Giáo trình Vi sinh đại cương cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản nhất về nông Khuyến nông, kỹ thuật tổ chức và quản lý các chương trình Vi sinh đại cương nhằm giúp sinh viên sau khi ra trường có thể nắm được các kỹ năng cần thiết để xây dựng và quản lý chương trình Vi sinh đại cương một cách hiệu quả nhất. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 2 giáo trình.
Chương QUAN SÁT VI SINH VẬT Mỗi loại vi sinh vật khác phát triển môi trường dinh dưỡng tạo hình dạng khác nhau, thay đổi mơi trường dinh dưỡng vi sinh vật có dạng khác Dựa vào dạng đặc biệt đốn biết chúng thuộc nhóm kiểm tra hình dạng chúng qua kính hiển vi quang học 3.1 Mục đích – yêu cầu - Giúp sinh viên quan sát diện vi sinh vật xung quanh phát triển môi trường dinh dưỡng - Nhận diện nhóm vi sinh vật nầy mắt thường kính hiển vi 3.2 Nguyên, vật liệu thực hành - Đĩa petri, ống nghiệm bình tam giác chứa mơi trường dinh dưỡng đặc lỏng có chứa vi sinh vật - Kính hiển vi quang học - Kính mang vật (lame) phẳng kính đậy vật (lamelle) - Đèn cồn, kim cấy… 3.3 Thực hành quan sát vi sinh vật mắt Trên môi trƣờng đặc Mỗi tế bào vi sinh vật mọc môi trường dinh dưỡng đặc, phát triển thành dạng đặc biệt gọi khuẩn lạc (colony) Khuẩn lạc tập đoàn vi sinh vật sinh từ tế bào hay bào tử có trước Tùy theo cách phát triển nhóm vi sinh vật mà khuẩn lạc có hình dạng, dạng bìa, độ nổi, màu sắc, độ nhớt… khác Quan sát mô tả khuẩn lạc tiêu chuẩn để định danh, phân loại vi khuẩn - Dựa vào hình dạng, khuẩn lạc có loại: dạng điểm, dạng trịn, dạng khơng đều, dạng rễ dạng hình thoi 16 ● Điểm Trịn khơng rễ Thoi - Bìa khuẩn lạc, có loại bìa: ngun, gợn sóng, chia thùy, cưa sợi Bìa ngun Gợn sóng chia thùy cưa Dạng sợi - Độ khuẩn lạc có loại: phẳng, lài, mô cầu chồng Phẳng lài mô cầu chồng - Màu sắc khuẩn lạc: màu trắng đục, trắng trong, mà vàng, màu cam, màu xám, màu đen, xanh rêu, nâu đen… - Kích thước khuẩn lạc: tùy thuộc vào độ tuổi khuẩn lạc, kích thứơc biến động từ đầu kim đường kính đĩa petri Quan sát mắt ta phân biệt loại khuẩn lạc khác biệt nhau: - Khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men: khuẩn lạc vi khuẩn nhiều tế bào cấu tạo đơn bào nên chúng tạo khuẩn lạc mơi trường đặc có đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường trịn, khơng đều, hình thoi; bìa khuẩn lạc bìa ngun, gợn sóng, chia thùy hay cưa 17 - Khuẩn lạc nấm mốc: cấu tạo nhiều sợi nấm nên khuẩn lạc mơi trường đặc có hình dạng rễ cây, bìa khuẩn lạc sợi, nhìn kỹ ta thấy sợi gòn thật mịn, màu trắng xám sinh bào tử (có màu sắc khác nhau) phát xuất từ khuẩn lạc Môi trƣờng lỏng Vi sinh vật sinh trưởng môi trường lỏng tùy thuộc nhóm hiếu khí hay kỵ khí mà chúng làm đục mơi trường, tạo váng (màng), tạo cặn (tích tụ) hay tạo kết tủa - Nếu làm đục mơi trường xem làm đục hay tạo dạng bơng hay sóng lụa - Nếu tạo màng cần nêu rõ đặc điểm màng (mỏng hay dầy, phẳng hay gấp nếp) - Nếu tạo cặn hay kết tủa phải nêu đặc tính hay nhiều, xốp hay đặc dạng bông, dạng hạt hay dạng nhầy 3.4 Thực hành quan sát vi sinh vật kính hiển vi Quan sát kính hiển vi phương pháp sau đây: Phƣơng pháp giọt ép: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật không gian chiều để thấy chuyển động chúng cách: Nhỏ giọt nước cất tiệt trùng lên kính mang vật (phẳng) Khử trùng kim cấy đèn cồn để nguội Châm đầu kim cấy vịng lên mơi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn nấm men, lấy vi khuẩn vi nấm chấm vào giọt nước kính mang vật trải mỏng Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước (sao cho khơng có bọt khí) Quan sát kính hiển vi x10, x40 để thấy chuyển động thật chuyển động brown (nếu khơng có roi khơng có chuyển động thật) Phƣơng pháp giọt treo: giúp sinh viên quan sát vi sinh vật không gian chiều, vi sinh vật chuyển động theo nhiều hướng cách: Nhỏ giọt nước môi trường lỏng tiệt trùng lên kính đậy vật 18 Dùng kim cấy khử trùng nhiệt để chuyển vi khuẩn từ đĩa petri vào giọt nước kính đậy vật Thoa vaseline theo cạnh kính đậy vật Lật ngược úp kính đậy vật lên lame lõm cho giọt nước lõm Quan sát chuyển động vi khuẩn nơi lame lõm CÂU HỎI Tại quan sát vi sinh vật kính hiển vi phải nhỏ giọt nước cất lên lam kính? Tại có màu sắc khuẩn lạc khác môi trường? Sinh viên quan sát khuẩn lạc đĩa petri chứa mơi trường đặc, mơ tả vẽ hình khuẩn lạc nấm men, nấm mốc vi khuẩn Quan sát vẽ hình vi khuẩn giọt ép Quan sát kính hiển vi, cho biết di chuyển vi khuẩn, nấm men mẫu? 19 Chương KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN THUẦN KHIẾT Cấy vi khuẩn công việc đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy khử trùng Yêu cầu việc nuôi cấy vi khuẩn đảm bảo tính khiết dịng vi khuẩn cần ni cấy Muốn vậy, phải thực q trình ni cấy vi khuẩn điều kiện vô trùng, không vi khuẩn từ môi trường xung quanh nhiễm bẩn vào Chúng ta biết giới xung quanh ta từ khơng khí đến bề mặt đồ vật, quần áo, chân tay…đều ln có số lượng lớn vi sinh vật, vi sinh vật sẵn sàng gây nhiễm môi trường nuôi cấy ta thực việc nuôi cấy vi khuẩn Các vi khuẩn thường cấy môi trường dinh dưỡng lỏng đặc đựng ống nghiệm hộp đĩa petri Tất dụng cụ thủy tinh môi trường dinh dưỡng khử trùng trước thực hành 4.1 Mục đích yêu cầu - Trang bị cho sinh viên biết số phương pháp gieo cấy, phân lập cấy truyền vi khuẩn từ loại mẫu khác phục vụ cho cơng tác chẩn đốn, xét nghiệm - u cầu sinh viên biết cách lấy mẫu, bảo quản vận chuyển mẫu dùng cho việc cấy phân lập vi khuẩn - Sinh viên biết cách nhận biết số dạng khuẩn lạc - Sinh viên phải nắm vững nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy mục đích việc cấy phân lập cấy truyền 4.2 Vật liệu thực hành: - Kim cấy loại cứng loại mềm (kim nhọn kim tròn) - Dĩa petri ống nghiệm chứa mơi trường có vi sinh vật phát triển - Dĩa petri ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng - Pipette, đèn cồn, bơng gịn thấm, cồn khử trùng, dao mổ 20 Kim cấy vòng đầu cứng Kim cấy vòng đầu mềm Dao mổ y tế Kim cấy vi khuẩn Kim cấy có móc Kim cấy dẹp Hình Các dụng cụ chuyên dùng để cấy, chuyển vi sinh vật từ môi trƣờng sang môi trƣờng khác Kim cấy nhọn kim cấy vòng sợi dây kim khí (platin hay nickel chrome) chóng nóng, chóng nguội tránh bị rỉ sét đốt đỏ nhiệt độ cao lúc khử trùng Kim cấy vòng dùng để cấy lướt mặt thạch Kim cấy thẳng dùng để cấy đâm sâu vào thạch (cấy vi khuẩn kỵ khí) hay vào thạch mềm (xem di động) hay dùng để ly trích vi khuẩn khuẩn lạc mọc gần Kim cấy dẹp kim cấy có móc hình thước thợ để cấy nấm 4.3 Phƣơng pháp gieo cấy vi khuẩn Gieo cấy vi khuẩn từ nốt rễ họ đậu Phòng cấy tủ cấy phải vơ trùng có trang bị hệ thống lọc khơng khí đèn cực tím để bảo đảm vơ trùng 21 - Thu nốt rễ từ đậu nành đậu nành hoang, rửa đất, chọn nốt rễ gần cổ rễ (rễ chính) nốt to, chắc, mang phịng thí nghiệm, chưa sử dụng cho nốt rễ vào bọc nilon cột chặt trữ tủ lạnh (ngăn đá) - Xử lý nốt rễ: Cho nốt rễ (đã rửa đất) vào cốc sứ, thêm cồn 70oC cho ngập nốt rễ ngâm phút, rửa lại nước cất + Cho oxy già 3% vào cốc (ngập nốt rễ) để yên phút, rửa lại nước cất (3 lần) + Dùng kẹp khử trùng gấp nốt rễ để lên giấy thấm - Các thao tác cấy lên đĩa petri: + Đĩa petri chứa môi trường KIA TSA, dùng bút lông dầu đánh dấu (dưới đáy đĩa petri) điểm định cấy vi khuẩn + Sử dụng kim cấy đầu nhọn khử trùng qua lửa đèn cồn, đâm thẳng vào nốt rễ (nơi có vi khuẩn phát triển mạnh) + Mở nắp đĩa petri, đưa kim cấy vào mặt agar đâm thủng mặt thạch theo điểm đánh dấu, đậy nắp đĩa petri lại, hơ kim cấy lên lửa đèn cồn trước để kim cấy lên giá + Lật ngược đĩa petri cấy, ghi tên vi khuẩn cấy, ngày cấy, tên người cấy cho vào tủ ủ 30-34oC/24 Theo dõi phát triển vi khuẩn 4.4 Phƣơng pháp cấy phân lập vi khuẩn Cấy phân lập (tách ròng) phương pháp tách rời vi khuẩn từ hổn hợp dựa nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy Trong thủ thuật này, ta cần làm cho vi khuẩn tách rời tế bào chúng phát triển lên thành khuẩn lạc độc lập (thuần khiết) phục vụ cho việc nghiên cứu chúng, xác định vi khuẩn cộng sinh, vi khuẩn tạp nhiễm… Tùy theo nhóm vi sinh vật ta có nhiều phương pháp phân lập, phân lập que cấy vòng que trang… 4.4.1 Nguyên tắc Phương pháp phân lập dựa nguyên tắc tế bào vi sinh vật sau thời gian nuôi cấy (24 giờ) môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp phát triển thành quần thể vi sinh vật đồng nhất, khiết Khi phát triển riêng biệt môi trường thạch tế bào vi sinh vật tạo thành nhóm vi sinh vật gọi 22 khuẩn lạc Như khuẩn lạc tính tế bào vi sinh vật Khuẩn lạc thường có kích thước từ 0,5x 4-5mm nhìn thấy mắt thường Trong muốn thấy tế bào vi sinh vật phải dùng kính hiển vi Các tế bào vi sinh vật tách rời nhau, khuẩn lạc tạo nên riêng biệt, rõ nét, giúp cho việc chọn lựa dòng dễ dàng 4.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nấm men Hai phương pháp phân lập vi khuẩn nấm men que cấy vòng thường dùng: Cách 1: Dùng kim cấy mềm lấy vi sinh vật từ khuẩn lạc - Trải vi sinh vật (đường 1) - Hơ lửa kim cấy cho vi sinh vật kim cấy chết bớt - Vẽ đường cắt ngang đường - Hơ lửa kim cấy tiếp tục vẽ đường - Vi sinh vật kéo rời rạc qua đường cấy, cuối đường vài tế bào rời phát triển thành khuẩn lạc độc lập Cách Đường Đường Đường Cách 23 4.5 Cấy truyền Vi sinh vật phân lập có số lượng ít, khơng đủ cho nghiên cứu định danh, xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa, tính chất gây bệnh chúng Vì cần phải nuôi cấy để làm gia tăng số lượng chúng Mặt khác, vi sinh vật sau định danh thường giữ giống môi trường nhân tạo Các mơi trường nhân tạo có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật, vi sinh vật giữ giống mơi trường hệ kín (vi sinh vật khơng cung cấp dinh dưỡng suốt thời gian giữ giống), sau thời gian giữ giống, chất dinh dưỡng môi trường nghèo Hơn sản phẩm trình trao đổi chất vi sinh vật tích tụ ngày nhiều mơi trường Tất yếu tố làm ức chế, kìm hãm, giết chết vi sinh vật làm thay đổi đặc tính sinh lý - sinh hóa, độc lực vi sinh vật nuôi cấy lâu ngày môi trường nhân tạo Điều gây ảnh hưởng lớn đến việc nghiên cứu chúng Để khắc phục tình trạng người ta phải cấy truyền vi sinh vật 4.5.1 Mục đích việc cấy truyền - Nhằm gia tăng số lượng vi sinh vật để thực việc nghiên cứu chúng sau phân lập - Tái sinh chủng vi sinh vật sau thời gian nuôi cấy bảo quản chúng môi trường nhân tạo (phục hồi số lượng, đặc tính sinh lý - sinh hóa, độc lực… vi sinh vật) 4.5.2 Cấy truyền vi sinh vật Có thể cấy truyền vi sinh vật môi trường lỏng hay mơi trường thạch nghiêng, tùy theo tình trạng sinh lý vi sinh vật mục đích nghiên cứu Ghi rõ ký hiệu loại vi sinh vật cấy truyền, ngày, tháng cấy ống nghiệm Dùng kim cấy mềm lấy vi khuẩn hay nấm men chuyển sang môi trường với thao tác sau: Cấy truyền từ môi trƣờng đặc sang môi trƣờng đặc a Trên đĩa petri: Từ môi trường thạch đĩa, chọn khuẩn lạc riêng biệt, quan sát kỹ bề mặt, rìa, màu sắc, kích thước…ghi lại sổ theo dõi, đánh dấu khuẩn lạc (đánh dấu 24 mặt đáy đĩa petri) môi trường thạch nghiêng, dùng que cấy vịng vơ trùng lấy vi khuẩn cấy sang ống môi trường chuẩn bị sẵn Đối với vi khuẩn cấy theo đường zigzag, với vi nấm cấy dọc thành hàng cấy điểm Đặt úp đĩa petri thứ (ghi ký hiệu chủng cấy, ngày cấy) ủ 30-37oC/24 b Ống nghiệm: - Tay phải cầm kim cấy (bằng ngón cái, trỏ giữa), tay trái cầm ống nghiệm (phần đáy ống nghiệm nằm lòng bàn tay giữ chặt ngón tay cái, đầu ống nghiệm vạt theo hình chữ V với thân ống nghiệm nằm ngón tay trỏ + tay + ngón áp út) - Mở lỏng nắp ống nghiệm, hơ nóng kim cấy gần đến cán, dùng kẻ ngón tay + ngón áp út ngón út + lịng bàn tay phải để kẹp nắp ống nghiệm - Hơ lửa miệng ống nghiệm đèn cồn, đưa kim cấy vào, cấy theo đường zigzag cấy thẳng (hình 3), cấy xong hơ miệng ống nghiệm đóng nắp lại Gieo cấy từ môi trƣờng đặc sang môi trƣờng lỏng: Kỹ thuật thường sử dụng trường hợp vi sinh vật giữ lâu mơi trường nhân tạo, số lượng chúng khơng cịn nhiều, vi sinh vật 25 5.2.2 Vật liệu - Ống nghiệm chứa mẫu vi khuẩn (lactobacillus, Rhizobium, bacillus subtilis) nuôi cấy 24 37oC - Bông thấm nước cắt nhỏ, giấy lọc cắt miếng nhỏ 5.2.3 Hóa chất - Nước cất tiệt trùng trùng - Dung dịch tẩy màu (Ethanol + acetone) - Phẩm nhuộm: blue methylen, crystal violet, dung dịch Iod, Ethanol 95 oC, Fuchsin hay Safranin 5.3 Điều chế phẩm nhuộm a Phẩm nhuộm đơn - Blue methylen (a) 0,3g - Ethanol (95o) (b) 30ml - Nước cất 100ml Cách điều chế: - Hòa tan (a) (b) thêm vào hổn hợp 100ml nước cất - Dung dịch phẩm nhuộm pha chế xong trử chai có nắp thủy tinh b phẩm nhuộm Gram Crystal violet Dung dịch 1: - Crystal violet (85%) - Ethanol (95o) 20g 100ml Dung dịch 2: - Ammonium oxalate - Nước cất 1g 100ml Cách điều chế: - Pha dung dịch (1) nước cất với tỷ lệ 1:10 ta có hổn hợp (c) - Pha dung dịch (2) 29 - Trộn dung dịch (2) với (1) theo tỷ lệ 4:1 - Trữ dung dịch phẩm nhuộm lọ có nắp thủy tinh Dung dịch Iod - Iod (dạng tinh thể) 1g - Potassium iodin 2g - Sodium bicarbonat (5%) 60ml - Nước cất 245 ml Cách điều chế: - Hòa tan Iod potassium iodin 5ml nước cất - Thêm vào hổn hợp vừa pha xong 240ml nước cất 60ml sodium bicarbonat - Hòa tan thật hóa chất trữ lọ thủy tinh có màu nâu Dung dịch rƣợu để tẩy màu crystal violet - Ethanol (95o) 250ml - Aceton 250ml Cách điều chế: Lắc hóa chất trữ lọ thủy tinh Dung dịch safranin - Safranin 2,5g - Ethanol (95o) 100ml Cách điều chế: - Hịa tan hóa chất pha với nước cất tỉ lệ 1:10 - Trử dung dịch pha xong chai có nắp thủy tinh * Lƣu ý: thay dung dịch safranin dung dịch fuchsin sau: - Fuchsin - Ethanol (95o) 1g 100ml 30 - Dung dịch phenol 5% 100ml Cách điều chế: Lắc trộn hóa chất trử lọ thủy tinh 5.4 Mục đích việc nhuộm vi khuẩn - Phân biệt vi khuẩn dựa tính chất bắt màu chúng nhằm phục vụ cho việc phân loại điều trị - Nghiên cứu hình thái, cấu tạo đặc biệt vi khuẩn (giáp mô, bào tử) để dùng phân loại chúng - Bảo tồn tiêu vi khuẩn để nghiên cứu, chụp hình 5.5 Phƣơng pháp nhuộm 5.5.1 Chuẩn bị mẫu vật a Làm vết bơi - Làm lame kính: lame kính trước sử dụng phải lau chùi bằn g cồn lau lại khô - Đánh dấu vị trí vết bơi: vết bơi mỏng, thường sau nhuộm xong khó nhận vị trí vết bơi Do trước làm vết bơi cần phải đánh dấu vị trí mà bơi lame Dùng bút lơng khoanh vịng vừa phải mặt lame kính, vết bơi làm mặt bên lame, vị trí đánh dấu - Ghi ký hiệu cho tiêu bản: để tránh nhầm lẫn kết xét nghiệm vi khuẩn mẫu khác nhau, gây nên hậu nghiêm trọng, làm tiêu nhuộm phải ghi ký hiệu tương ứng cho mẫu xét nghiệm Ký hiệu ghi phần đầu lame kính, mặt có vết bơi - Từ mơi trường lỏng: dùng que cấy vịng vơ trùng, thao tác vơ trùng lấy dịch vi khuẩn cho lên lame kính chỗ khoanh làm dấu (mặt trái với mặt làm dấu) dàn giọt dịch vi khuẩn Chú ý dàn mỏng tốt - Từ môi trường đặc: nhỏ giọt nước cất lên lame kính vị trí mặt trái lame nơi khoanh làm dấu Dùng que cấy vịng vơ trùng lấy vi khuẩn mọc bề mặt môi trường chấm vào giọt nước vừa nhỏ lame dàn chúng khu vực đánh dấu Chú ý dàn mỏng tốt 31 b Cố định tiêu - Mục đích việc cố định tiêu là: + Giết chết vi khuẩn để đảm bảo an tồn, khơng lây lan + Gắn chặt vi khuẩn lame kính, khơng bị rửa trơi q trình tẩy rửa + Làm cho bắt màu vi khuẩn trở nên tốt (vi khuẩn chết bắt màu tốt vi khuẩn sống) - Các phương pháp cố định, sử dụng cách: + Cố định nhiệt độ (phương pháp lý học): hơ nhanh lửa đèn cồn 3-4 lần (lam kính cách lửa khoảng 10cm) + Cố định hóa chất (cồn, aceton…): nhỏ vài giọt cồn lên vết bôi, để khô 5.5.2 Nhuộm đơn Là phương pháp nhuộm tiêu đơn giản vi khuẩn học Mục đích nhuộm đơn làm cho mẫu vật ăn màu loại phẩm nhuộm để dễ quan sát kính hiển vi Phẩm nhuộm xanh methylen hay Fuchsin Kết phương pháp trả lời cho ta biết mẫu thí nghiệm có vi khuẩn hay khơng, với hình dạng cách xếp vi khuẩn Cách nhuộm: - Nhỏ 1-2 giọt phẩm nhuộm lên mẫu vật cố định phút - Rửa vòi nước (nhẹ) cho trôi hết phẩm nhuộm thừa - Dùng giấy thấm chậm hơ lửa đèn cồn cho khô, nhỏ lên vết nhuộm giọt dầu cèdre - Quan sát kính hiển vi với vật kính nhúng dầu: quan sát màu sắc, cách xếp loại vi khuẩn 5.5.3 Nhuộm Gram (nhuộm kép) Mục đích giúp ta xác định mẫu vật nghiên cứu Gram dương (G+) hay Gram âm (G-) Để công tác nhuộm cho kết xác ta phải có mẫu vi sinh vật giai đoạn mẻ cấy phát triển mạnh (giai đoạn log) sử dụng mẫu vi khuẩn già kết bị sai lệnh số tế bào vi khuẩn già đổi từ G + sang G- 32 Cách nhuộm: - Nhỏ Crystal violet lên miếng giấy lọc cho đủ thấm xuống vết bơi, để 1-2 phút, Rửa nhẹ vịi nước 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước - Nhỏ dung dịch Iod (lugol) lên vết bôi vừa nhuộm để khoảng 1’, Rửa nhẹ vòi nước, chậm bớt nước - Rửa cồn 96 o + aceton thật nhanh, khoảng 30 giây để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, giọt cồn aceton khơng cịn màu tím Rửa nhẹ vịi nước, chậm nhẹ - Nhỏ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm loãng safranin lên vết bôi, để khoảng phút - Rửa nhẹ vịi nước - Thấm khơ tiêu để quan sát kính hiển vi, vật kính nhúng dầu Kết quả: - Tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: G+ - Tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: G- 5.6 Thực hành - Sinh viên thực mẫu nhuộm đơn mẫu nhuộm kép vi khuẩn cấy CÂU HỎI Mơ tả qui trình nhuộm Gram nêu kết mẫu nhuộm Quan sát vẽ lại vi khuẩn nhuộm với màu sắc đặc điểm riêng chúng 33 Hình Sơ đồ phƣơng pháp nhuộm Gram 34 Chương PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯƠNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng việc đánh giá chất lượng vi sinh chế phẩm sinh học, lương thực, thực phẩm (thức ăn, nước uống…), đồng thời đánh giá điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối… Việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật thường thực theo phương pháp chủ yếu đếm trực tiếp đếm gián tiếp 6.1 Mục đích - Trang bị cho sinh viên kỹ thực hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật dung dịch môi trường nuôi cấy - Yêu cầu sinh viên phải hiểu ý nghĩa nguyên tắc việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật - Sinh viên phải nắm vững qui trình, cách thức tiến hành thao tác đếm số lượng tế bào vi sinh vật từ loại mẫu khác 6.2 Vật liệu thiết bị 6.2.1 Thiết bị dụng cụ thủy tinh - kính hiển vi - kim cấy đèn cồn - Buồng đếm hồng cầu Thomas Neubaur - kính đậy vật - micropipette đầu col 1ml vô trùng, đầu col 0, 1-0,2ml - vial khử trùng - ống nghiệm 10ml, đĩa petri khử trùng 6.2.2 Vật liệu hóa chất - Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…) - Môi trường dinh dưỡng (TSA, NA, PCA…) 35 - chai chứa 1lít nước cất khử trùng 6.3 Đếm số tế bào vi sinh vật 6.3.1 Đếm trực tiếp Số tế bào vi sinh vật xác định cách đếm trực tiếp kính hiển vi Phương pháp đếm cho kết nhanh Nhưng phân biệt tế bào sống với tế bào chết, kết đếm trực tiếp thường cao phương pháp đếm sống (đếm gián tiếp) Phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm nhanh, đơn giản, rẻ tiền không áp dụng trường hợp cần xác định số lượng tế bào cịn sống có mẫu (kiểm định chất lượng sản phẩm…) Phƣơng pháp dùng buồng đếm hồng cầu Cấu tạo buồng đếm: buồng hình vng nhỏ, có kích thước cạnh đáy 1mm chiều cao 0,1mm, khắc phiến kính dày, suốt Trên phiến kính dày khắc thêm rãnh nhỏ để dịch vi sinh vật cần đếm theo vào buồng đếm Buồng đếm tùy theo loại, chia thành 16 25 lớn hình vng Nếu loại có 16 lớn lớn chia thành 25 hình vng nhỏ Nếu loại 25 ô lớn ô lớn lại chia thành 16 hình vng nhỏ, dù loại buồng đếm (16 25 ô lớn) có số nhỏ 400 nhỏ (16 x 25 = 25 x 16) Do diện tích nhỏ 1/400mm2 thể tích chúng 1/4.000 mm3 Hình Buồng đếm hồng cầu 36 Cách tiến hành - Dùng nước khử trùng pha loãng mẫu vật Độ pha loãng để đếm, số tế bào ô vuông không 15 tế bào - Chuẩn bị buồng đếm: dùng giấy mềm thấm cồn-aceton lau buồng đếm Đặt buồng đếm lên bàn kính di chuyển buồng đếm vào vị trí quan sát Dùng vật kính x10, điều chỉnh để nhìn rõ buồng đếm, sau chuyển sang vật kính x40 chỉnh rõ buồng đếm lại lần Đặt miếng lamelle lên buồng đếm Dùng micropipette lấy nhỏ dịch vi khuẩn cần đếm vào rãnh nhỏ phiến kính cho khơng có bọt khí, mép miếng lamelle Để yên 3-5 phút để dịch đếm tự dàn lên khắp buồng đếm Dùng núm vi cấp điều chỉnh cho rõ ô nhỏ tiến hành đếm (cũng dùng vật kính x10 để đếm kích thước tế bào đủ lớn để nhìn thấy) - Cách đếm: Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có lớn, loại buồng đếm Chọn lớn góc Như vậy, loại buồng đếm 16 lớn số lượng ô nhỏ đếm 125 ô Nếu loại buồng đếm 25 lớn số nhỏ đếm có 80 Các nhỏ lớn đếm theo kiểu hình chữ chi Đối với ô nhỏ, đếm tất số tế bào vng, kể tế bào có phân nửa nằm ô đếm Cộng tất số lượng vi sinh vật đếm ô nhỏ (80 125 nhỏ) để tính số lượng vi sinh vật trung bình có nhỏ 37 Ô lớn phải đếm Chiều đếm tế bào vi sinh vật : ô nhỏ số đếm tế bào, ô nhỏ đếm tế bào, nhỏ có tế bào, ô nhỏ đếm tế bào … - Cách tính số lượng vsv có 1ml dịch mẫu theo công thức sau: Số tế bào/1ml = a x 4000 x1000 x h Trong đó: * a: số vi sinh vật trung bình có nhỏ = n ai: số vsv đếm ô nhỏ n: số ô nhỏ đếm (80 buồng đếm có 25 lớn 125 buồng đếm có 16 lớn * h = hệ số pha loãng = 38 độ pha loãng * 4.000= hệ số chuyển thành mm3 = Thể tích ô nhỏ = 1/4.000 mm3 * 1.000 = hệ số chuyển mm3 thành ml (1ml =1.000mm3) Hình Phƣơng pháp dùng hộp đếm 6.3.2 Phương pháp đếm sống (đếm gián tiếp) Đếm gián tiếp người ta khơng nhìn thấy không đếm trực tiếp tế bào vi sinh vật Số lượng vi sinh vật mẫu xác định cách gián tiếp thông qua sinh trưởng phát triển chúng môi trường dùng để nuôi cấy chúng 39 - Nguyên tắc: phương pháp đếm gián tiếp số lượng tế bào vsv môi trường thạch đĩa dựa việc đếm số lượng khuẩn lạc vsv mọc môi trường sau thời gian nuôi cấy vsv cần đếm 37oC/24 Nguyên tắc phương pháp khuẩn lạc tính tế bào vsv có mẫu ban đầu - Chuẩn bị dịch mẫu: Pha loãng dịch mẫu với nước cất tiệt trùng nước muối sinh lý, pha độ loãng liên tiếp 1/10 1/100 1/1.000 dung dịch chứa vi sinh vật cách chuyển 1ml chai sang chai chứa 9ml nước cất khử trùng (hình 6) Sau lần chuyển phải lắc trước chuyển lần 2, vi sinh vật phân phối chai Tiếp tực pha loãng có khoảng 100-300 tế bào 1ml - Lắc 25 lần chai pha loãng cuối cùng, dùng ống hút vô trùng hút 1ml chuyển vào đĩa petri khử trùng, độ pha loãng cần 2-3 đĩa Ghi tên mẫu, ngày lấy mẫu lên mặt đáy đĩa Petri để tránh nhầm lẫn mở đếm - Dùng thủ thuật vô trùng cho khoảng 20ml môi trường agar lỏng nhiệt độ khoảng 45-50oC vào đĩa petri (đường kính 8cm) Trộn môi trường với mẫu đếm cách xoay nhẹ đĩa petri theo hình số 8, xoay nhẹ để agar khơng văng lên thành đĩa petri - Để môi trường đặc đem vào cất tủ ủ Quan sát kết sau 24- 48 ủ 37 C o 40 1ml 1ml 1/100 1/102 1ml 1/103 Hình Phƣơng pháp đếm sống Tính kết theo cơng thức: N(cfu/ml (g)) = C/(n1 + 0,1 n2) x d N: tổng số tế bào/ml (g) Tổng số khuẩn lạc đếm n1: số đĩa đếm nồng độ thứ n2: số đĩa đếm nồng độ thứ hai d: nồng độ pha loãng thứ 41 1/104 * Chú ý: đếm khuẩn lạc đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25-300 khuẩn lạc/đĩa 6.4 Thực hành - Đếm trực tiếp vi khuẩn buồng đếm hồng cầu tính kết - Đếm vi khuẩn phương pháp đếm sống (gián tiếp) môi trường ni cấy tính kết CÂU HỎI Tại mật số vi khuẩn phương pháp đếm trực tiếp cao phương pháp đếm gián tiếp? Trình bày công dụng buồng đếm hồng cầu.? Đếm gián tiếp thường ứng dụng để đếm mẫu thực tế? Ưu nhược điểm phương pháp đếm gián tiếp? 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2002 Bài giảng thực tập vi sinh vật đại cương NXB Đại học Cần Thơ Nguyễn Thanh Bảo, 2005 Bài giảng thực tập vi sinh miễm dịch Trường Đai học y dược thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn ngọc hải Nguyễn Thị Kim Loan, 2007 Giáo trình thực tập vi sinh vật, Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Trần Linh Thước, 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục 43 ... đầu col 0, 1-0 ,2ml - vial khử trùng - ống nghiệm 10ml, đĩa petri khử trùng 6 .2. 2 Vật liệu hóa chất - Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…) - Môi trường dinh... mềm lấy vi sinh vật từ khuẩn lạc - Trải vi sinh vật (đường 1) - Hơ lửa kim cấy cho vi sinh vật kim cấy chết bớt - Vẽ đường cắt ngang đường - Hơ lửa kim cấy tiếp tục vẽ đường - Vi sinh vật kéo... chúng môi trường nhân tạo (phục hồi số lượng, đặc tính sinh lý - sinh hóa, độc lực… vi sinh vật) 4.5 .2 Cấy truyền vi sinh vật Có thể cấy truyền vi sinh vật môi trường lỏng hay môi trường thạch