xử lý số liệu 34 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Định tính vị thuốc thành phần sắc ký lớp mỏng định lượng berberin hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC .35 3.1.1 Định tính vị thuốc cao đặc Tan thống phong SKLM 35 3.1.2 Định tính, định lượng berberin hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC .43 3.2 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc Tan thống phong 53 3.2.1 Mơ hình nghiên cứu tác dụng hạ acid uric chuột gây tăng acid uric cấp .53 3.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase gan chuột 55 CHƯƠNG BÀN LUẬN 57 4.1 Định tính vị thuốc thành phần sắc ký lớp mỏng định lượng berberin hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC .57 4.1.1 Về định tính vị thuốc cao đặc Tan thống phong SKLM .57 4.1.2 Về định tính, định lượng berberin hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC .59 4.2 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc Tan thống phong 61 4.2.1 Về tác dụng hạ acid uric huyết cao đặc Tan thống phong 61 4.2.2 Về tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase gan chuột cao thuốc .62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .64 KẾT LUẬN 64 1.1 Định tính vị thuốc thành phần sắc ký lớp mỏng định lượng berberin hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC 64 1.1.1 Định tính vị thuốc cao đặc Tan thống phong SKLM 64 1.1.2 Định tính, định lượng berberin hydroclorid cao đặc Tan thống phong HPLC .64 1.2 Về đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc Tan thống phong 65 KIẾN NGHỊ .65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BBR Berberin hydroclorid DDVN V Dược điển Việt Nam V DĐTQ Dược điển Trung Quốc DM Dung mơi DL Dược liệu HB Hồng bá HKCMMS Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông Trung Quốc HT Hy thiêm HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MQ Mộc qua NT Ngưu tất NSAID Thuốc chống viêm khơng steroid PA Tinh khiết để phân tích P-HB Placebo Hoàng bá P-HT Placebo Hy thiêm P-MQ Placebo Mộc qua P-NT Placebo Ngưu tất P-TM Placebo Tri mẫu P-TTr Placebo Thương truật RSD Độ lệch chuẩn tương đối TM Tri mẫu TTr Thương truật TT Thuốc thử SKLM Sắc ký lớp mỏng XOD Xanthin oxidase YHCT Y học cổ truyền % tt/tt % thể tích/ thể tích DANH MỤC BẢNG Bảng Hóa chất dung mơi sử dụng cho định tính, định lượng 25 Bảng Kết SKLM định tính vị thuốc Hồng bá cao đặc Tan thống phong bước sóng 366 nm 35 Bảng Kết SKLM định tính vị thuốc Thương truật cao đặc Tan thống phong bước sóng 366 nm 36 Bảng 3 Kết SKLM định tính vị thuốc Ngưu tất cao đặc Tan thống phong quan sát ánh sáng thường 38 Bảng Kết SKLM định tính vị thuốc Hy thiêm cao đặc Tan thống phong ánh sáng thường 39 Bảng Kết SKLM định tính vị thuốc Tri mẫu cao đặc Tan thống phong bước sóng 366 nm 40 Bảng Kết SKLM định tính vị thuốc Mộc qua cao đặc Tan thống phong bước sóng 366 nm 42 Bảng Kết khảo sát nhiệt độ cột .45 Bảng Kết khảo sát dung môi chiết 45 Bảng Kết khảo sát thời gian chiết 45 Bảng 10 Kết độ thích hợp hệ thống (n=6) 47 Bảng 11 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng BBR .48 Bảng 12 Độ lặp lại độ xác trung gian 49 Bảng 13 Kết độ phương pháp 50 Bảng 14 Kết định lượng hàm lượng BBR mẫu cao đặc 51 Bảng 15 Thời gian lưu RT pic sắc ký đồ mẫu dược liệu Hoàng bá mẫu cao đặc 53 Bảng 16 Ảnh hưởng cao chiết Tan thống phong đến nồng độ acid uric huyết chuột mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat (n=10) 54 Bảng 17 Ảnh hưởng cao chiết Tan thống phong lên hoạt độ enzym XOD (n=10) 55 DANH MỤC HÌNH Hình 1 Hệ thống HPLC [7] Hình Quá trình hình thành acid uric thể [67] Hình Các dược liệu phương thuốc Tan thống phong 23 Hình Sắc ký đồ định tính Hồng bá bước sóng 35 Hình Sắc ký đồ định tính Thương truật bước sóng 366 nm .36 Hình 3 Sắc ký đồ định tính Ngưu tất ánh sáng thường 38 Hình Sắc ký đồ định tính Hy thiêm ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu 39 Hình Sắc ký đồ định tính .40 Hình Sắc ký đồ định tính .42 Hình Hình ảnh phổ BBR khoảng 200- 400 nm .43 Hình Sắc ký đồ khảo sát chương trình rửa giải đẳng dịng (hệ I) 44 Hình Sắc ký đồ khảo sát theo chương trình rửa giải gradient (hệ II) 44 Hình 10 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu ghi bước sóng 347 nm 46 Hình 11 So sánh phổ UV mẫu thử mẫu chuẩn BBR .46 Hình 12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic BBR 48 Hình 13 Sắc ký đồ BBR LOD .50 Hình 14 Sắc ký đồ mẫu chuẩn BBR 52 Hình 15 Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hoàng bá 52 Hình 16 Sắc ký đồ mẫu cao đặc Tan thống phong 52 Hình 17 Ảnh hưởng cao chiết Tan thống phong đến nồng độ acid uric huyết chuột mơ hình gây tăng acid uric cấp kali oxonat (n=10) 54 Hình 18 Ảnh hưởng cao chiết Tan thống phong lên hoạt độ enzym XOD (n=10) .56 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ mắc tỷ lệ mắc bệnh gút gia tăng nhiều nước phát triển Ước tính tỷ lệ lưu hành bệnh gút báo cáo toàn giới dao động từ 0,1% đến xấp xỉ 10%, tỷ lệ mắc bệnh từ 0,3 đến trường hợp 1.000 người/ năm có khác khu vực giới, nước phát triển nói chung có tỷ lệ mắc bệnh cao nước phát triển [58] Tại Việt Nam, theo thống kê chương trình định hướng cộng đồng kiểm soát bệnh thấp khớp (COPCORD), tỷ lệ mắc bệnh gút khoảng 0,14% Bệnh có xu hướng ngày gia tăng mức sống tăng dẫn đến lối sống vận động, ăn nhiều protein, uống rượu bia [43] Acid uric sản phẩm cuối q trình chuyển hóa base purin [77] Khi acid uric máu tăng cao vượt độ bão hòa, gây gút cấp Hoặc acid uric kết tinh lại thành tinh thể urat lắng đọng khớp gây nên bệnh khớp mạn tính urat; lắng đọng da, mô mềm tạo thành hạt tôphi; lắng đọng thận gây sỏi thận [9] Bệnh gút khơng nằm nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu ung thư, tim mạch lại ảnh hưởng không nhỏ đến chất lượng sống bệnh nhân [9] Vì vậy, kiểm sốt nồng độ acid uric mục tiêu điều trị bệnh Các thuốc hạ acid uric chia thành nhóm theo chế: giảm tổng hợp acid uric, tăng thải trừ acid uric qua thận nhóm tiêu hủy acid uric [36] Tuy nhiên, thuốc tân dược lại có nhiều tác dụng khơng mong muốn ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh Ví dụ Allopurinol coi thuốc đầu tay điều trị bệnh gút lại gây nguy bị phản ứng có hại da (SCAR) người mang kiểu gen HLA-B*58:01 [56] Hiện nay, việc điều trị gút y học cổ truyền giới hướng tới với hiệu điều trị lâu dài tác dụng khơng mong muốn Có nhiều vị thuốc có tác dụng hạ acid uric máu như: Hoàng bá, Hy thiêm, Thương truật nghiên cứu ứng dụng điều trị gút [57], [64] Tam diệu hoàn (DĐTQ 2015) có tác dụng nhiệt táo thấp, dùng điều trị chứng phong thấp nhiệt tý, tương đương với điều trị thể viêm khớp cấp tính, bệnh gút Vị thuốc Hồng bá vị qn, vị thuốc định tác dụng phương thuốc với thành phần hoạt chất berberin; Thương truật vị thần có tác dụng hỗ trợ, tăng cường tác dụng Hoàng bá việc làm giảm nồng độ acid uric huyết; Ngưu tất giúp tăng cường hiệu điều trị chi [94] Tan thống phong thiết kế dựa gia giảm từ phương thuốc Tam diệu hoàn, trọng tăng cường hiệu điều trị bệnh gút Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá chất lượng tác dụng dược lý mơ hình động vật thực nghiệm cao đặc phương thuốc Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Thương truật PL-20 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Thương truật PL-21 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Ngưu tất PL-22 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Ngưu tất PL-23 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Hy thiêm PL-24 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Hy thiêm PL-25 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Tri mẫu PL-26 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Tri mẫu PL-27 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Mộc qua PL-28 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu chuẩn Mộc qua PL-29 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ CỘT Sắc ký đồ nhiệt độ cột 20 0C Sắc ký đồ nhiệt độ cột 30 0C Sắc ký đồ nhiệt độ cột 40 0C PL-30 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT DUNG MƠI CHIẾT Sắc ký đồ sử dụng dung mơi chiết methanol 50% Sắc ký đồ sử dụng dung môi chiết methanol 70% Sắc ký đồ sử dụng dung môi chiết methanol 100% PL-31 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT Sắc ký đồ thời gian chiết 15 phút Sắc ký đồ thời gian chiết 30 phút Sắc ký đồ thời gian chiết 45 phút PL-32 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG CÁC MẪU CAO ĐẶC TAN THỐNG PHONG Sắc ký đồ định lượng BBR mẫu cao đặc Tan thống phong chiết nước mẻ Sắc ký đồ định lượng BBR mẫu cao đặc Tan thống phong chiết nước mẻ Sắc ký đồ định lượng BBR mẫu cao đặc Tan thống phong chiết nước mẻ PL-33 Sắc ký đồ định lượng BBR mẫu cao đặc Tan thống phong chiết ethanol 70% mẻ Sắc ký đồ định lượng BBR mẫu cao đặc Tan thống phong chiết ethanol 70% mẻ Sắc ký đồ định lượng BBR mẫu cao đặc Tan thống phong chiết ethanol 70% mẻ PL-34 ... cứu đánh giá chất lượng tác dụng dược lý mơ hình động vật thực nghiệm cao đặc phương thuốc Từ lý trên, đề tài ? ?Xây dựng số tiêu chất lượng đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ HOÀNG YẾN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CAO ĐẶC TAN THỐNG PHONG. .. hydroclorid cao đặc phương thuốc Tan thống phong HPLC .59 4.2 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thực nghiệm cao đặc Tan thống phong 61 4.2.1 Về tác dụng hạ acid uric huyết cao