9 PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN – KT Một trong những hạn chế của các thử nghiệm sinh hoá là vi sinh vật phải phát triển trên một vài môi trường nào đó và thời gian cần ít nhất là 12 24 giờ để đọc kết quả Trên t.
9 PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN – KT Một hạn chế thử nghiệm sinh hoá vi sinh vật phải phát triển vài môi trường thời gian cần 12 - 24 để đọc kết Trên thực tế, chủng thử nghiệm bị đột biến khơng thực chuyển hố bình thường chủng chuẩn khác, ví dụ hầu hết lồi E.coli có khả sử dụng lactose nguồn carbon, nhiên E.coli phân lập lại khả sử dụng lactose Mặt khác, số trường hợp ni cấy phân lập vi khuẩn bị thất bại việc sử dụng kháng sinh để điều trị Để khắc phục nhược điểm này, kỹ thuật phát kháng nguyên, kháng thể vật liệu di truyền vi khuẩn công cụ hữư hiệu ngày sử dụng rộng rãi Sự kết hợp phân tử kháng nguyên kháng thể xảy nhờ lực: (1) lực liên kết ion (lực tĩnh điện Coulomb) nguyên tử nhóm hố học mang điện trái dấu, ví dụ NH3 + COO-; (2) lực liên kết cầu nối hydro nguyên tử hydro mang điện tích dương với nguyên tử mang điện tích âm; (3) lực Van der Walls (lực hấp dẫn liên phân tử) hai phân tử phụ thuộc vào tương tác lớp mây điện tử mặt (Pauling, 1948) Mục địch sử dụng phản ứng kháng nguyên – kháng thể: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh nhiễm trùng; Định loại vi sinh vật; Nghiên cứu đáp ứng thể KN VSV: Đánh giá hiệu lực bảo vệ vaccine, Xác định hiệu đáp ứng miễn dịch bảo vệ Căn cách nhân định kết chia làm nhóm: - Các phản ứng tạo thành hạt: phản ứng ngưng kết, phản ứng kết tủa - Các phản ứng dựa vào hoạt động sinh học kháng thể: phản ứng trung hòa, kết hợp bổ thể - Các phản ứng dùng KN-KT đánh dấu: MDHQ, MD phóng xạ, ELISA, MD sắc ký 9.1 Phản ứng ngưng kết hạt (Partical Agglutination) 9.1.1.Nguyên lý Là phản ứng kết hợp KN hữu hình (tế bào tầm vóc tế bào) KT đặc hiệu tạo thành phức hợp KN-KT dạng hạt ngưng kết quan sát mắt thường 9.1.2 Điều kiện hình thành hạt ngưng kết Ngồi tính đặc hiệu giưa KN KT, phải có thêm điều kiện: + KN KT đa giá (có nhiều vị trí kết hợp) + KN KT có nồng độ tương đương 9.1.3 Các loại phản ứng ngưng kết • Ngưng kết trực tiếp (NK chủ động): KN ngưng kết trực tiếp với KT đặc hiệu tạo thành mạng lưới ngưng kết - Phản ứng ngưng kết trực tiếp phiến kính: Phiến kính sạch: Dùng que cấy lấy VK cần xác định hòa vào giọt mẫu phiến kính, sau 30 giây đến phút đọc kết - Phản ứng ngưng kết ống nghiệm + Huyết pha với nồng độ giảm dần vào ống nghiệm + Cho thêm vào lượng KN biết tên vào ống nghiệm + Phản ứng dương tính có hạt ngưng kết lắng xuống đáy ống nghiệm • Ngưng kết gián tiếp KN hòa tan gắn lên mượn hữu hình (hồng cầu, hạt latex) gặp KT đặc hiệu xảy phản ứng ngưng kết mượn a Phản ứng TPHA KN giang mai gắn lên hồng cầu (cừu, ngỗng, gà…) b Phản ứng RPR Phản ứng RPR định tính - Để sinh phẩm nhiệt độ phòng trước tiên hành phản ứng - Nhỏ mẫu (Huyết thanh) vào vịng trịn bìa phản ứng, để giọt rơi tự Chứng dương, chứng âm tương ứng theo hướng dẫn nhà sản xuất.- Dàn mẫu giới hạn vòng tròn - Lắc nhẹ lọ kháng nguyên - Nhỏ giọt kháng nguyên vào vịng trịn có mẫu - Khơng khuấy trộn Để phản ứng lên máy lắc lắc tốc độ 100 vòng/phút phút theo hướng dẫn nhà sản xuất - Đọc kết trực tiếp nơi có đủ ánh sáng Phản ứng RPR định lượng: - Thực phản ứng huyết pha lỗng dần tới độ pha lỗng lớn cịn cho kết dương tính Pha lỗng huyết tiến hành với lượng gấp đôi: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 - Để sinh phẩm nhiệt độ phòng trước làm phản ứng - Nhỏ 50 µl NaCL 90/00 vào vịng trịn bìa phản ứng từ số 2-5 - Nhỏ 50 µl mẫu vào vịng trịn 1và - Pha lỗng bậc hai từ vịng trịn - Dàn mẫu giới hạn vòng tròn - Nhỏ kháng ngun vào vịng trịn có mẫu - Để phản ứng lên máy lắc lắc tốc độ 100 vòng/phút phút - Đọc kết trực tiếp nói có đủ ánh sáng NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ Phản ứng dương tính: Có hạt kết cụm màu đen (hiện tượng lên bông) khắp mặt trung tâm vịng trịn bìa phản ứng Phản ứng dương tính yếu: Có hạt kết cụm màu đen bao quanh rìa vịng trịn bìa phản ứng Kết âm tính: đám than hoạt tập trung vòng tròn, màu xám đồng Nhận định kết RPR định lượng c Phản ứng SFD KN HIV gắn hạt Gelatin 9.2 Phản ứng kết tủa (Precipilin Tests) 9.2.1 Nguyên lý: - Phản ứng kết tủa kết hợp kháng nguyên hòa tan (KN tầm phân tử) lúc gặp kháng thể tương ứng, tạo thành tủa quan sát trực tiếp mắt thường nhờ soi kính lúp - Phản ứng thực môi trường lỏng môi trường gel 9.2.2 Các loại phản ứng • Phản ứng kết tủa môi trường lỏng Khi dung dịch KN dung dịch KT trộn với theo tỷ lệ thích hợp, phức hợp KN-KT hình thành dạng hạt kết tủa Lượng tủa phụ thuộc vào số lượng tuyết đối KN, KT mối tương quan lượng KN, KT Phản ứng RPR: KN chất cardiolipin lấy từ tim bò có cấu trúc giống chất lipoid VK giang mai -Phản ứng âm tính: đám đen mịn tập trung vòng tròn màu xám đồng -Phản ứng dương tính: hạt kết tủa màu đen rìa vịng trịn phản ứng khắp mặt vịng trịn • Phản ứng kết tủa gel thạch - Kỹ thuật khuếch tán đơn: có KN KT khuếch tán thạch + Khuếch tán ống nghiệm (Oudin) Cho thạch hòa KT vào đoạn ống nghiệm cho dung dịch KN lên KN khuếch tán xuống thạch Càng xuống sâu, nồng độ KN thấp Tại vùng KN KT tương đương xuất đường tủa + Khuếch tán phiến kính đĩa Petri (Mancini) Phủ lớp mỏng thạch hòa KT lên phiến kính cho vào đĩa Petri Khi thạch đông, đục lỗ đựng KN theo nồng độ giảm dần Quanh lỗ xuất vòng kết tủa nơi lượng KN KT tương đương Nồng độ KN cao, vòng rộng - Kỹ thuật khuếch tán kép: KN KT khuếch tán thạch + Khuếch tán ống nghiệm Trong ống nghiệm, KN KT có lớp gel thạch Cả KN KT khuếch tán vào lớp gel Tại vùng KN, KT tương đương xuất đường tủa + Khuếch tán phiến kính đĩa Petri (Ouchterlony) Phủ lớp thạch mỏng lên phiến kính đĩa petri Sau thạch đơng, đục lỗ, lỗ đựng KN lỗ đựng KT KN KT khuếch tán xung quanh Nơi KN, KT gặp với nồng độ tương đương tạo thành đường tủa 9.3 Phản ứng trung hòa 9.3.1 Ngun lý KT đặc hiệu có khả trung hịa độc tố, độc lực VSV làm tính chất VSV sản phẩm 9.3.2 Các loại phản ứng a) Phản ứng trung hịa in vitro (trên dụng cụ thí nghiệm): Phản ứng ASLO, ngăn ngưng kết hồng cầu, trung hòa virus Phản ứng ASLO: Chẩn đoán thấp tim Liên cầu A KN Steptolysin O (SLO) + Hồng cầu →tan HC Cho huyết bệnh nhân (nghi ngờ có KT chống lại Streptplysin O (Antistreptolysin O (ASLO)) + SLO, ủ 370 C/30ph Sau cho thêm hỗn dịch hồng cầu, ủ 37℃/45ph Nếu HC tan: khơng có KT ASLO Nếu HC khơng tan: có KT ASLO trung hịa KN SLO, làm khả gây tan hồng cầu KN b) Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu chẩn đoán virus (cúm, sởi, Dengue…) Nguyên lý: Virus + HC → HC bị ngưng kết (Virus + KT mẫu) + HC Nếu HC bị ngưng kết, virus không tên với KT mẫu Nếu HC không bị ngưng kết, virus tên với KT mẫu Phản ứng ngưng kết hồng cầu Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu phát KT b) Phản ứng trung hoà invivo: Phản ứng trung hoà chuột lang xác định ngoại độc tố bạch hầu Phản ứng Schick •Xác định tình trạng cảm nhiễm bạch hầu •Tiêm vào da độc tố bạch hầu: Phản ứng (+): nơi tiêm quầng đỏ ≥ 10mm → thể chưa có KT kháng bạch hầu Phản ứng (-): nơi tiêm không quầng đỏ quầng đỏ < 10mm → thể có KT kháng bạch hầu 9.4 Phản ứng kết hợp bổ thể • Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu với tham gia bổ thể gây ly giải tế bào • Các thành phần phản ứng: - Hệ thống phản ứng: + KN biết chuẩn độ + Huyết bệnh nhân (KT?) - Hệ thống phát hiện: + Hồng cầu cừu (HC) + Kháng thể kháng hồng cầu cừu (KHC) - Bổ thể (C’): chuẩn độ trước hoạt động tự do, tham gia vào hệ thống phản ứng hệ thống phát Nếu tham gia vào hệ thống phát hiện: C’+HC+KHC → tan HC • Tiến hành phản ứng: - Bước 1: Cho KN, huyết cần xét nghiệm bổ thể ủ 37 ℃ /30 phút - Bước 2: Cho thêm HC + KHC vào hỗn hợp trên, ủ 37℃ /30 phút • Kết quả: - HC không tan chứng tỏ bổ thể sử dụng bước → huyết bệnh nhân có KT đặc hiệu với KN → Phản ứng (+) - HC tan chứng tỏ huyết bệnh nhân khơng có KT đặc hiệu với KN bổ thể hoạt động hệ thống phát làm tan HC → Phản ứng(-) 9.5 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang Chất đánh dấu chất màu huỳnh quang Phức hợp KN-KT-HQ phát kính hiển vi huỳnh quang 9.5.1 Phản ứng MDHQ trực tiếp Dùng KT gắn huỳnh quang (HQ) phát KN • Nguyên lý: KN phát nhờ KT mẫu gắn HQ • Các bước tiến hành: 9.5.2 Phản ứng MDHQ gián tiếp Dùng kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu HQ để phát KT • Nguyên lý: KT phát nhờ KN mẫu KKT mẫu gắn HQ • Các bước tiến hành: KTMDHQ trực tiếp, gián tiếp , sandwich 9.6 Phản ứng miễn dịch phóng xạ 9.6.1 Nguyên lý KT gắn chất đồng vị phóng xạ gặp KN tương ứng tạo thành phức hợp miễn dịch phát chất phóng xạ phát tia xạ, đọc máy đếm phóng xạ 9.6.2 Các phản ứng: Định lượng MDPX KN • Nguyên tắc: dùng KT biết gắn chất đồng vị phóng xạ để phát KN • Tiến hành: - Ủ KT biết vào giếng thử - Cho dịch cần tìm KN vào giếng thử, ủ, rửa thử - Cho KT đặc hiệu biết gắn chất phóng xạ I125 , ủ, rửa thử - Đếm độ phóng xạ đo giếng Mức phóng xạ tỷ lệ thuận với nồng độ KN Định lượng phóng xạ KT • Nguyên tắc: dùng KKT gắn chất đồng vị phát KT • Cách tiến hành: - Cố định KN biết vào giếng thử - Cho dịch cần tìm KT vào thử, ủ, rửa thử - Cho KKT biết gắn chất đồng vị phóng xạ - Đếm độ phóng xạ đo giếng Mức phóng xạ tỷ lệ thuận với nồng độ KT 9.7 Phản ứng miễn dịch enzym (elisa) 9.7.1 Nguyên lý Phức hợp miễn dịch KN-KT phát nhờ enzym gắn KT kháng kháng thể tác động lên chất đặc hiệu làm thay đổi màu chất, đọc máy quang kế đo mật độ quang học (OD) 9.7.2 Các loại phản ứng: 9.7.2.1 ELISA gián tiếp • Phát KT • KT máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN cố định sẵn giếng phiến nhựa Phức hợp KN-KT nhận biết kháng kháng thể người gắn enzym cho phản ứng màu với chất Giá trị mật độ quang phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng KT có mẫu thử Các bước tiến hành KT (bệnh nhân) Kháng KT người gắn E KN-KT-KKT-E 9.7.2.2 ELISA cạnh tranh • Phát KT • Nguyên tắc kỹ thuật dựa cạnh tranh KT có huyết bệnh nhân KT mẫu gắn enzym để gắn lên KN cố định giếng Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng KT có mẫu thử Các bước tiến hành - KN gắn lên giếng phiến nhựa - Huyết bệnh nhân (chứa KT cần tìm) cho KT mẫu có gắn enzym đem ủ - Đọc kết 9.7.2.3 ELISA Sandwich • Phát KN KT • Phát KN: KN có mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KT đặc hiệu gắn sẵn giếng phiến nhựa Phức hợp phát KT mẫu có gắn enzym cho phản ứng màu với chất Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng KN có mẫu thử Các bước tiến hành: • Phát KT: KT mẫu thử kết hợp đặc hiệu với KN cố định giếng phát KN gắn enzym Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng KT có mẫu thử Các bước tiến hành ELISA test ... virus không tên với KT mẫu Nếu HC không bị ngưng kết, virus tên với KT mẫu Phản ứng ngưng kết hồng cầu Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu phát KT b) Phản ứng trung hoà invivo: Phản ứng trung hoà chuột... thành hạt ngưng kết Ngồi tính đặc hiệu giưa KN KT, phải có thêm điều kiện: + KN KT đa giá (có nhiều vị trí kết hợp) + KN KT có nồng độ tương đương 9.1.3 Các loại phản ứng ngưng kết • Ngưng kết trực... cầu KN b) Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu chẩn đoán virus (cúm, sởi, Dengue…) Nguyên lý: Virus + HC → HC bị ngưng kết (Virus + KT mẫu) + HC Nếu HC bị ngưng kết,