Giáo trình Vi sinh đại cương cung cấp cho người học những kiến thức như: Các yêu cầu cơ bản và cách sử dụng các thiết bị trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật; Môi trường nuôi cấy và các nguồn vi sinh vật; Quan sát vi sinh vật; Kỹ thuật gieo cấy và phân lập vi khuẩn thuần khiết; các phương pháp nhuộm vi khuẩn;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 1 giáo trình.
UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MƠN HỌC: VINH SINH ĐẠI CƯƠNG NGÀNH, NGHỀ: BẢO VỆ THỰC VẬT TRÌNH ĐỘ: CAO ĐẲNG (Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm 2017 Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2017 TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu thuộc loại sách giáo trình nên nguồn thơng tin phép dùng ngun trích dùng cho mục đích đào tạo tham khảo Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh bị nghiêm cấm ii LỜI GIỚI THIỆU Xuất phát từ nhu cầu thực tế môn học vi sinh đại cương, biên soạn giảng này, với mong muốn giúp cho đối tượng sinh viên cao đẳng năm thứ hai Khoa nông nghiệp thủy sản thực hành số kỹ thuật vi sinh học để hiểu sâu nội dung học phần lý thuyết Lần biên soạn giảng thực hành phù hợp với điều kiện sở vật chất nhà trường, phù hợp với yêu cầu thực tế phù hợp với trình độ sinh viên, chúng tơi khơng tránh khỏi thiếu sót, nhóm tác giả mong nhận đóng góp ý kiến chân thành chuyên gia sinh viên, để lần tái sau sửa chữa bổ sung nội dung theo hướng cập nhật hóa, đại hóa thực tiễn Việt Nam Đây giáo trình biên soạn công phu, chắn không tránh khỏi thiếu sót Vì chúng tơi mong nhận đóng góp ý kiến đồng nghiệp độc giả Xin chân thành cảm ơn Đồng Tháp, ngày 26 tháng năm 2017 Chủ biên Tăng Thị Thanh Hương ii MỤC LỤC Trang Bài Các yêu cầu cách sử dụng thiết bị phòng kiểm nghiệm vi sinh vật Bài Môi trường nuôi cấy nguồn vi sinh vật Bài Quan sát vi sinh vật 16 Bài Kỹ thuật gieo cấy phân lập vi khuẩn khiết 20 Bài phương pháp nhuộm vi khuẩn 28 Bài Phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 ii GIÁO TRÌNH MƠN HỌC Tên mơn học: VI SINH ĐẠI CƯƠNG Mã mơn học: CNN221 Vị trí, tính chất, ý nghĩa vai trị mơ đun: - Vị trí: Vi sinh đại cương mơn học kỹ chuyên ngành bắt buộc, bố trí sau người học học xong chương trình mơn học chung mơn học sở - Tính chất: môn học kỹ quan trọng, giúp sinh viên hiểu hoạt động Vi sinh đại cươngvà kỹ cần thiết hoạt động khuyến nơng Ý nghĩa vai trị: Giáo trình cung cấp cho sinh viên kiến thức nông Khuyến nông, kỹ thuật tổ chức quản lý chương trình Vi sinh đại cương nhằm giúp sinh viên sau trường nắm kỹ cần thiết để xây dựng quản lý chương trình Vi sinh đại cươngmột cách hiệu Mục tiêu mô đun: - Về kiến thức: + Hiểu Vi sinh đại cươngl gì, hoạt động vi sinh đại cương + Biết phương pháp tiếp xúc với nông dân để nơng dân có cảm tình đạt hiệu cao công việc + Biết nguyên tắc thuyết phục nông dân hành động biết cách tổ chức buổi tập huấn, hội họp + Nắm bắt cách thiết kế giảng, áp phích, bảng lật, tờ bướm - Về kỹ năng: + Thực nguyên tắc để lấy thiện cảm với nông dân + Xây dựng thuyế trình thực thuyết trình trước nơng dân đạt hiệu tốt + Thực tổ chức buổi hội thảo, tập huấn cho nông dân + Thiết kế bảng lật, báo cáo sinh động, dễ hiểu - Về lực tự chủ trách nhiệm: + Rèn luyện tính cẩn thận, ham học hỏi i + Làm việc độc lập làm việc theo nhóm, giải cơng việc, vấn đề phức tạp điều kiện làm việc thay đổi, chịu trách nhiệm cá nhân trách nhiệm nhóm Nội dung mơ đun: Thời gian (giờ) Thực hành, thí Lý nghiệm, Kiểm tra thuyết thảo luận, tập Số TT Tên bài, mục Chương 1: Các yêu câu cách sử dụng thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh vật 1 Chương 2: Môi Trường Nuôi Cấy Các Nguồn Vi Sinh Vật 1 Chương 3: Quan Sát Vinh Vật 2 Chương 4: Kỹ Thuật Gieo Và Phân Lập Vị Khuẩn Thuần Khiết 12 Kiểm tra Chương 5: Phương Pháp Nhuộm Vi Khuẩn 15 12 Chương 6: Phương pháp Điếm Số Lượng Tế bào Vi Sinh Vật 11 8 Ôn thi 1 Thi/kiểm tra kết thúc môn học 1 Tổng số Cộng 45 ii 14 28 Chương CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN VÀ CÁCH SỬ DỤNG CÁC THIẾT BỊ TRONG PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT Vi sinh vật phân bố rộng rãi tự nhiên, ni cấy loại vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu dễ bị tạp nhiễm, xây dựng phịng thí nghiệm cần ý địa điểm, vị trí, hướng gió cách phân bổ khu vực phòng làm việc để bố trí dụng cụ, thiết bị nhằm tránh tạp nhiễm nuôi cấy Thiết bị để quan sát vi sinh vật kính hiển vi, kích thứơc tế bào vi sinh vật nhỏ, mắt thường khơng thể thấy Muốn quan sát hình thái, cấu tạo… vi sinh vật ta phải sử dụng Kính hiển vi dụng cụ quang học giúp phóng đại mẫu vật lên gấp nhiều lần quan sát ảnh chúng rõ 1.1 Mục đích-yêu cầu - Giúp sinh viên biết quy tắc an tồn vi sinh vật phịng thí nghiệm - Biết sát trùng dụng cụ thực hành phịng thí nghiệm vi sinh - Biết cấu tạo cách sử dụng thiết bị phịng thí nghiệm, đặc biệt cách bảo quản kính hiển vi 1.2 Dụng cụ thiết bị - Tủ cấy vi sinh vật - Tủ ủ ấm - Tủ khử trùng nhiệt khô - Nồi khử trùng nhiệt ướt (Autoclave) - Các dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, ống đong, đủa thủy tinh, đĩa đồng hồ, que trang… - Kính hiển vi quang học (Olympus) - Nhiệt kế, pH kế - Máy lắc (Vortex) - Dầu cèdre 1.3 Các quy tắc an toàn phòng kiểm nghiệm Các yêu cầu phòng kiểm nghiệm - Phòng kiểm nghiệm phải xây dựng nơi cao ráo, tháng mát, tránh nơi cộng cộng Trong phòng phải phân biệt thành khu vực riêng biệt như: thu lưu mẫu, rửa dụng cụ, khử trùng dụng cụ, bảo quản hóa chất, ni cấy mẫu… - Cửa ln đóng để làm giảm thiểu dịch chuyển khơng khí, ngăn ngừa bụi làm giảm ngoại nhiễm - Máy điều hịa khơng khí để kiểm sốt độ ẩm, nhiệt độ - Khử trùng phòng formol 37% Các quy tắc an tồn phịng kiểm nghiệm vi sinh Cần tuân thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho thân cho người khác phịng thí nghiệm: - Khơng ăn uống, hút thuốc phòng - Mặc áo blouse, mang găng tay mang trang thời gian làm việc với vi sinh vật - Khử trùng mặt bàn cồn 70oC lau giấy thấm khử trùng tay cồn 70oC dung dịch diệt khuẩn khác - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người cấy lên tất hộp petri, ống nghiệm, bình ni cấy - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng, (không hút miệng) - Tách riêng chất thải rắn chất thải lỏng nhiễm vi sinh vật hấp khử trùng trước bỏ vào bãi rác - Gói ràng băng keo đặt chồng hộp đĩa petri - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt đầu que cấy châm vào lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vật vào khơng khí - Rửa dụng cụ xà bơng nước để khử trùng - Sát trùng rửa tay trước rời khỏi phịng thí nghiệm 1.4 Một số thiết bị thƣờng dùng Tủ cấy vi sinh vật a Công dụng: tủ cấy thiết bị bảo đảm buồng cấy khơng có vi sinh vật, ta dùng mơi trường vơ trùng mẫu vật định cấy đưa vào để nhân giống cấy chuyền (trong điều kiện vô trùng) b Cấu tạo: tủ cấy người tủ cấy người che kín bên nóc, phía có cấu tạo gồm: - Quạt gió lưới lọc bên trên, mở điện quạt gió ln thổi làm cho khơng khí bên ngồi khơng tràn vào được, hệ thống lưới lọc ngăn cản bụi bẩn - Hệ thống đèn cực tím để khử trùng mặt bàn buồng cấy - Đèn chiếu sáng để tạo đủ ánh sáng cho buồng cấy - Công tắc bên phải tủ cấy c Cách sử dụng Tủ cấy ln đặt vị trí tránh gió lùa, hạn chế người qua lại, thường phịng kín Trước sử dụng phải khử trùng tủ cách dùng bình xịt tay có chứa cồn 70oC để xịt xung quanh bên trong, cánh tủ bàn cấy dùng giấy thấm lau khô Mở điện, đèn cực tím, đèn chiếu sáng đóng kín cửa tủ, đèn cực tím bật lên, đèn chiếu sáng tự động tắt, sau 30 phút khử trùng, đưa mẫu vật vào cấy Khi mở cửa tủ, đèn cực tím tự động tắt đèn chiếu sáng bật lên, lúc buồng cấy sẵn sàng cấy Sau sử dụng xong, ta tắt tất đèn tủ đóng kín cửa để hạn chế vi sinh vật lạ Tủ ủ (incubator) a Công dụng Tủ ủ thiết bị tạo nhiệt độ cần thiết để ni cấy vi sinh vật, nhiệt độ thay đổi từ 25 – 60oC b Cấu tạo: tủ ủ có cấu tạo đơn giản, gồm có vỏ điện trở - Vỏ tủ ủ cấu tạo gồm lớp, có đệm lớp cách nhiệt - Điện trở để cung cấp nhiệt làm nóng bầu khơng khí tủ có phận điều chỉnh nhiệt độ tự động (rờ le) để giữ nhiệt độ cố định theo yêu cầu thí nghiệm c Cách sử dụng Bật công tắt, xoay nút điều chỉnh nhiệt độ mong muốn, theo dõi nhiệt độ nhiệt kế ổn định theo nhiệt độ điều chỉnh Tủ khử trùng nhiệt khô (dry-air sterilizer) a Công dụng Tủ khử trùng nhiệt khô dùng để khử trùng vật dụng không bị nhiệt độ phá hủy thủy tinh, kim loại Nhiệt khơ thay đổi từ 70-200oC b Cấu tạo Tủ khử trùng nhiệt khơ có cấu tạo giống tủ ủ cấu tạo lớp vỏ chắn hơn, điện trở có công suất cao để đưa nhiệt độ lên cao c Cách sử dụng Sau rửa dụng cụ cần khử trùng nhiệt khơ, để khơ, gói lại giấy không thấm nước, cho vào tủ Mở điện, xoay nút điều chỉnh nhiệt độ theo dỏi nhiệt nhiệt độ đạt mức mong muốn, bắt đầu tính khử trùng Thời gian khử trùng thay đổi từ 1-3 (tùy theo số lượng kích thước vật dụng cần khử trùng) tính từ nhiệt độ lên đến 170oC Khi đủ thời gian khử trùng cần thiết, tắt điện chờ nhiệt độ hạ xuống từ từ đến 40oC - 45oC mở tủ lấy vật dụng khử trùng Nồi khử trùng nhiệt ƣớt (autoclave) a Công dụng Nồi khử trùng nhiệt ướt thiết bị dùng nước nhiệt độ cao (121oC) cách nâng áp suất nồi lên (1kgf/cm2) để khử trùng vật dụng môi trường để nuôi cấy vi sinh vật b Cấu tạo Nồi khử trùng nhiệt ướt cấu tạo kim loại, chắn, dầy, có lớp vỏ có khả chịu áp suất cao Khí nồi buồng khử trùng (nơi chứa vật dụng cần khử trùng), buồng khử trùng có lắp van khơng khí, áp kế, nhiệt kế để đo áp suất, nhiệt độ nước van bảo hiểm để xì áp suất vượt mức an toàn đảm bảo nồi không bị nổ Nước cất đổ vào bên nồi, nước từ khoang chứa cung cấp cho buồng khử trùng Phía nồi khử trùng có nắp nặng khóa chắn nút vặn khít với buồng khử trùng vịng đệm cao su c Cách sử dụng Cho vật dụng cần khử trùng vào buồng khử trùng, đổ nước (nước cất lần) vào khoang chứa nước, đậy nắp khoang chứa nước cho vật dụng cần khử trùng vào đậy nắp nồi, khóa kín để khơng cho khơng khí hay nước ngồi Mở điện, điện trở bên nồi cung cấp nhiệt làm sôi nước khoang chứa tạo nước làm cho áp suất khoang tăng lên Điều chỉnh Autoclave cách chỉnh nhiệt độ đến 1210C, nhiệt độ tăng 100oC, nước bốc hơi, nước bị giữ điều kiện kín tăng áp suất nhiệt độ tiếp tục tăng đến đạt nhiệt độ 121 oC lúc đạt áp suất tương ứng 1kgf/cm2 , sau điều chỉnh đồng hồ thời gian khử trùng Khi áp suất tăng lên 1kgf/cm2 buồng khử trùng, thời gian khử trùng tính Thời gian khử trùng lâu hay mau tùy loại vật dụng khử trùng Nồi khử trùng tự động tắt xả tùy theo thời gian điều chỉnh Sau khử trùng xong, phải đợi cho áp suất buồng khử trùng xuống đến mở nắp nồi lấy vật dụng Kính hiển vi quang học a Cấu tạo: kính hiển vi quang học gồm thấu kính: vật kính thị kính, sử dụng ánh sáng thấy nguồn sáng Một dãy thấu kính tập trung rõ ràng vào hình ảnh phóng đại lên nhiều lần Sự phóng đại đạt tia sáng từ nguồn sáng qua kính hội tụ để hướng ánh sáng qua mẫu vật Sau đó, tia sáng qua vật kính, thấu kính gần mẫu vật Hình ảnh mẫu vật phóng đại thêm lần thị kính Độ phóng đại tồn phần mẫu vật tính cách nhân độ phóng đại vật kính với độ phóng đại thị kính Đa số kính hiển vi quang học dùng phịng thí nghiệm vi sinh có nhiều vật kính, vật kính 10x, 40x, 100x Phần lớn thị kính có độ phóng đại 10x Nhân độ phóng đại vật kính với độ phóng đại thị kính, ta có độ phóng đại tồn phần 100x, 400x, 1000x Một vài loại kính đạt độ phóng đại 2000x với vật kính dầu Độ phân giải khả thấu kính phân biệt chi tiết hay cấu trúc nhỏ mẫu vật Đây khả thấu kính phân biệt hai điểm cách khoảng cách định b Công dụng: quan sát mẫu vật nhỏ vài chi tiết cấu trúc chúng c Cách sử dụng kính Cách tìm vi trường: nghĩa sau điều chỉnh ta tìm thấy hình ảnh mẫu vật cần quan sát kính hiển vi Cần thực bước sau: Đặt miếng lame có mang mẫu vật lên giá để kính Xoay vật kính 10x 40x nấc điều chỉnh vật kính để nhìn thấy mẫu vật Sau nhỏ giọt dầu lên tiêu xoay vật kính nấc 100x Nhẹ nhàng hạ vật kính xuống cho vật kính xuống sát tiêu nhúng vào giọt dầu Trong suốt q trình này, mắt khơng nhìn vào thị kính mà phải nhìn ngang từ bên ngồi vào khoảng cách vật kính tiêu để tránh hạ vật kính xuống thấp làm vỡ tiêu Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp Để quan sát vi khuẩn mẫu vật nhuộm, cần điều chỉnh ánh sáng tăng dần theo độ phóng đại vật kính 10x