Tiểu luận phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bật

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ((( Môn Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề Tài Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water Current Methods And Emerging Approaches (Phát Hiện Và Đếm Coliforms Trong Nước Uống Các Phương Pháp Hiện Thời Và Phương Pháp Tiếp Cận Nổi Bậc) GVGD MỤC LỤC 4Tóm Tắt 51 Giới thiệu 71 1 Coliforms là gì? 102 Mục tiêu 103 Phương pháp cổ điển 103 1.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM  Mơn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Đề Tài: Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches (Phát Hiện Và Đếm Coliforms Trong Nước Uống: Các Phương Pháp Hiện Thời Và Phương Pháp Tiếp Cận Nổi Bậc) GVGD: TP.HCM,THÁNG 11-2021 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm MỤC LỤC TĨM TẮT Giới thiệu 1.1 Coliforms gì? Mục tiêu 10 Phương pháp cổ điển .10 3.1 Kỹ thuật lên men nhiều ống .10 3.2 Kỹ thuật lọc màng 12 Phương pháp enzyme 15 4.1 Nguyên tắc chung 15 4.2 Kỹ thuật có/ khơng có diện vi khuẩn đếm kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme .17 4.3 MF kỹ thuật liên hợp với phát enzyme vi khuẩn .19 4.4 Xác định trực tiếp hoạt tính enzyme fluorimetry 20 4.5 Phát vi khuẩn phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn 21 4.6 Kết luận phương pháp enzyme 22 Phương pháp phân tử 23 5.1 Phương pháp miễn dịch 23 5.2 Phương pháp dựa axit nucleic 27 Kết luận 42 LỜI CẢM ƠN 45 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm TĨM TẮT Nhóm coliform sử dụng rộng rãi tiêu chất lượng nước phương diện lịch sử dẫn đến khái niệm bảo vệ sức khỏe cộng đồng Mục đích việc xem xét để kiểm tra phương pháp sử dụng đề xuất cho việc kiểm tra định lượng coliforms nước uống Trên thực tế, nhu cầu thử nghiệm nhanh hơn, nhạy cụ thể điều cần thiết ngành công nghiệp nước Các kỹ thuật thông thường thừa nhận rộng rãi, thảo luận, phương pháp bậc từ phát triển nghiên cứu gần Phương pháp truyền thống chấp nhận để phát coliform bao gồm kỹ thuật lên men nhiều ống (MTF) kỹ thuật màng lọc (MF) sử dụng môi trường nuôi cấy cụ thể điều kiện ủ khác Những phương pháp hạn chế, chẳng hạn thời gian ủ bệnh, can thiệp sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể việc phát vi sinh vật phát triển chậm phát triển tồn mà khơng ni cấy Ngày nay, kỹ thuật màng lọc đơn giản không tốn phương pháp sử dụng rộng rãi cho việc định lượng thông thường coliforms nước uống Việc phát coliforms dựa hoạt tính enzyme đặc trưng cải thiện độ nhạy phương pháp Các enzyme β-D galactosidase β-D glucuronidase sử dụng rộng rãi để phát định lượng coliforms tổng Escherichia coli, tương ứng Nhiều chất chromogenic fluorogenic dùng để phát cụ thể hoạt tính enzyme thử nghiệm mang tính thương mại khác dựa chất có sẵn Nhiều so sánh cho thấy thử nghiệm thay thích hợp cho kỹ thuật cổ điển Tuy nhiên, phương pháp đắt hơn, thời gian ủ, giảm, dài kết ngày Các công cụ phân tích tinh vi kỹ thuật đếm tế bào pha rắn tận dụng để làm giảm thời gian cần thiết để phát hoạt động GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm enzyme vi khuẩn, với ngưỡng phát thấp Phát coliforms phương pháp phân tử đề cập, phương pháp cho phát cụ thể nhanh chóng mà khơng cần ni cấy Ba phương pháp phân tử đánh giá đây: kỹ thuật miễn dịch, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) lai chỗ (ISH) Trong cách phương pháp miễn dịch, kháng thể khác chống lại vi khuẩn coliform tạo ra, việc áp dụng kỹ thuật thường cho thấy kháng thể mang tính đặc hiệu thấp PCR sử dụng để phát vi khuẩn coliform phương pháp khuếch đại tín hiệu: trình tự DNA mã hóa cho gen lacZ (gen b-galactosidase) gen uidA (b – D gen glucuronidase) sử dụng để phát tổng coliforms E coli, tương ứng Tuy nhiên, việc định lượng với PCR thiếu xác địi hỏi phải làm việc phịng thí nghiệm chuyên dụng Kỹ thuật FISH liên quan đến việc sử dụng đầu dò oligonucleotide để phát trình tự bổ sung bên tế bào cụ thể Đầu dò oligonucleotide thiết kế đặc biệt cho phạm vi phân tử RNA 16S Enterobacteriaceae sử dụng để kiểm soát chất lượng vi sinh mẫu nước uống FISH nên kỹ thuật cần quan tâm thay cho phương pháp nuôi cấy thông thường để xác định nhóm coliform nước uống, cung cấp liệu định lượng khoảng thời gian ngắn (6 – tiếng), đòi hỏi nỗ lực nghiên cứu Giới Thiệu Việc bảo vệ sức khỏe cơng đồng mơi trường địi hỏi nước uống phải an tồn, điều có nghĩa khơng chứa VSV gây bệnh Giữa VSV phân tán nguồn nước, VSV gây bệnh ruột loại dễ bắt gặp Như hệ quả, nguồn ô nhiễm phân nước dành cho hoạt động người phải kiểm soát chặt chẽ Tác nhân gây bệnh đường ruột, Escherischia coli O157: H7, thường diện nồng độ thấp môi trường nước hệ vi thực vật đa dạng Các phương pháp phức tạp đòi hỏi để phát chúng, phương pháp vơ tốn thời gian Hầu hết coliform diện với số lượng lớn hệ thực vật đường ruột người động vật máu nóng khác, GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm nên chúng tìm thấy phân thải Như hệ quả, coliforms, phát nồng độ cao vi khuẩn gây bệnh, sử dụng số thể diện tiềm ẩn tác nhân gây bệnh đường ruột môi trường nước Việc sử dụng nhóm coliform, cụ thể E coli, số vi sinh chất lượng nước có từ phân lập vi sinh vật từ phân vào cuối kỷ thứ 19 Coliforms thường tìm thấy môi trường tự nhiên đa dạng, vài lồi số có nguồn gốc từ đất, nước uống môi trường tự nhiên chúng Sự diện chúng nước uống phải coi mối đe dọa dấu hiệu vi sinh vật suy thoái chất lượng nước Số mẫu coliform tổng dương tính nguồn nước xử lý mà thường khơng có coliform việc xử lý khơng có hiệu quả, mát chất khử trùng, bị chọc thủng (McFeters cộng sự, 1986), xâm nhập nước ô nhiễm vào nguồn cung cấp nước sinh hoạt (Geldreich cộng sự, 1992; Clark cộng sự, 1996) vấn đề tái sử dụng (LeChevallier, 1990) hệ thống phân phối, và, hệ quả, không cho phép Việc sử dụng nhóm coliform số việc diện tác nhân gây bệnh đường ruột hệ thống thủy sinh đề tài tranh luận nhiều năm Nhiều tác giả báo cáo dịch bệnh qua đường nước họp quy định coliform nước (Payment cộng sự, năm 1991; Moore cộng sự, 1994; MacKenzie cộng sự, 1994; Gofti cộng sự, 1999) Tuy nhiên, mục đích viết để thảo luận khái niệm số, mà để xác định phương pháp sử dụng đề nghị cho việc theo dõi coliforms nước uống Sự cần thiết kiểm nghiệm nhanh nhạy không thay đổi ngành công nghiệp nước, với mục đích theo dõi trực tuyến liên tục nhà máy xử lý nước thải 1.1 Coliforms gì? Các nhóm coliform bao gồm đa dạng phong phú thuật ngữ chi loài, dù có khơng thuộc họ Enterobacteriaceae Hầu hết định nghĩa GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm coliforms chủ yếu dựa đặc tính sinh hóa thơng thường Trong phương pháp tiêu chuẩn cho việc kiểm tra nước nước thải (Part 9221 9222; APHA cộng sự, 1998),các thành viên nhóm coliform mơ tả sau: Tất kỵ khí hiếu khí tuỳ ý, gram -, khơng bào tử, vi khuẩn hình que lên men lactose sinh khí tạo axit vòng 48h 35oC (Kỹ thuật lên men nhiều ống; Phần 3.1) Tất hiếu khí kỵ khí nhiều tuỳ ý, gram âm, khơng bào tử, vi khuẩn hình que phát triển thành khuẩn lạc màu đỏ ánh kim vòng 24h 35 oC mơi trường loại Endo có chứa lactose (màng lọc kỹ thuật; Phần 3.2) Định nghĩa thành viên nhóm coliform gần mở rộng bao gồm đặc điểm khác, chẳng hạn phản ứng β-D-galactosidase dương tính (Part 9223; APHA et al, 1998) (kiểm tra enzyme nền, phần 4.2) Việc tìm kiếm vi sinh vật β-galactosidase dương tính đệm β-galactoside-dương tính cho phép bước xác nhận lên men lactose, kỹ thuật lên men nhiều ống sử dụng Các thử nghiệm cytochrome oxidase sử dụng thử nghiệm khẳng định để loại bỏ số vi khuẩn chi Aeromonas Pseudomonas mà lên men lactose Định nghĩa vi khuẩn coliform khác tùy thuộc vào quốc gia tổ chức chịu trách nhiệm quy định giám sát vi sinh Tại Canada, định nghĩa giống Mỹ, khác với số nước châu Âu Ví dụ, Hiệp hội Tiêu chuẩn Pháp (NFT90-413 NFT90-414; AFNOR, 1990), xem mơ hình đại diện cho luật pháp châu Âu, xác định coliforms tổng (TC) như:  Hình que, khơng bào tử, gram âm, oxidase âm tính, hiếu khí kỵ khí tuỳ ý Vi khuẩn phát triển diện muối mật chất có hoạt tính bề mặt thay khác có tác dụng ức chế tăng trưởng tương tự lên men lactose sinh khí sinh acid (hoặc aldehyde) vòng 48 37 ± 1oC GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm AFNOR (1990) xa cách định nghĩa nhóm coliform khác, bao gồm coliform chịu nhiệt (còn gọi coliforms phân, FC), cụ thể hơn, E coli là:  Coliforms chịu nhiệt có đặc tính lên men coliforms (TC), nhiệt độ 44 ± 0,5oC  E coli coliform chịu nhiệt, khác vài điều, tạo indole từ tryptophane nhiệt độ 44 ± 0.5oC, cho kết thử nghiệm methyl đỏ dương tính, khơng thể tạo acetyl-methyl carbinol không sử dụng citrate làm nguồn carbon Việc sử dụng nhóm coliform số nhiễm phân phải phụ thuộc vào quy định nghiêm ngặt phủ (Bảng 1) E coli coliforms phổ biến hệ thực vật đường ruột động vật máu nóng động vật diện liên quan chủ yếu đến ô nhiễm phân Do khơng phép có E coli nước uống Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) phê duyệt số phương pháp để phát coliform: kỹ thuật lên men nhiều ống, kỹ thuật màng lọc thử nghiệm có mặt /khơng có mặt (bao gồm thử nghiệm ONPG – MUG) AFNOR (1990) phê duyệt kỹ thuật lên men nhiều ống kỹ thuật màng lọc Các phương pháp có hạn chế, chẳng hạn thời gian ủ, can thiệp sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể nhóm coliform độ phát coliforms phát triển chậm bị tổn thương Vì thế, tùy thuộc vào hệ thống mơi trường, phần nhỏ (0,1-15%) tổng số quần thể vi khuẩn đếm phương pháp ni cấy (Amann cộng sự, 1990) Tỷ lệ vi khuẩn khơng ni cấy bị ảnh hưởng điều kiện không thuận lợi cho vi khuẩn phát triển suốt q trình ni cấy khả sống sót hoạt động chúng trạng thái khơng nuôi cấy (VBNC ABNC) (Roszak Colwell, 1987; Joux Lebaron, 2000; Colwell Grimes, 2000) GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Bảng Một số quy định chống nhiễm khuẩn hướng dẫn cho nước uống Coliform tổng Yêu cầu giám sát E.coli Mật độ Mẫu/tháng 0/100 ml (95%) United mẫu liên tiếp từ 0/100 vị trí khơng (100%) Statesa ml ≈ 1/1000 sinh vật có coliform 0/100 ml (90%) không nên chứa nhiều Canada b 10 CFU/100 ml 0/100 ml 9000 90 + (1/10000 sinh vật) a Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ năm 1990 b Bộ y tế Canada, 1996 c Tổ chức Y tế Thế giới, 1994 Mục Tiêu Vì nước uống chế độ nghèo dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy nhạy việc phát tế bào vi khuẩn bị tổn thương chết tạo hạn chế nghiêm trọng việc đánh giá thấp mức độ nhiễm Có tồn phương pháp khác mà sử dụng để phát coliform, trạng thái khác phát triển ứng dụng Đánh giá mô tả nguyên GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm tắc cách thức thông thường phương pháp cổ điển, số phương pháp đổi phương pháp tiếp cận Việc ứng dụng phương pháp khác để phát coliforms môi trường nghèo chất dinh dưỡng nước uống đánh giá dựa ưu điểm nhược điểm chúng Các tiêu chí giới hạn phát độ nhạy phương pháp, thời gian cần thiết để có kết kinh phí phịng thí nghiệm (bao gồm kỹ năng, lao động chi phí) thảo luận Phương Pháp Cổ Điển 3.1 Kỹ thuật lên men nhiều ống Kỹ thuật để đếm coliforms phương pháp lên men nhiều ống (MTF) sử dụng 80 năm phương pháp kiểm tra chất lượng nước Phương pháp bao gồm việc cấy loạt ống với dung dịch pha lỗng thập phân thích hợp mẫu nước Tạo bọt khí, hình thành axit tăng trưởng nhiều ống nghiệm sau 48 ủ 35 oC phản ứng dương tính Cả mơi trường dịch thể lactose lauryl tryptose sử dụng mơi trường nuôi cấy giả định, Seidler cộng (1981) Evans cộng (1981) can thiệp, với số lượng lớn vi khuẩn coliform, sử dụng mơi trường dich lỏng lactose Tất ống có phản ứng dương tính giả định tiếp sau phải thực thử nghiệm khẳng định Sự hình thành khí ống lên men chứa môi trường brilliant green lactose bile thời điểm vòng 48 35oC tạo nghiệm khẳng định dương tính Các thử nghiệm coliform phân (sử dụng mơi trường canh EC) áp dụng cho xác định colifom tổng (TC) mà cụ thể FC (APHA cộng sự, 1998): việc tạo khí sau 24 ủ 44,5 oC canh EC coi kết dương tính Các kết kỹ thuật MTF thể điều khoản số lượng xảy (MPN) diện vi sinh vật Con số ước lượng thống kê trung bình số coliform mẫu Hệ là, kỹ thuật đưa GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 10 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Mồi dựa gen lacZ sử dụng để phát vi khuẩn phương pháp giám sát coliform thường dựa sản phẩm biểu thức (bgalactosidase) gen (Bej et al, 1990, 1991a, b;.Fricker Fricker, 1994) Sản phẩm PCR kích cỡ khác (326 264 bp) tạo cách sử dụng cặp mồi khác kết phát TC với số lượng nhỏ tế bào 1/100 ml sử dụng đầu dò gen đánh dấu phóng xạ (Bej et al., 1990, 1991a) Fricker Fricker (1994) nghiên cứu đặc trưng mồi thiết lập Bej et al (1991a) 324 chủng trực khuẩn nuôi cấy Họ kết luận mồi nên phát triển từ mức dựa vào gen lacZ không cho phép phân biệt đối xử số chủng odorifera Hafnia alvei Serratia Để phát cụ thể vi khuẩn E coli, vùng gen malB mã hóa protein vận chuyển maltose chuỗi mục tiêu đề xuất (Bej et al., 1990) Khu vực bao gồm gen mà thịt cừu mã hóa protein bề mặt cơng nhận E coli- vi khuẩn cụ thể Tuy nhiên, thành viên Shigella Salmonella chi phát cách sử dụng mồi Việc sử dụng gen uidA sau đề xuất để phát vi khuẩn E coli (Bej et al., 1991a, b; Tsai cộng sự., 1993) Cả hai khu vực quy định (uidR) gen mã hóa uidA dase BD-glucuroni- (GUD) enzyme sử dụng sau có Một khu vực Amplified chi tiết: gen lacZ: mã hóa cho enzym b-galactosidase; gen cừu: mã hóa cho protein bề mặt cơng nhận cụ thể vi khuẩn E coli lambda; gen uidA: mã hóa cho enzym BD-glucuronidase; gen uidR: mã hóa cho khu vực quản lý uidA; gen phoE: mã hóa cho protein màng ngồi lỗ rỗng hình thành Thành cơng (Fricker Fricker, 1994; Juck cộng sự, 1996;.Iqbal cộng sự, 1997) Các cặp mồi cụ thể cho E coli Shigella spp Bej et al (1991b) báo cáo độ nhạy tốt phương pháp PCR so với kiểm tra bề mặt xác định dựa MUG- Nhiều chủng E coli MUG âm, bao gồm E coli GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 29 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm gây bệnh type huyết O157: H7, phát sau PCR cation amplifi- gen uidA Hơn nữa, Phong et al (1991) nhiều chủng MUG âm có gen uidA sản phẩm gen (enzyme b-D-glucuronidase) Cặp mồi khác thiết kế cho hai khu vực khác đề xuất để phát vi khuẩn E coli, số họ mã hóa cho protein bên màng (gen phoE) (Spierings et al., 1993) trình tự DNA mã hóa cho vùng V3 V6 gen 16S rRNA bệnh chủng không gây bệnh vi khuẩn E coli (Tsen et al., 1998) Những cặp mồi cho phép phát cụ thể vi khuẩn E coli, mà lồi vi khuẩn Shigella trình tự đề nghị khuếch đại Để tăng tính đặc hiệu việc phát phương pháp PCR, số tác giả đề xuất việc sử dụng phản ứng multiplex PCR, bao gồm đồng thời khuếch đại đoạn DNA khác Bej et al (1991b) sửa đổi phương pháp để phát trình tự gen liên quan đến nhóm TC người liên quan đến tác nhân gây bệnh đường ruột E coli, Salmonella spp Shigella spp Multiplex PCR khơng hoạt động tốt với tất hỗn hợp mồi, nhiên Thành phần chiều dài pri- mer oligonucleotide, kích thước mảnh vỡ AMPLI-fied, ảnh hưởng lẫn khuếch đại PCR Ví dụ, khuếch đại multiplex TC E coli thực nồng độ cân mồi cả, nồng độ mồi đẳng phân tử không cần thiết cho việc phát đồng thời Legion- viêm phổi Ella tất vi khuẩn thuộc chi (Bej et al., 1991a) Để phát mức thấp tác nhân gây bệnh vi sinh vật thị mẫu nước, bước tập trung lọc trước tiên phải thực Bej et al (1991a) báo cáo sử dụng phương pháp lọc phát hành DNA đóng băng tan băng xe đạp mà khơng ảnh hưởng đến khuếch đại PCR Khi trực quan sản phẩm PCR thực cách sử dụng lai tạo với đầu dị phóng xạ, phương pháp cho phép giới hạn phát lên đến tế bào / 100 ml Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp để theo dõi thường xuyên khó trực quan sản phẩm hóa hybrid- với đầu dị phóng xạ yêu cầu 2-3 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 30 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm ngày kể từ phơi nhiễm Hệ thống phát khơng phóng xạ, giống mồi biotinylated, thay hữu ích cho nhiều phát nhanh chóng DNA mục tiêu thăm dò lai Juck et al (1996) phát triển giao thức để phát nhanh chóng nồng độ thấp E coli mẫu nước dựa giao thức PCR lồng thay đổi giao thức lọc Bej et al (1991a) Nested PCR bao gồm hai vòng utive consec- khuếch đại PCR Việc chạy thực bình thường, với mồi ủ với khu vực mục tiêu cụ thể (mẫu) phần mở rộng cho sion mồi Vòng thứ hai sử dụng sản phẩm khuếch đại làm mẫu cho vòng ủ mở rộng với sơn lót khác Người ta thường liên minh sản phẩm kết khuếch đại thứ hai mảnh nội để sản phẩm vòng khuếch đại PCR Nested PCR tăng hiệu khuếch đại từ cấp địa phương phát sản phẩm PCR tạo vòng khuếch đạt mức độ phát vòng thứ hai.Việc sử dụng đoạn mồi lồng cung cấp cấp độ quốc Ngoài tính cụ thể kể từ vịng PCR thứ hai thực trình tự (plementary đồng để mồi bên trong) khuếch đại vòng Giao thức Nested PCR sử dụng để phát vi khuẩn E coli (Juck et al, 1996.) Và số tác nhân gây bệnh (Delabre et al, 1997.)Trong nước uống, Waage et al (1999a, b) áp dụng chúng vào việc phát số lượng thấp Salmonella spp Y enterocolitica tế bào vùng biển.Kỹ thuật cho phép phát nhanh (6-8 h) so với PCR thông thường (vài ngày), kể từ xác nhận chuỗi khuếch đại xác đầu dị lai khơng cịn cần thiết Mặc dù độ nhạy cảm mình, khó để sử dụng PCR để xác định số lượng vi sinh vật Hai kỹ thuật chủ yếu phát triển cho DNA định lượng phương pháp PCR: ( Toranzos et al, 1993) đại xảy ra, số lượng PCR PCR cạnh tranh (thêm đối thủ cạnh tranh cho giai đoạn DNA PCR để hiệu chỉnh hiệu PCR) (Zachar et al., 1993).Để kiến thức chúng tôi, kỹ thuật chưa áp dụng từ trước đến cho định lượng coliform nước uống.Như vậy, nay, dường định lượng mật độ coliform nước uống phương pháp GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 31 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm PCR.Cho đến nay, MPN-PCR khơng xác PCR cạnh tranh địi hỏi prepara- đáng kể trước đối thủ cạnh tranh DNA tốt áp dụng cho mẫu nước Một cách tiếp cận đầy hứa hẹn thời gian thực tích định lượng PCR, bao gồm giám sát sản phẩm fluores- cently PCR chúng khuếch đại (Heid et al., 1996) Động học sản phẩm PCR giai đoạn tích lũy theo cấp số nhân theo sau giai đoạn cao nguyên Sự xuất cao nguyên phụ thuộc vào nhiều thơng số sốt khơng kiểm sốt, chẳng hạn dimerization mồi xuất chất ức chế Cation thời gian thực quantifi- đáng tin cậy so với điểm cuối xác định số lượng phép đo thực giai đoạn theo cấp số nhân Nó phát vấn đề ition inhib- phản ứng PCR chất ức chế đồng tinh khiết với DNA Cách tiếp cận gần áp dụng cho việc phát enterohemorhagic enterotoxigenic E coli chủng vi sinh lâm sàng (Bellin et al, 2001; Carroll cộng sự, 2001.) Khi sản phẩm PCR khuếch đại nhuộm với thuốc nhuộm SYBR Green, sử dụng LightCycler (Roche, Mannheim, Ger- nhiều) GeneAmp (Applied Biosystems, Foster City, Mỹ), phương pháp PCR thời gian thực nhanh chóng độ nhạy cao độ đặc hiệu so sánh với xét nghiệm PCR song với phân tích gel truyền thống (Carroll et al., 2001) Tuy nhiên, phương pháp chưa áp dụng rộng rãi để phát cụ thể vi sinh vật nồng độ thấp mẫu mơi trường, phát triển tương lai Gần hơn, Tani et al (1998) đề xuất điều tra trực tiếp tế bào mục tiêu cách sử dụng trực tiếp xét nghiệm PCR chỗ Sự khuếch đại trình tự cụ thể thực từ gen đơn diện tế bào Các giao thức PCR thông thường phải sửa đổi để trình tự axit nucleic khuếch đại thể Với cố định permeabilization điều kiện thích hợp, mồi oligonucleotide thành phần phản ứng khác khuếch tán vào tế bào, xe đạp nhiệt, khuếch đại trình tự mục tiêu cụ thể Sản phẩm PCR dán nhãn digoxigenin-UTP (DIG- dUTP), mảnh vỡ chống DIG Fab 'liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng để phát kính hiển vi huỳnh GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 32 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm quang epifluores- Cách tiếp cận cho phép nhìn thấy trực tiếp sản phẩm khuếch đại huỳnh quang mức độ đơn bào điều tra trực tiếp dán nhãn tế bào Các tác giả áp dụng phương pháp PCR với enumera- trực tiếp E coli từ mẫu nước ngọt.Kết cho thấy tín hiệu cường độ huỳnh quang yếu tế bào mục tiêu.Tuy nhiên, họ kết luận phân tích hình ảnh cho phép điều tra trực tiếp tế bào mục tiêu E coli Mặc dù giao thức PCR chỗ dường ing promis-, khơng sử dụng cho việc phát thường xuyên đếm số vi sinh vật nước Nhiều hạn chế liên quan đến đặc điểm kỹ AMPLI-PCR DNA cần phải giải trước phương pháp sử dụng để phân tích nhạy cảm vi khuẩn mẫu nước uống Mặc dù phương pháp sử dụng với số thành công để phát E.coli coliforms, cần phải hầu hết nghiên cứu thực mẫu nước tăng vọt với chủng nuôi cấy vi khuẩn (Bảng 2) xác nhận khi, không, thực mẫu môi trường Mặc dù thực tế PCR công nhận phát xác định phương pháp cụ thể, trình bày số hạn chế áp dụng cho việc phát tế bào mẫu tự nhiên khả thi trao đổi chất hoạt động mà không bị culturable Thật vậy, khuếch đại PCR áp dụng acid nucleic chiết xuất từ tế bào sống culturable, khả thi không culturable hay chết Do đó, xét nghiệm PCR khơng thể cung cấp thơng tin tình trạng sinh lý tế bào mục tiêu Một hạn chế cố hữu để phân tích PCR mẫu môi trường ức chế thường xuyên phản ứng enzym: Các chất humic gọi (ASE Taqpolymer-) enzyme trùng hợp chất ức chế, chất keo có lực cao với DNA (Way cộng sự, 1993 ) Sự diện yếu tố mẫu nước đáng kể giảm suất khuếch đại PCR áp dụng để phát vi khuẩn pha loãng nhiều Họ hạn chế việc tiết lộ sản phẩm khuếch đại (Straub et al., 1995) GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 33 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 5.2.2 Kỹ thuật lai in situ (In situ hybridization techniques) ISH sử dụng đầu dò oligonucleotide để phát hiệnchuỗi axit nucleic bổsung Phương pháp khai thác khả axit nucleic để bám với cách bổ sung cụ thể để tạo giống lai Các đầu dò cụ thể chúng xây dựng từ, bổ sung vào, chọn nucleic acid chuỗi để đưa vi sinh vật, lồi nhóm Các đầu dị nhắm mục tiêu ADN phân tử RNA Sử dụng trình tự rRNA (5S, 16S 23S) để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài sở phân kỳ họ để phát triển thiết bị thăm dò lai tâm, thành lập (Amann et al, 1995.) Trình tự 2500 rRNA 16S lồi vi khuẩn trao gen có giá trị thơng tin cao mức độ phát sinh loài So sánh trình tự làm cho để xác định khu vực mục tiêu bảo tồn hoàn hảo mức độ phân loại khác cụ thể để cấp, từ tên miền để phân loài Cũng quan tâm mục tiêu phân tử rRNA mức cao phân tử rRNA bản, liên kết với số lượng lớn ribosome tế bào Số lượng ribosome khác nhau, thường từ 103 đến 105 vi khuẩn, theo loài trạng thái logic physio- tế bào, trực tiếp tương quan với tốc độ tăng trưởng tế bào (Amann et al., 1995) Đầu dòcụ thể để rRNA (chủ yếu 16S 23S rRNA CES tuần tự) trở thành công cụ tiêu chuẩn để xác định sinh vật (Olsen cộng sự, 1986.) Một số thiết bị thăm dò oligonucleotide thương mại hóa lựa chọn xem có nên sử dụng chúng hay thiết kế, người cụ thể phụ thuộc phần lớn vào ứng dụng Để tìm chuỗi mục tiêu liên tục cho vi sinh vật cụ thể, nhà nghiên cứu dựa vào máy tính hỗ trợ so sánh trình tự có sẵn sở liệu dự án ribosome (RDP) (Maidak et al., 1996), GenBank cho DNA (Benson et al., 1999), gói phần mềm ARB (Viện Max Planck, Bremen, Đức) Đối với đặc trưng tốt hơn, trình tự mục tiêu nên ngắn (15 đến 30 base) có 2-3 nucleotide khác với chuỗi sinh vật liên quan chặt chẽ (DeLong, 1993) Làm việc sớm chỗ lai dựa vào thăm dị phóng xạ để phát phát mục tiêu lai probe- (Olsen cộng sự, 1986.) Công việc rRNA GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 34 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm lai chỗ huỳnh quang sử dụng đầu dò nucleotide nhãn để phát hóa hybrid- (FISH) Sự phổ biến kỹ thuật FISH lợi nhãn phóng xạ, bao gồm độ nhạy, tốc độ trực quan tế bào đơn (bằng kính hiển vi thiết bị cytometrical), ổn định sản phẩm lai, an toàn, thời gian phát giảm đi, nhiều nhãn (nhiều màu sắc) dễ sử dụng (Richardson et al., 1991; DeLong, năm 1993; Swinger Tucker, 1996) Huỳnh quang thuốc nhuộm Rhodamine fluorochromes xuyên sử dụng độ thường xuyên (DeLong cộng năm 1989,; Amann cs, 1990; Manz cộng sự, 1992; Năm 1993; Wagner cộng sự, 1994), thuốc nhuộm CY3, sáng dẫn đến giảm huỳnh quang không đặc hiệu so với rochromes fluo- khác, gần thu hút ý nhiều (Wessendorf Brelje năm 1992; Glockner cộng năm 1996,; Zarda et al, 1997; Kalmbach cộng 1997a,; Ouverney Fuhrman, 1999) Trong thực tế, bước thủ tục cá là: cố định tế bào, lai (đặc nghiêm ngặt phụ thuộc vào nhiệt độ thời gian lai, nồng độ muối, nồng độ thăm dò chiều dài), rửa hậu lai (để loại bỏ ràng buộc không cụ thể tài liệu ràng buộc) phát Tế bào lai thường phát kính hiển vi epifluorescence counterstain DAPI (40,60-diamidino-2-phenylindole) màu cam acridine sử dụng để xác định tổng số tế bào Tùy thuộc vào nồng độ tế bào mục tiêu mẫu để tăng độ phân giải, phát cá thực phương tiện lưu lượng pha rắn đếm tế bào Đo dòng tế bào cho phép định lượng cường độ huỳnh quang cho mục tiêu thăm dò lai (Fuchs cộng sự, 1998.) Đối với TC, phát triển cụ thể 16S rRNA thăm dị cho nhóm khơng thể, kể từ nhóm coliform theo quy định ngành cơng nghiệp nước nhóm có chứa vi khuẩn từ chi phylogeneti- Cally khác Kết là, đầu dò (Bảng 3) phát triển cho họ Enterobacteriaceae cho TC Việc đầu tiên, Entero (Mittelman et al., 1997) phát triển để phát lâm sàng nhiễm trùng đường tiểu Thứ hai, ENT1 (Loge et al., 1999) phát triển cho ứng dụng mẫu nước thải Hai mẫu dò khác thành GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 35 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm phần họ điều kiện lai Các Entero thăm dò dài 25 base có hàm lượng C + G 48% so với 17 sở 70% C + G cho đầu dò ENT1 Nghiên cứu RDP (Maidak et al., 1996) cho thấy tính đặc hiệu cao đầu dị ENT1 cho lồi Enterobacteriaceae so với thăm dị Entero (Rompre' Baudart, NSERC Chủ tịch cơng nghiệp vào nước uống, Ecole Polytechnique Montreal,thong tin cá nhân) Trình tự rRNA thăm dò mục tiêu để phát vi khuẩn E coli công bố Các đầu dò EC1531 (Poulsen et al., 1994), bổ sung cho chuỗi 23S rRNA, bao gồm 20 nucleotide với nội dung C + G 55% Shi et al (1999) sử dụng đầu dò để phát vi khuẩn E coli sau thay đổi điều kiện lai, khơng có kết đề cập Các đầu dị sử dụng điều khiển thí nghiệm cách sử dụng mơ hình thu nhỏ chiết xuất tăng vọt với E coli DNA Gần hơn, Regnault et al (2000) phát triển thăm dò Colinsitu để phát vi khuẩn E coli E fergusonii nước tiểu, nước (sông nước thải) mẫu thực phẩm Các đồng Colinsitu thăm dò mang đến bổ chuỗi 16S rRNA bao gồm 24 nucleotide (C + G nội dung 46%) thăm dò cho thấy độ đặc hiệu tốt cho trực quan E coli từ phương tiện truyền thông khác thử nghiệm sử dụng thành công để phát vi khuẩn E coli nước uống mẫu (Delabre et al., 2001) Kỹ thuật FISH dường phương pháp phát cụ thể cấp độ tế bào; Tuy nhiên, có số hạn chế áp dụng cho việc phát chất dinh dưỡng bị bỏ đói tế bào vi khuẩn phổ biến drink- bảng Đầu dò oligonucleotide sử dụng để xác định Enterobacteriaceae E coli môi trường Thăm dị liên tục (50 -30) rRNA vị trí mục tiêu đặc tài liệu tham khảo  ENTEROa CATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCC 16S, 1458-1482 Enterobacteriaceae Mittelman et al, 1997 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 36 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm  ENT1 CCGCTTGCTCTCGCGAG 16S, 1273-1289 Enterobacteriaceae Loge et al, 1999  EC1531 CACCGTAGTGCTCGTCATCA 23S, 1531 - 1550 E coli Poulsen et al, 1994  COLINSINTU GAGACTCAAGATTGCCAGTATCAG 16S, 637-660 E coli Regnault et al, 2000  PNA thăm dò GCAAAGCAGCAAGCTC 16S, 71-86 E coli Prescott Fricker, 1999 Ở Entero cho khác biệt dễ dàng khơng có tên đưa tác giả nước Những hạn chế có liên quan đến nội dung ribosom vi khuẩn nhỏ số lượng nhỏ 16S rRNA mục tiêu tế bào, gây tín hiệu lai huỳnh quang yếu (Amann et al, 1995; Lebaron et al, 1997.) Đây có lẽ lý cá mô tả tài liệu nước uống vào lúc Kết là, hệ thống khuếch đại rescence fluo-, chẳng hạn nhiều thăm dị (thay monolabeled thăm dị kỹ thuật FISH ventional dựng), tính tương tác biotine - avidine phức tạp / cải ngựa trăm oxydase liên hợp với fluorochrome - tyramide- , đại diện cho cách để tăng cường độ tín hiệu huỳnh quang phát tế bào lai đói (Lebaron et al, 1997; scho nhuber et al, 1997.) Gần đây, Prescott Fricker (1999) báo cáo việc sử dụng axit nucleic peptide (PNA) thăm dò cho lai tạo chỗ phát vi khuẩn E coli nước máy Các kết lai tương tự người thu từ phương pháp đếm Một PNA axit nucleic tổng hợp, xương sống đường thay xương sống peptide Những lợi để sử dụng PNA thay đầu dị DNA bao gồm kháng tốt để nuclease công, hybrid- hóa độc lập với nồng độ muối, nhiều biệt ràng buộc cific trình tự thăm dị ngắn hơn, để đạt độ nhạy lớn Kể từ thăm dò PNA liên kết mạnh mẽ với trang web mục tiêu, phản ứng lai hồn thành thời gian ngắn (30 phút) Theo hiểu biết chúng tơi, ngoại trừ tàu thăm dị E coli GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 37 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm PNA (Prescott Fricker, 1999), không số thiết bị thăm dò sử dụng cho vi khuẩn vi khuẩn gây bệnh giám sát nước uống Trước họ chấp nhận phương pháp điều tra coliform nhạy cảm, họ phải phải chịu giai đoạn xác nhận để thăm dò phù hợp cho mẫu phân tích lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện lai cần thiết Khả di động câu hỏi lớn nảy sinh việc sử dụng cá để theo dõi ô nhiễm nguồn nước uống Nó thành lập nội dung rRNA tế bào vi khuẩn có tương quan trực tiếp với tốc độ tăng trưởng (Amann et al., 1995) Tuy nhiên, nội dung rRNA loại vi khuẩn khơng hồn tồn phản ánh tình trạng sinh lý Có vẻ số lượng nhỏ phân tử rRNA trì thời gian tương đối dài sau culturability S aureus E coli rRNA phát 48 sau kích hoạt vừa phải nhiệt tia UV (McKillip et al., 1998) Sheridan et al (1998) cịn tìm thấy vi khuẩn E coli 16S rRNA 16 sau ngừng hoạt động nhiệt mức 100, 80 60 C Cuối cùng, Prescott Fricker (1999) tiếp xúc với chủng E coli đến 1,5 mg / l clo 30 phút Sử dụng đầu dò PNA tyramide huỳnh quang hệ thống cation amplifi(TSA bộ; Perkin Elmer Khoa học đời sống, Ontario, Canada), họ vi khuẩn phát sau khử trùng clo, khơng có tế bào phát số lượng đĩa phương pháp Colilert Hai tuần sau khử trùng clo, 10% tế bào bị phát PNA thăm dị-TSA Điều xem lợi cho phương pháp hình thức colikhơng culturable phát hiện, bất lợi tế bào chết liệt kê Nghiên cứu sâu tình trạng sinh lý vi khuẩn liệt kê cá cần thiết để đến kết luận câu hỏi Một cách để nghiên cứu vấn đề vài kỹ thuật số khả thi trực tiếp (DVC) (Kog- ure et al., 1979) với phát FISH (Nishimura et al., năm 1993; Kalmbach et al., 1997b) Khớp nối gần áp dụng để phát vi khuẩn E coli nước uống Delabre et al (2001) Các tác giả thấy đáng kể cao E coli phong phú với giao thức họ số lượng CÁ coi phương GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 38 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm pháp phát tế bào đặc hiệu cao, tương đối dễ dàng để thực Các đặc trưng phát phụ thuộc vào đặc trưng tàu thăm dị oligonucleotidic tính chặt chẽ điều kiện sử dụng lai Cation Identifi- chuỗi mục tiêu cịn tẻ nhạt, nhiên, cá khơng thể áp dụng để phát phi phylogenetically xác định vi sinh vật, chẳng hạn vi khuẩn Trong trường hợp này, cơng việc thực nghiệp obacteriaceae, phylogenetically xác định nhóm gần mà coi số tiềm ô nhiễm phân Kết Luận Mục đích viết là: - Để truyền đạt inventory gần phương pháp phát nhóm coliforms, chủ yếu áp dụng cho phân tích chất lượng vi sinh - Để đánh giá hạn chế phương pháp độ nhạy ứng dụng Ngày kỹ thuật màng lọc phương pháp phổ biến cho việc đếm coliforms nước uống , kỹ thuật đơn giản, dễ thực khơng tốn kém, địi hỏi phải có thời gian ủ qua đêm ( 24-72 hơn) sau điều tra khuẩn lạc ban đầu, Hơn nữa, tiêu chuẩn media môi trường thạch sử dụng với kỹ thuật ức chế, coliforms yếu bị tổn thương phát triển môi trường đặc biệt như( m-T7) việc bổ sung hợp chất cụ thể ( pyruvate) nâng cao tỷ lệ phục hồi tế bào yếu bị tổn thương, Ngoài ra, thời gian thực dài, độ dài phụ thuộc vào thử nghiệm sinh hóa sử dụng cho bước xác nhận, cịn yếu tố hạn chế Những thách thức quan trọng phát triển phương pháp phát coliforms để cải thiện đặc tính phương pháp này, mà loại bỏ làm tốn thời gian, để đưa vào tế bào yếu bị tổn thương để giảm thời gian phân tích GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 39 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Một điều tra hoạt động enzyme cụ thể nên cải thiện độ nhạy việc phát EColi, sử dụng -D galactosidase -Dglucuronidase, Nhiều chất chromgenic chất huỳnh quang tồn cho việc phát hoạt động enyme thử nghiệm sở chất có sẵn, Rất nhiều so sánh thử nghiệm phương pháp tiêu chuẩn lựa chọn phù hợp với kỹ thuật MF, Các kiểm tra dễ dàng thực hiện, yêu cầu thiết bị, phịng thí nghiệm bản, hiển thị độ nhạy độ đặc hiệu cao, Tuy nhiên phương pháp đắc hơn, chí nhiều thời gian ủ giảm (khoảng 18h ) lâu để có kết ngày Phát coliforms phương pháp tiếp cận tìm hiểu enzyme mức độ tế bào kết hợp với đầu dò huỳnh quang đề xuất, phương pháp cho phép phát cụ thể nhanh chóng mà không cần bước nuôi cấy nào, thời gian thực phương pháp phát phát triển Van Poucke Nelis ( 2000a,b),Phương pháp tiếp cận cho phép tăng độ nhạy nhanh so với thử nghiệm khác Phương pháp miễn dịch, phương pháp phổ biến, dễ dàng áp dụng số hạn chế lien quan đến phản ứng chéo tế bào không mục tiêu kháng thể, Phương pháp PCR cung cấp phát mức độ đặc hiệu cao hơn, Neverless, phương pháp có hạn chế lớn áp dụng cho mẫu tự nhiên, bao gồm tỷ lệ khuếch đại thấp, liên quan đến diện chất ức chế thiếu thông tin hoạt động sinh lý tế bào Phương pháp PCR yêu cầu đội ngủ nhân viên có tay nghề cao khơng gian phịng thí nghiệm chuyên dụng thuốc thử cụ thể để tránh nhiểm bẩn mẫu AND bên ngoài, đặc biệt nested-PCR yêu cầu Phương pháp FISH cần xem xét phương pháp đếm thay cho việc điều tra coliforms nước uống, phương pháp định lượng vòng ngày Hiện việc sử dụng thiết bị thăm dị oligomicnucleonde cho việc đếm coliform khơng phổ biến Các vấn đề lớn với GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 40 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm việc áp dụng FISH để đếm tế bào có số phân mẫu nước uông lien quan đến tình trạng sinh lí vi khuẩn nước ng (do chất khử trùng) Trên thực tế tế bào vi khuẩn thường đặc trưng hàm lượng sibosome nhỏ, làm phức tạp việc phân tích positne fluoucseent signals Việc sử dụng đầu dò PNA thay DNA sử dụng hệ thấy khuếch đại huỳnh quang nên cường độ nhạy cao cường độ huỳnh quang positive signdes Việc áp dụng FISH mẫu nước uống đòi hỏi phải phát triển cao để đạt việc đếm tối ưu tế bào thiếu dinh dưỡng yếu Thường coliforms tìm thấy với số lượng nhỏ mẫu nước uống việc điều tra cấp độ tế bào tế bào mục tiêu lien quan đến việc lựa chọn Mới Joux and Lebara (2000) phân tích hạn chế số lượng chất lượng công cụ phân tích huỳnh quang khác (kính hiển vi huỳnh quang, flow cytometer, confocal scanning laser microscope and the new solid –phase laser scanning cytometer), Sự xuất phát thời gian thực phương pháp có lien quang đến cần thiết cho chuẩn đoán đánh giá tốt chất lượng vi sinh nước, Mục tiêu đạt thong qua gia tăng việc phát cụ thể giảm thời gian phân tích Tuy nhiên kỹ thuật phức tạp chi phí tương ứng cao hạn chế để trở thành phương pháp chuẩn hóa cho việc phát coliforms mẫu nước uống Hơn , với kiến thức có cơng việc ngoại trừ Delabre et al(2001) nghiên cứu, chưa chứng minh tỷ lệ đáng kể thị tế bào đựợc tìm thấy trạng thái khả thi hoạt động không culturable hệ thống phân phối, Nếu trường hợp, bước nghiên cứu đánh giá khả tác động tế bào sống hoạt động không khả gây bệnh, mà khả tái sinh GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 41 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm LỜI CẢM ƠN Đánh giá phần dự án nghiên cứu cách tiếp cận toàn diện để kiểm sốt tồn coliforms hệ thống phân phối nước uống hỗ trợ Vivendi Water-US-Filter, Tác giả cám ơn tiến sĩ Camper Dr.V.Gautheir cho rà sốt hữu ích họ thảo GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 42 ... khuẩn phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn 21 4.6 Kết luận phương pháp enzyme 22 Phương pháp phân tử 23 5.1 Phương pháp miễn dịch 23 5.2 Phương pháp. .. đổi phương pháp tiếp cận Việc ứng dụng phương pháp khác để phát coliforms môi trường nghèo chất dinh dưỡng nước uống đánh giá dựa ưu điểm nhược điểm chúng Các tiêu chí giới hạn phát độ nhạy phương. .. định phương pháp IFA trực tiếp kết hợp với phát ScanRDI1 Phương pháp tiếp cận nhiều giai đoạn áp dụng mẫu nước nhọn cho thấy mức độ cao nhạy cảm so với phương pháp dựa nuôi cấy Việc sử dụng phương