Đang tải... (xem toàn văn)
Tiếp nội dung phần 1, Giáo trình Vi sinh đại cương phần 2 cung cấp cho người học những kiến thức như: Virus học; Di truyền học của vi khuẩn; Sự phân bố của vi sinh vật trong tự nhiên;...Mời các bạn cùng tham khảo!
CHƯƠNG ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT MH11-04 Giới thiệu: Vi sinh vật hoạt động môi trường tự nhiên hay thể động vật chúng phải chịu ảnh hưởng yếu tố đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật Mục tiêu: - Kiến thức: Trình bày đặc tính dinh dưỡng, phát triển yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật - Kỹ năng: Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng vi sinh vật - Năng lực tự chủ trách nhiệm: Có ý thức lợi ích việc học tập, từ có thái độ học tập đắn; ý thức tự học hỏi nâng cao trình độ Yếu tố vật lý 1.1 Độ ẩm Mọi hoạt động sống vi sinh vật liên quan đến nước Trong tế bào vi sinh vật, nước chiếm tỷ lệ cao (nấm men 73-82%, nấm mốc 84- 90%, vi khuẩn 75-85%) Vì thiếu nước tế bào bị chết tượng loại nước khỏi tế bào Sự đề kháng vi sinh vật với trạng thái khô phụ thuộc vào: - Nguồn gốc vi sinh vật: Vi sinh vật khơng khí chịu khơ tốt vi sinh vật sống nước - Loại vi sinh vật: Xạ khuẩn chịu khô tốt vi khuẩn, vi khuẩn chịu khô tốt nấm mốc,… - Trạng thái tế bào: Tế bào già, tế bào có nha bào chịu khô tốt tế bào non trạng thái khô hầu hết vi sinh vật bị ức chế, ngừng trình sinh trưởng phát triển, có độ ẩm thích hợp chúng lại hoạt động trở lại Người ta ứng dụng đặc tính bảo quản nông sản, thực phẩm nguyên vật liệu khác cách phơi khơ, sấy khơ Trong phịng bệnh cho gia súc, điều quan trọng giữ cho chuồng trại ln khơ ráo, thống mát để hạn chế phát triển vi sinh vật gây bệnh Ẩm độ > 70%, đề kháng với trạng thái khơ nhóm xạ khuẩn > vi khuẩn > nấm mốc 49 Nhóm vi sinh vật Ẩm độ tối thiểu Phần lớn vk gram (-) 0,97 Phần lớn vk gram (+) 0,90 Phần lớn nấm 0,88 Phần lớn nấm sợi 0,80 Vi khuẩn ưa mặn 0,75 Một số nắm sợi khác 0,60 1.2 Nhiệt độ Vi sinh vật cần khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt động sống Phạm vi nhiệt độ để vi sinh vật tồn từ 00 - 900 C Các nhóm vi sinh vật khác nhau, có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng khác xác định phạm vi từ nhiệt độ tối thiểu tới nhiệt độ tối đa Phạm vi gọi giới hạn nhiệt độ sinh trưởng Ví dụ: vi khuẩn nhiệt thán sinh trưởng khoảng từ 12 – 420C, có nhiệt độ tối thích, vi sinh vật sinh trưởng tối đa Ví dụ vi khuẩn nhiệt thán thích hợp với nhiệt độ 370C Vi khuẩn gram dương chịu nhiệt độ lạnh tốt so với vi khuẩn gram âm Căn vào giới hạn nhiệt độ sinh trưởng chia vi sinh vật làm nhóm: - Vi sinh vật ưa lạnh: sinh trưởng nhiệt độ 00C, 150 – 200C gồm vi sinh vật sống ao hồ, sơng ngịi, hố sâu, đáy biển phòng lạnh bảo quản thực phẩm - Vi sinh vật ưa ấm: 200 – 250C, 300 – 370C, 400 – 450C: chiếm đại đa số vi sinh vật nấm mốc, nấm men, vi sinh vật hoại sinh vi sinh vật ký sinh, vi sinh vật gây bệnh - Vi sinh vật ưa nhiệt: 450 -500C, 500 – 600 C, 600 – 800C: xạ khuẩn, nấm mốc, vi khuẩn có nha bào, gặp bãi rác, đóng phân, suối nước nóng núi lửa 50 - Vi sinh vật chịu nhiệt: sinh trưởng nhiệt độ sơi nước Nếu nhiệt độ nằm ngồi phạm vi nhiệt độ sinh trưởng ảnh hưởng đến vi sinh vật 1.3 Áp suất thẩm thấu Sự chênh lệch nồng độ chất hai bên màng sinh chất gây nên áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu áp lực thủy tĩnh ảnh hưởng đến phát triển tế bào vi khuẩn Vì vậy, đưa vi sinh vật vào môi trường nhiều đường, muối, tức mơi trường ưu trương nước tế bào vi sinh vật bị rút ngoài, gây co ngun sinh, chúng khơng phân chia Môi trường ưu trương: dung dịch đường cao (50 - 80%), muối cao (10 -15%) tế bào khả hút nước chất hòa tan, tế bào chịu trạng thái khô sinh lý, bị co nguyên sinh chất chết kéo dài (áp dụng ngâm rau nước) Môi trường nhược trương nước xâm nhập vào tế bào, áp lực bên tế bào tăng lên, tế bào bị trương nước gây chết kéo dài Trong thực tế người ta áp dụng tượng để bảo quản cá muối, muối dưa, bảo quản trái Vì - Nhóm vi sinh vật ưa mặn phát triển mơi trường có nhiều muối (NCl >0,2M): Halococcus morrhueae, Staphylococcus,… - Nhóm vi sinh vật khơng ưa mặn ( 9,5 Ví dụ: Vibrio cholera pH thích ứng =9 -Vi sinh vật ưa axit nhẹ pH từ – 6.5 -Vi sinh vật ưa axit pH từ – -Vi sinh vật chịu axit pH từ – Ứng dụng: điều hồ độ pH mơi trường ni cấy vi sinh vật 2.2 Oxy Oxy chất có vai trò quan trọng sinh trưởng vi sinh vật oxy cần cho số nhóm vi sinh vật lại gây độc cho nhóm khác Xét sở thích ứng với oxy, vi sinh vật chia làm nhóm: - Vi sinh vật hiếu khí: cần oxy trình sinh trưởng - Vi sinh vật kỵ khí: khơng cần oxy q trình sống, chí oxy cịn gây độc cho chúng Bởi trình khai thác lượng từ chất (thức ăn) có mặt O2, sản phẩm cuối cho H2O2 Đây chất oxy hố mạnh giết chết vi sinh vật Ở vi khuẩn hiếu khí, hệ enzyme chúng có enzyme catalaza peroxydaza phân huỷ H2O2, vi khuẩn yếm khí khơng có enzyme nên có oxy, H2O2 tạo thành giết chết chúng -Vi sinh vật tuỳ nghi: sinh trưởng điều kiện đủ oxy, thiếu khơng có oxy Trong điều kiện khơng có oxy, chúng khai thác lượng phương thức lên men 2.3 Các chất diệt khuẩn (sát trùng) Các chất khử trùng tiêu độc gồm tất chất hoá học gây hại cho vi sinh vật gây hại cho động vật Chúng bao gồm nhiều chất, từ nhiều nguồn gốc có thành phần hoạt chất chế tác dụng khác Căn vào mức độ tác dụng chúng với vi sinh vật để phân biệt tên gọi chất sau: 53 - Chất sát trùng hay chất tiêu độc: Chỉ chất có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật không giết nha bào cảu chúng - Chất diệt khuẩn: Là chất tiêu diệt tồn vi sinh vật, kể nha bào - Chất ức chế: Là chất làm ngừng trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật, tế bào vi sinh vật không bị diệt mà trạng thái tiềm tàng - Chất kháng khuẩn: Là chất làm ngừng trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt Một chất hố học chất sát trùng, ức chế, diệt khuẩn tuỳ thuộc vào nồng độ, thời gian tác dụng, loại hình vi sinh vật bị tác động yếu tố khác Ảnh hưởng yếu tố sinh học Năm 1928 A Fleming phát thấy ức chế nấm penicilium Staphylococcus aureus chúng mọc cạnh Ông nghiên cứu kỹ nấm chất tiết nó, phát kháng sinh penicilin vào 1940 Các nhà khoa học tách chiết penicillin dùng chữa bệnh vi trùng gây ra, ngày có nhiều kháng sinh chiết xuất để chữa bệnh 3.1 Chất kháng sinh Chất kháng sinh hợp chất hoá học chủ yếu vi sinh vật sinh trình sống, nồng độ thấp có khả ức chế tiêu diệt vi sinh vật cách chọn lọc Mỗi loại kháng sinh tác động lên vi khuẩn nhóm vi khuẩn định Cơ chế tác dụng: kháng sinh tác động lên vi khuẩn hướng chủ yếu: + Làm ngừng trình tổng hợp màng tế bào phá huỷ tế bào, gây rối loạn chức màng nguyên sinh chất, đặc biệt chức thẩm thấu chọn lọc làm ngừng trình trao đổi chất thuộc hướng tác động có: penicillin, bacitraxin, vancomycin + Làm ngừng trình tổng hợp protein tế bào vi sinh vật xúc tiến việc tổng hợp lên protein quan hệ đến tế bào Thuộc hướng tác động có: streptomycin, kanamycin, tetracycline… + Ức chế tổng hợp axit nucleic, ngăn cản chép AND, ngăn cản tổng hợp ARN polymetaza Các kháng sinh gồm có: actinomycin, novobioxin… 3.1.1 Kháng sinh từ vi sinh vật 54 - Kháng sinh từ vi khuẩn: kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn khơng nhiều: Vi khuẩn Kháng sinh Phổ tác dụng Bacillus licheniformis Bacitdraxin Gram + Ba polymixa Polimycin Gram- Gram+ Bac brevis Tirotricin Tụ cầu, liên cầu + Baxitraxin: thu từ Bacillus licheniformi Là chất màu trắng tan nước, rượu Có tác dụng mạnh với vi khuẩn gram dương Dùng chữa bệnh nhiễm trùng, viêm dùng chăn nuôi, bảo quản chế biến thực phẩm + Polimixin: thu từ Bac Polymixa Là chất kết tinh màu trắng tan nước, rượu Có tác dụng mạnh vi khuẩn gram dương gram âm Dùng chữa bệnh nung mũ, bệnh da - Kháng sinh từ xạ khuẩn: kháng sinh từ xạ khuẩn chiếm số lượng lớn có nhiều kháng sinh quan trọng: Xạ khuẩn Kháng sinh Phổ tác dụng Streptomyces griceus Strepstomycin (A, B, C) Gram âm Actinomyces fradiae Neomycin Gram+ Gram- Act kanamyceticus Kanamycin Gram - + Streptomycin: thu từ streptomyces griceus (Actinomyces streptomyxin): chất kiềm tan nước, khó tan dung môi hữu Chống vi khuẩn gram âm mạnh (Bacilus, Brucella, Mycobacterium, Pasteurella, Salmonella) Ít độc dùng kéo dài ảnh hưởng đến thần kinh thính giác + Neomycin: thu từ Actinomyces fradiae hay số khác, chất kiềm khơng màu, muối tan nước không tan dung môi hữu Chống vi khuẩn gram dương âm, đặc biệt với vi khuẩn quen với kháng sinh khác Dùng để chữa viêm, nhiễm trùng, độc gây dị ứng dùng lâu + Kanamycin: thu từ Actinomyces kanamyceticus Dùng trị đường ruột vi khuẩn gram âm, bệnh tụ cầu, bệnh lao + Tetraxilin: nhóm bao gồm clotetraxin, oxytetraxilin, tetraxilin - Kháng sinh từ nấm mốc: kháng sinh từ nấm mốc có số lượng lớn, độc lực cao nên dùng thực tiễn, số loài: 55 Xạ khuẩn Penixillium Chrysogenum Kháng sinh Penecilin, G, F, K, X,V, O Phổ tác dụng Gram + + Penicilin: thu từ nấm mốc Penicilium chrysogenum Có hoạt tính mạnh vi khuẩn gram dương Thường sử dụng để chữa bệnh nhiễm trùng, vết thương có mủ Ít độc dễ gây dị ứng nên dùng phải thử 3.1.2 Kháng sinh từ thực vật: có thân, lá, nhiều loại thực vật tự nhiên có chứa chất có khả gây ức chế tiêu diệt vi sinh vật gọi chung Phytonxit – kháng sinh thực vật + Alixin: hoạt chất có tính kháng sinh tìm thấy tỏi Có tác dụng với nhiều vi sinh vật Staphylocooccus, Streptococcus, Salmonella, E.coli, Shigella Dùng chữa số bệnh nhiệt thán, bạch hầu, lao, cúm Còn thấy loại khác: Saponin (bồ kết): tiêu độc, chữa nhọt Ocubin (lá mã đề): trị viêm khí quản, đau mắt đỏ 3.1.3 Kháng sinh từ động vật: thể động vật cho chất kháng sinh như: + Lysozyme: có nước bọt, nước mắt, dịch niêm mạc, huyết có tác dụng làm dung giải vi khuẩn + Kháng thể: huyết hay sữa đầu động vật + Exitrin: chiết từ hồng cầu động vật, có tác dụng chống lại liên, tụ cầu khuẩn 3.1.4 Tính kháng thuốc vi sinh vật + Sau sử dụng rộng rãi loại kháng sinh thới gian dài, người ta phát ngày nhiều loại vi khuẩn có khả chống lại tác dụng trị liệu loại kháng sinh Hiện tượng gọi kháng thuốc vi sinh vật + Q trình hình thành tính kháng thuốc vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nồng độ chất chất kháng sinh Cách sử dụng thời gian tác động Cơ chế tác dụng kháng sinh 56 Đặc tính vi sinh vật 3.2 Kháng thể Kháng thể phân tử sản xuất tế bào lympho B, loại tế bào hệ thống miễn dịch thu Kháng thể hoạt động với tư cách cầu nối vi sinh vật gây bệnh với tế bào thực bào Từ có định nghĩa kháng thể: Kháng thể globulin máu động vật, có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh Kháng thể chủ yếu tìm thấy huyết động vật, huyết chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên gọi kháng huyết Kháng thể tìm thấy dịch thể khác thể, sữa Những kháng thể có sẵn sữa hay huyết tương người, động vật từ trước có tiếp xúc với kháng nguyên gọi kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu Kháng thể đặc hiệu kháng thể sinh kích thích kháng nguyên (vi sinh vật) kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên Khi kháng nguyên kháng thể tương ứng kết hợp với xẩy phản ứng ngưng kết 3.3 Các chất tiêu độc khử trùng Các chất khử trùng tiêu độc gồm tất chất hoá học gây hại cho vi sinh vật gây hại cho động vật Chúng bao gồm nhiều chất, từ nhiều nguồn gốc có thành phần hoạt chất chế tác dụng khác Căn vào mức độ tác dụng chúng với vi sinh vật để phân biệt tên gọi chất sau: - Chất sát trùng hay chất tiêu độc: chất có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật không giết nha bào chúng - Chất diệt khuẩn: chất tiêu diệt toàn vi sinh vật, kể nha bào - Chất ức chế: chất làm ngừng trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật, tế bào vi sinh vật không bị diệt mà trạng thái tiềm tàng - Chất kháng khuẩn: chất làm ngừng trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt Một chất hố học chất sát trùng, ức chế, diệt khuẩn tuỳ thuộc vào nồng độ, thời gian tác dụng, loại hình vi sinh vật bị tác động yếu tố khác 57 Tiêu độc khử trùng đặc biệt quan trọng nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học, bảo quản, chế biến, dự trữ thức ăn, y học, thú y học, phòng trừ dịch bệnh nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác Ý nghĩa tiêu độc, khử trùng - Tránh lây nhiễm, gây nhiễm vi sinh vật từ nơi sang nơi khác, từ vật sang vật khác, từ vật thể sang thể động vật - Đảm bảo độ xác thí nghiệm, khiết cơng tác vi sinh vật nuôi cấy, phân lập, giữ giống - Đảm bảo bảo quản lâu dài, môi trường dinh dưỡng, thuốc, thực phẩm dụng cụ tinh sảo khác Những nhân tố có quan hệ đến tiêu độc, khử trùng có nhiều, cần lưu ý đến mối quan hệ cường độ, nồng độ chất sử dụng, thời gian tác dụng đối tượng cần tiêu độc, khử trùng Phương pháp tiêu độc, khử trùng - Phương pháp giới: bao gồm quét dọn, lau chùi, rửa, cạo, nạo vét, - Phương pháp vật lý: dùng sức nóng khơ (hơ nóng, đốt, phơi, sấy, hấp khơ), sức nóng ướt (đun sơi, hấp ướt có áp lực), dùng tia xạ - Phương pháp hóa học: biện pháp hay sử dụng, mục đích làm đơng vón protein phá hủy protein vi sinh vật, háo chất thường dùng dạng: bột, khí, dung dịch - Phương pháp sinh vật học: phân, nước tiểu chất thải có nhiều vi sinh vật lên men, nên dùng phương pháp ủ kín chất làm cho nhiệt độ lên cao tới 75oC kéo dài nhiều ngày nên tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh - Tiệt trùng: tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật kể nha bào bất hoạt virus tách bỏ chúng hoàn toàn khỏi vật cần tiệt trùng Biện pháp - Khí nóng khơ: sử dụng tủ sấy 170 – 180o C – Áp dụng cho vật thủy tinh, kim loại, đồ gốm - Hơi nóng căng: sử dụng lò hấp ướt Áp dụng cho dụng cụ kim loại, đồ vải, cao su dung dịch lỏng - Tia gama - Lọc vơ trùng: chất lỏng chất khí khơng thể dùng nhiệt độ phải dùng lọc vơ trùng vacxin, huyết thanh, khơng khí, nước uống, 58 mang Bào tử thường nằm tế bào sinh dưỡng ba vị trí khác nhau: nằm tâm tế bào gọi bào tử kiểu Bacillus, nằm lệch tâm – kiểu Clostridium nằm cực tế bào gọi bào tử kiểu Plectidium Ở số giống vi khuẩn khác, bào tử tồn tế bào xung quanh tan rã Vật liệu dụng cụ: - Giống vi khuẩn Bacillus cereus môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng ủ – ngày đến tuần 30ºC - Thuốc nhuộm: cách + Lục malachite thuốc nhuộm safranin + Fuschin, HCl 0.5%, H2SO4 1%, xanh methylene (Loeffler) + Xanh methylene đỏ trung tính - Giá nhuộm phiến phết kính nhuộm - Cốc beesse bếp đun Cách tiến hành: a Với thuốc nhuộm lục malachite thuốc nhuộm safranin 1- Chuẩn bị vết bơi phiến kính hơ nóng nhẹ 2- Thêm nước vào cốc beesse đun sôi 3- Đặt giá nhuộm lên cốc beesse đặt phiến kính lên 4- Đặt nhẹ mẫu giấy thấm (nhỏ phần kính chút) lên phiến kính Mẫu giấy giúp giữ thuốc nhuộm lại phiến kính 5- Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite hơ nước vòng phút Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khơ phiến kính 6- Khử màu với nước 30 giây cách cho nước chảy lên phiến kính Các tế bào sinh dưỡng bị màu, bào tử giữ màu lại 7- Nhuộm lại với safranin 30 giây rửa lại với nước 30 giây Thấm khô cẩn thận 8- Quan sát kính hiển vi với vật kính đâu (x100) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu hồng Ghi lại kết 118 Lưu ý: Khi nhuộm Gram, bào tử khơng bị nhuộm nên tế bào trơng giống có lỗ bên Quy trình nhm bào tử theo phương pháp Schaeffer - Fulton b Với thuốc nhuộm Fuschin, HCl 0.5, H2SO4 1% xanh methylene 1- Làm vết bơi mọt phiến kính để khơ tự nhiên 2- Nhỏ vài giọt HCl 0.5% lên vết bơi, hơ nóng lửa đèn cồn cho bốc phút rửa với nước 3- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuschin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng bốc vịng phút 4- Rửa vết bôi nước 5- Tẩy màu dung dịch H2SO4 1% phút 6- Rửa vết bôi nước 7- Nhuộm vết bôi xanh methylene – 15 phút 8- Rửa lại với nước để khô tự nhiên 9- Quan sát kính hiển vi với vật kính dầu ( x100) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu xanh Ghi lại kết c Với thuốc nhuộm Xanh methylene đỏ trung tính: 1- Làm vết bơi phiến kính 2- Cố định tiêu lửa đèn cồn 119 3- Nhuộm xanh methylene phút có hơ nóng từ bên 4- Rửa vết bôi nước hết màu 5- Nhuộm với đỏ trung tính 0.5% phút 6- Rửa lại nước, để khô 7- Quan sát kính hiển vi với vật kính dầu ( x100 ) Bào tử có màu xanh cịn tế bào sinh dưỡng có màu đỏ Ghi lại kết Thực hành Sinh viên thực hành làm tiêu bản: - Giọt ép, giọt treo - Nhuộm gram vi khuẩn phịng thí nghiệm chuẩn bị - Nhuộm Kháng acid từ vaccine BCG - Nhuộm bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis (malachite thuốc nhuộm safranin) Báo cáo Sinh viên viết báo cáo cách tiến hành kết nhuộm 120 BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT Khái niệm Phân lập vi sinh vật q trình tách riêng lồi vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Đây khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật dạng khiết giống vi sinh vật tạo từ tế bào ban đầu Trong thiên nhiên vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác Muốn nghiên cứu hình thái, sinh lý, lý hố sử dụng vào thực tiễn lồi cần phải đưa chúng dạng khiết Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết Với hầu hết loại mẫu nghiên cứu, trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết - Kiểm tra độ tinh khiết khuẩn lạc Phân lập khiết vi sinh vật đơn bào 3.1 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật môi trường phân lập a Yêu cầu: Nếu mẫu ban đầu dạng rắn phải đưa dạng lỏng cách: - Nghiền mẫu - Hồ tan mẫu nước cất vơ trùng Sau thực mẫu dạng lỏng, tiếp tục pha loãng nồng độ cần thiết Cấy mẫu mơi trường đặc trưng Để có chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần kỹ thuật pha loãng nêu tất khuẩn lạc xuất môi trường đồng Mức độ khiết chủng kiểm tra sau: 121 - Việc tạo hộp ria từ khuẩn lạc đơn chủng tạo loại khuẩn lạc bề mặt mơi trường có hình thái giống với khuẩn lạc chủng ban đầu - Mỗi khuẩn lạc đơn chứa loại tế bào có hình thái giống quan sát kính hiển vi Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nguy bị nhiễm cách thực nghiêm túc yêu cầu thao tác vô trùng b Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T, kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật ria liên tục Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật hiếu khí thực sau: 1) Kỹ thuật hộp ria Khử trùng bề mặt bàn tay cồn 70º, chờ khô đốt đèn cồn Đĩa môi trường đổ bảo quản lạnh từ 4ºC – 8ºC, trước dùng đặt vào tủ ấm 37ºC khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô Thực bước sau: - Dùng bút ghi lên đáy hộp petri tên mẫu ( bệnh phẩm, thực phẩm,…), ngày cấy, người cấy - Ước lượng úp đĩa xuống dùng bút thước chia đĩa thành phần - Đốt que cấy lửa đèn cồn thao tác lấy mẫu ống nghiệm - Dùng ngón ngón ( bàn tay trái ) ấn vào tâm đĩa petri, ngón cịn lại xoay hơ mép nắp đĩa đèn cồn trước cấy - Cầm đĩa lọt vào lòng bàn tay trái, ngón ngón út tỳ vào nắp để đẩy nắp lên cho nắp đáy tạo góc khoảng 45º - Đưa đầu que cấy vào phết góc nhỏ, sát thành đĩa - Thực cấy ria chữ T ria bốn góc (xem hình) - Sau cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm nhiệt độ thời gian thích hợp - Xem kết minh họa bên Chú ý: 122 - Đốt que cấy, hơ miệng ống nghiệm nút bông, hơ mép đĩa trước sau thao tác - Trong suốt trình cấy, miệng đĩa petri gần lửa Tránh nhiễm vi sinh vật từ khơng khí vào - Khi cấy, cầm góc cuối que ngón tay (cái, trỏ, ), lướt nhẹ mặt thạch Nếu tỳ mạnh làm vỡ mặt thạch - Nếu dự đoán số lượng vi khuẩn có dịch mẫu nhiều, sau đường cấy đốt lại que cấy để làm giảm thiểu số lượng vi khuẩn đường ria Nếu khơng khó tách biệt khuẩn lạc Hình: (a) -Sơ đồ cấy phân lập thạch đĩa; (b) - Kết cấy phân lập thạch đĩa ; (c) - Kết cấy phân lập thạch đĩa (4 đường cấy) Chú ý: cấy ria từ – đường tùy theo đường kính đĩa 2) Kỹ thuật hộp trải - Hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng cho vào đĩa petri có mơi trường thích hợp - Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải khắp mặt thạch 123 - Tiếp tục sử dụng que gạt gạt mẫu cho khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ đĩa thứ – Đặt đĩa pêtri 1, 2, vào tủ ấm nhiệt độ thích hợp sau thời gian định tuỳ giống vi sinh vật ta nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa thứ 3) Kỹ thuật hộp đổ - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa petri - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đun chảy để nguội đến 45 - 55ºC vào đĩa petri cấy mẫu - Xoay nhẹ đĩa petri chiều ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn vi sinh vật kỵ khí thực sau: Phân lập vi sinh vật kị khí môi trường đặc đĩa pêtri - Dùng môi trường đặc ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ khơng khí mơi trường - Để nguội mơi trường 45 - 50ºC - Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm - Rót nhanh mơi trường ống nghiệm vào nắp đĩa pêtri đậy thật nhanh nắp lại, cho mặt nắp mơi trường khơng cịn khơng khí - Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc nắp đĩa petri - Ni bình yếm khí: sau cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí Thoa lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên đặt vào bình, đậy nắp lại, dùng máy hút chân không Cho vào tủ ấm, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp - Sau vi sinh vật phát triển, chọn khuẩn lạc riêng rẽ khối môi trường, dùng que cấy cắt khối môi trường cấy vào mơi trường lỏng thích hợp 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập Có nhiều cách kiểm tra: 1) Kiểm tra vết cấy 124 Quan sát sinh trưởng vi sinh vật qua vết cấy mơi trường đặc: - Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng đều, chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại - Nếu vết cấy khơng loại bỏ 2) Kiểm tra lại độ chủng loại khuẩn lạc - Chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng - Tách khuẩn lạc hồ tan, pha lỗng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng - Nhỏ giọt dịch vào đĩa pêtri có mơi trường - Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, đĩa thứ 2, thứ - Đặt đĩa pêtri vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật - Sau lấy quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Sự khiết khuẩn lạc biểu khiết giống Thực hành: Phân lập vi khuẩn - Sinh viên thực hành phân lập vi sinh vật kỹ thuật hộp ria từ hỗn tạp vi sinh vật phịng thí nghiệm cung cấp Báo cáo kết Trình bày lại phương pháp phân lập nộp báo cáo kết phân lập 125 Bài PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT Đếm số lượng tế bào vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng việc đánh giá chất lượng vi sinh chế phẩm sinh học, lương thực, thực phẩm (thức ăn, nước uống…), đồng thời đánh giá điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu sinh khối… Việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật thường thực theo phương pháp chủ yếu đếm trực tiếp đếm gián tiếp Mục đích - Trang bị cho sinh viên kỹ thực hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật dung dịch môi trường nuôi cấy - Yêu cầu sinh viên phải hiểu ý nghĩa nguyên tắc việc đếm số lượng tế bào vi sinh vật - Sinh viên phải nắm vững qui trình, cách thức tiến hành thao tác đếm số lượng tế bào vi sinh vật từ loại mẫu khác Nguyên vật liệu thiết bị Thiết bị dụng cụ - kính hiển vi vật kính x10, x40, lamelle - kim cấy đèn cồn - Buồng đếm hồng cầu Thomas Neubaur - micropipette đầu col 1ml vô trùng, đầu col 0, 1-0,2ml - vial khử trùng - ống nghiệm 10ml dùng để pha loãng dịch mẫu vi khuẩn - đĩa petri khử trùng - Bút lơng dầu Vật liệu hóa chất - Mẫu vi sinh vật (mẫu vi sinh vật cấy môi trường đặc, mẫu sữa, mẫu nước…) - Dịch nấm men ống giống nấm men nuôi cấy 48 - Mẫu cám, bắp, thịt… - Môi trường dinh dưỡng (TSA, NA, PCA…) đĩa/1 sinh viên - chai chứa 1lít nướcmuối sinh lý cất khử trùng Nguyên tắt chung 126 - Mẫu phải pha loãng Tuỳ theo mức độ nhiễm khuẩn mẫu ta có ước lượng pha lỗng 1/5; 1/10 ; 1/20 hay 1/10; 1/100; 1/1000…… - Dung dịch dùng pha loãng mẫu thường NaCl 9%0 hay phot phat đệm vô trùng - Cách pha: + Mẫu 1/5 : 1ml mẫu + 4ml NaCl 9%0 + Mẫu 1/10: 1ml mẫu + 9ml NaCl 9%0 - Từ mẫu 1/10 (10-1) lấy 1ml + 9ml NaCl 9%0 ta có độ pha lỗng 10-2 , ta có độ pha loãng 10-3, 10-4…… 1ml 1ml 1ml 1/100 1/102 1/103 1/104 Phương pháp đếm 3.1 Đếm trực tiếp buồng đếm a Cấu tạo buồng đếm Hình 2: Buồng đếm tế bào vi sinh vật 127 - Buồng đếm phiến kính trong, dày, hình chữ nhật - Giữa phần lõm phẳng, có kẻ hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ Bên ngồi có ghi tên loại buồng đếm, ghi thơng số kỹ thuật hình b Cấu tạo khung đếm Cấu tạo khung đếm có: - Trường hợp 1: khung có 16 lớn, ô lớn có 25 ô nhỏ Vậy khung có 400 nhỏ - Trường hợp 2: khung có 25 lớn, lớn có 16 nhỏ Vậy khung có 400 nhỏ - Diện tích ô nhỏ 1/400 mm2 Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3 c Cách tiến hành - Đặt lammen phủ lên khung đếm - Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men pha loãng, bỏ vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm lammen - Dung dịch chảy tràn từ từ vào rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, thừa Nếu bị bọt kẹt lại lammen phải làm lại - Đặt buồng đếm lên bàn kẹp kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ trước, sau dùng vật kính x40 để đếm - Đếm số tế bào ô lớn ( ô cạnh, ô giữa), đếm ô nhỏ ô lớn Trong tất ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn ô trước, sau đếm số tế bào nằm cạnh phía cạnh bên phải ô - Đếm tất 80 ô nhỏ có ô lớn (T/h: ô lớn có 16 nhỏ) 128 - Hoặc đếm 125 ô nhỏ có ô lớn (T/h: ô lớn có 25 nhỏ) d Cơng thức tính Số tế bào/1 ml mẫu = a x 4.000 x 1.000 /H Trong đó: a = số tế bào trung bình có nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3 ) 4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành mm3 1.000 = số qui đổi từ mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3 ) H = hệ số pha lỗng (ví dụ: H = 10-2) e Chú ý: - Chỉ đếm tổng số tế bào, khơng thể biết tế bào cịn sống, tế bào chết - Nồng độ dịch huyền phù pha lỗng cho mật độ nhỏ khơng 10 tế bào - Sử dụng xong phải rửa buồng đếm lau khô - Để đạt độ xác cao, số tế bào trung bình đếm ô nhỏ: 2.5 < a