BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIÊM DƯỚI DA CARBON TETRACHLORIDE KHÓA LUẬN TỐT NG.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH GÂY XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIÊM DƯỚI DA CARBON TETRACHLORIDE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH GÂY XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIÊM DƯỚI DA CARBON TETRACHLORIDE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Cán hướng dẫn: ThS Đỗ Thị Hương Lan TS Trần Bá Hiếu HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giúp đỡ Nhà trường, Phòng, Ban, Bộ môn Học viện Viện Đào tạo Dược giúp tơi hồn thành chương trình học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Đảng ủy - Ban Giám đốc Học viện Viện Đào tạo Dược, Phịng Đào tạo, Bộ mơn Dược lý - Viện Đào tạo Dược tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Đỗ Thị Lan Hương Tiến sĩ Trần Bá Hiếu, người Thầy tận tình truyền đạt kiến thức cho tơi, động viên giúp đỡ trực tiếp hướng dẫn trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Cơ tồn thể Cán bộ, Nhân viên Viện Đào tạo Dược, đặc biệt Bộ môn Dược lý ln ln nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn Thầy Cô, Nhà khoa học Hội đồng chấm khóa luận dành nhiều thời gian tơi ý kiến q báu q trình hồn thiện bảo vệ khóa luận Tơi vơ biết ơn chăm sóc, động viên gia đình, người thân yêu tôi, luôn bên cạnh chia sẻ với điều sống suốt q trình hồn thành khóa luận Tơi trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ tình cảm quý báu bố mẹ, người thân, bạn bè dành cho Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Thị Hải Yến MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH XƠ GAN 1.1.1 Thực trạng bệnh xơ gan 1.1.2 Tiến trình bệnh xơ gan 1.1.3 Nguyên nhân gây xơ gan 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh xơ gan 1.1.5 Tiêu chí đánh giá xơ gan 1.1.6 Điều trị xơ gan 10 1.2 CÁC MƠ HÌNH GÂY XƠ GAN TRÊN ĐỘNG VẬT 1.2.1 Mơ hình xơ gan tác nhân hóa học 11 11 1.2.2 Mơ hình xơ gan phương pháp thắt ống dẫn mật 11 1.2.3 Mơ hình gây xơ gan phương pháp miễn dịch 12 1.2.4 Mơ hình gây xơ gan chế độ ăn uống 12 1.3 CƠ CHẾ GÂY BỆNH BẰNG CARBON TETRACHLORIDE (CCL4) 13 CHƯƠNG – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp gây dựng mơ hình 2.2.2 Phương pháp đánh giá hiệu gây xơ gan điều trị xơ gan 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 18 18 19 27 2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 27 2.4 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG TỒN THÂN 3.1.1 Trọng lượng chuột 29 3.1.2 Tình trạng tồn thân 29 30 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ SỐ HUYẾT HỌC 31 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘ CÁC THƠNG SỐ SINH HĨA 32 3.4 KẾT QUẢ MÔ HỌC 34 3.4.1 Sự thay đổi hình ảnh đại thể gan 35 3.4.2 Tổn thương vi thể cấu trúc gan 36 3.4.3 Tổn thương siêu cấu trúc gan 37 3.4.4 Mức độ xơ hóa gan CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 THỜI GIAN GÂY XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG CARBON TETRACHLORIDE 4.2 CÁC TỔN THƯƠNG CƠ BẢN TRONG MƠ HÌNH GÂY XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG TIÊM DƯỚI DA CARBON TETRACHLORIDE 4.2.1 Tình trạng toàn thân 41 41 45 46 4.2.2 Xét nghiệm huyết học 47 4.2.3 Xét nghiệm sinh hóa 4.2.4 Giải phẫu bệnh 49 51 4.2.5 Siêu cấu trúc 52 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng 2.2: Hệ thống tính điểm xơ gan theo METAVIR 23 Bảng 3.1 Kết cân nặng chuột nghiên cứu 29 Bảng 3.2: Ảnh hưởng CCl4 tới số huyết học chuột 31 Bảng 3.3: Ảnh hưởng CCl4 tới số sinh hóa chuột 32 Bảng 3.4: Giai đoạn xơ hóa gan nhóm chuột thí nghiệm 40 theo METAVIR DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình vẽ, biểu đồ Trang Hình 1.1 Cơ chế gây tổn thương gan carbon tetrachoride 14 Hình 2.1 Chuột nhắt trắng Swiss 8-10 tuần tuổi 16 Hình 2.2 Tiêm da 19 Hình 2.3 Thao tác lấy mẫu gan chuột 20 Hình 3.1 Sự thay đổi trọng lượng chuột nhóm gây xơ gan so với nhóm đối chứng 29 Hình 3.2 Tình trạng lơng chuột 30 Hình 3.3 Tình trạng phân chuột 31 Hình 3.4 Kết định lượng bạch cầu chuột nghiên cứu (U/L) 32 Hình 3.5 Cấu trúc đại thể gan chuột nhóm 34 Hình 3.6 Cấu trúc vi thể gan chuột nhóm nhuộm H&E 35 Hình 3.7 Hình ảnh ứ mật tế bào gan bị thối hóa (nhuộm H&E) 36 Hình 3.8 Cấu trúc vi thể gan nhóm kính hiển vi điện tử truyền qua 37 Hình 3.9 Cấu trúc vi thể gan chuột sau tiêm CCl4 (nhuộm ba màu Masson) 38 Hình 3.10 Cấu trúc vi thể gan nhóm kính hiển vi điện tử truyền qua 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ AASLD American Association for the Study of Liver Diseases (Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ) ALP Alkaline phosphatase ALT (GPT) Alanine transaminase (Glutamate pyruvate transaminase) AST (GOT) Aspartate transansaminase (Glutamate oxaloacetate) BCG Bromocresol green BOD Bilirubin oxidase CCl3 Tricholoromethyl CCl3OO Tricholoromethylperoxy CCl4 Carbon tetrachloride CHER Cholesterol esterase ECM Exatracellular matrix GGT Glutamyltransferase HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HCC Hepatocellular carcinoma (Ung thư gan) HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C) HE Hematoxylin-eosin HSC Haematopoietic stem cell (Tế bào gốc tạo máu) MCV Mean Corpuscular Volume (Thể tích trung bình hồng cầu) MFB Myofibroblast MFOs Micrsomal mixed function oxidase MNP Matrix metalloproteinase NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease (Bệnh gan nhiễm mỡ không rượu) NCHS National Coalition for Sexual Health (Trung tâm Thống kê Y tế Quốc gia) PAS Periodic acid Schiff PBS Phosphate buffered saline PBS Primary biliary cirrhosis (Xơ mật nguyên phát) PDGF Platelet-dierived growth factor (Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu) POD Peroxidae PSC Primary sclerosing cholangitis (Viêm xơ đường mật nguyên phát) SEM Scanning electron microscopes (Kính hiển vi điện tử quét) TEM Transmission electron microscopes (Kính hiển vi điện tử truyền qua) TGF-β Transforming growth factor – β (Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β) TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) - Mơ hình gây đột biến gen Almsl Fat ausi dựa tương tác chế độ ăn uống kiểu gen để thúc đẩy tổn thương gan, chuột mang đặc điểm tương tự NASH đó, mơ hình hấp dẫn cho nghiên cứu tiến triển NAFLD thành NASH diện yếu tố khác Tuy nhiên, nghiên cứu này, chuột cần thời gian dài để hình thành xơ hóa khơng hồi phục dừng mơ hình [51,52] Mơ hình gây xơ gan nhiễm trùng làm sáng tỏ chế trung gian hệ thống miễn dịch xảy trình xơ hóa gan Q trình mang đặc điểm tương tự nhiễm virus người Hay nhiễm trùng Schistosoma mansoni mang đặc điểm tương tự nhiễm ký sinh trùng người gây xơ hóa gan sau tiêm da ấu trùng sán máng, nhờ đáp ứng viêm đáp ứng miễn dịch với ấu trùng, u hạt phát triển gan sau 6-8 tuần Lượng collagen gan tăng gấp 20 lần bình thường kèm theo giảm tổng hợp albumin Nhưng sử dụng mơ hình chủng chuột khác cho thấy thay đổi lớn mức độ xơ hóa gan [53,54,55] Dựa vào sở trên, xây dựng mơ hình xơ gan chuột Swiss hình thức tiêm da carbon tetrachloride liều 800mg/kg pha dầu olive với tỉ lệ 1:18 tương ứng với liều 5ml/kg x lần/tuần Ngoài sử dụng số huyết học, sinh hóa thơng thường để đánh giá tình trạng xơ gan, nghiên cứu chúng tơi áp dụng kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để phản ảnh xác tình trạng xơ hóa gan chuột 4.2 CÁC TỔN THƯƠNG CƠ BẢN TRONG MƠ HÌNH GÂY XƠ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG TIÊM DƯỚI DA CARBON TETRACHLORIDE 4.2.1 Tình trạng toàn thân Trong kết nghiên cứu chúng tôi, sau sử dụng CCl 4, trọng lượng chuột nhóm sử dụng CCl4 có thay đổi nhẹ theo thời gian giảm mạnh so với nhóm đối chứng (p