LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP :Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

TRƯỜNG………………… KHOA……………………… LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tách xác định β-Lactam đối tượng sinh học phương pháp điện di mao quản MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………… CHƯƠNG - TỔNG QUAN………………………………………… 1.1 Giới thiệu chất kháng sinh β-lactam…………………………………………5 1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới …… 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam…………………………….11 1.3.1 Phương pháp quang học ……………………………………………… 11 1.3.2 Phương pháp điện hóa ………………………………………………… 12 1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 12 1.3.4.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) …… 14 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………17 2.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu …………………………………………….17 2.1.1 Đối tượng ……………………………………………………………… 17 2.1.2 Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………17 2.2 Giới thiệu chung phương pháp Điện di mao quản ……………………… 17 2.2.1 Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản……………………… 17 2.2.2 Thiết bị phương pháp điện di mao quản………………………… 18 2.2.3 Các trình xẩy mao quản………………………………… 19 2.2.4 Sự phân loại hay kiểu (mode) phương pháp điện di mao quản…………………………………………………………………………… 29 2.2.5 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 20 2.2.6 Phân tích định lượng phương pháp điện di mao quản………….26 2.3 Thực nghiệm…………………………………………………………………… 27 2.3.1 Máy móc dụng cụ …………………………………………………….27 2.3.2 Hóa chất ………………………………………………………………….27 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………….29 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β - Lactam …………………… 29 3.1.1 Chọn bước sóng phát chất …………………………………………29 3.1.2 Mao quản xử lý mao quản trước tách………………………… 30 3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu ………………………………………… 31 3.1.4 Độ điện di độ điện di hiệu dụng …………………………………… 32 3.1.5 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di …………………………….33 3.1.6 Ảnh hưởng thành phần dung dịch đệm ………………………… 36 3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất tạo mixen SDS ……………….37 3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm…………………………………40 3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu ………………………………43 3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng điện di ……………………………………….45 3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mao quản …………………………47 3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu ……………………………………………….50 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích …………………………………………… 51 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn …………………… 51 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng đường chuẩn (LOQ)………………………………………………………………………… 54 3.2.5 Độ xác phép đo ………………………………………………55 3.2.6 Độ lặp lại phép đo ………………………………………………… 57 3.3 Phân tích mẫu thực …………………………………………………………… 59 3.3.1 Phân tích mẫu thuốc …………………………………………………….59 3.3.2 Phân tích mẫu máu …………………………………………………… 63 3.4 Ưu nhược điểm phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) …………………………………………………………………… 64 3.5 Hướng phát triển đề tài ………………………………………………… 65 PHỤ LỤC ……………………………………………………………… 71 MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội ngày phát triển vấn đề sức khỏe người ngày trọng đặc biệt sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe β-Lactam thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho người, thú y từ chúng giới thiệu thị trường vào năm 1938 loại kháng sinh dùng nhiều Liều lượng cách dùng kháng sinh không dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ việc chữa trị bệnh khó khăn Ngồi cịn gây lãng phí cho người bệnh có bệnh virut không chữa kháng sinh dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đốn bệnh ảnh hưởng sức khỏe người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh máu gây bệnh thận, đặc biệt người cao tuổi Vì kiểm sốt phân tích thuốc kháng sinh người bệnh biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu sử dụng chúng Ở Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu tách xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm môi trường chủ yếu cơng trình phân tích sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Phương pháp HPLC phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm thời gian phân tích ngắn Tuy nhiên phương pháp có số nhược điểm phải sử dụng lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao Ngược lại, phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng lượng hóa chất khơng đáng kể, tiết kiệm chi phí từ – lần, lượng mẫu bơm nhỏ HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao Tách xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) mẫu dược phẩm sinh học hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm phương pháp ngày thơng dụng áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Vì chúng tơi định chọn đề tài “ Tách xác định β-Lactam đối tượng sinh học phương pháp điện di mao quản” CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25] Là kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem hai nhóm sử dụng phổ biến lớn penicillin cephalosporin Các penicillin thu từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA) Các cephalosporin tự nhiên phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ kháng sinh thiên nhiên Cấu trúc phân loại: * Các penicillin Các penicillin có cấu trúc gồm vòng: vòng thiazolidin, vòng βLactam R CO S N H CH3 N CH3 O COOM Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức penicillin chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay R gốc khác nhau, cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có penicilin có độ bền, dược động học phổ kháng khuẩn khác Với M gốc cation thường là: K, Na, H Nhóm kháng sinh penicillin chia thành nhóm với hoạt tính khác Bảng 1.1 Phân loại cấu trúc số penicillin R tự nhiên Hoạt tính CH2- Penicillin Nhóm penicillin kháng penicilliiase Nhóm penicillin Tên kháng sinh Gồm Penicillin tự G nhiên dẫn chất.Phổ Benzyl (PENG) hẹp: vi khuẩn gram(+) Benzathin Không kháng β- lactamase CH3 C- Oxacillin Là Penicillin bán N O (OXA) 6-[(5-methyl-3-phenyl1,2-oxazole-4-carbonyl)amino] Cl nhóm I C- động vào vịng Cloxacillin CH3 (CLO) Kháng penicilliiase, không tác O N tổng hợp Phổ hẹp β – Lactam 6-{[3-(2-chlorophenyl )5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino} NH2NH2 Nhóm penicillin phổ rộng CH- Ampicillin (AMP) 6-([(2R)-2-amino-2- khuẩn gram (+) (-) phenylacetyl]amino) Amoxicilli n (AMO) Phổ rộng, tác dụng NH2NH2 Không CH- lactamase kháng penicilliiase HO 6-{[(2R)-2-amino-2-(4hydroxyphenyl)-acetyl]amino} βvà * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm vòng: vòng β-Lactam cạnh gắn với dị vịng cạnh, cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác gốc R R2 S R1 CO N H N5 O R3 COOM Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung cephalosporin chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi gốc R, cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn dược động học khác Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia cephalosporin thành hệ Các cephalosporin hệ trước tác dụng vi khuẩn gram dương mạnh hơn, gram âm yếu hệ sau Trong luận văn này, chúng tơi trình bày hệ I (CEP) hệ III (CEF) Bảng 1.2 Phân loại cấu trúc số cephalosporin Thế hệ Kháng sinh I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng Cephalexin mạnh vi khuẩn gram (+), (CEP) R1 CHNH2 yếu gram (-) Không bền dễ bị β-lactamase phá hủy R2 R3 H -CH3 III: Tác dụng tốt vi khuẩn gram Cefixim (-), vi khuẩn gram (+) tác (CEF) H2N N H -CH=CH2 S N HOOCCH2O dụng penicillin cephalosporin hệ I Bền với βlactamase Tính chất: Các β-lactam thường dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit tan nước, dạng muối natri kali dễ tan; tan metanol số dung môi hữu phân cực vừa phải Tan dung dịch axit kiềm loãng đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH –NH2 Cực đại hấp phụ chủ yếu nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, dịch chuyển sang bước sóng ngắn dài, giảm độ hấp thụ) Các β-lactam axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong mơi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh tác dụng Bảng 1.3 Hằng số axit kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 PEN 2.74 AMO 2.8 CLO 2.7 AMP 2.7 CEP 2.6 CEF 2.75 OXA 2.72 Tác dụng: Cơ chế: Các penicillin có khả acyl hóa D- alanin tranpeptidase, làm cho q trình tổng hợp peptidoglycan không thực Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại Ít tác dụng vi khuẩn gram (-) Mặc khác, penicillin hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết vi khuẩn bị tiêu diệt Ngăn cản xây dựng giảm độ bền mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm tồn phát triển vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh β-lactamase, enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh tác dụng Tất cách kháng không sinh β-lactamase để thực gọi kháng gián tiếp (được gọi kháng methicillin) Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm sốc phản vệ Thuốc khơng dùng cho trẻ sơ sinh thời kỳ cho bú Chống định dị ứng với thành phần thuốc 1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới Như cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động chế khác vi trùng khác Kháng sinh có tác dụng với bệnh vi trùng (bacteria), khơng có tác dụng với bệnh siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết tin tưởng sai lầm, nên khắp nơi giới, nước phát triển, người ta dùng kháng sinh nhiều, không cần thiết, không định không cách Năm 2000, bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, nửa đến 2/3 số toa coi không cần thiết.Theo R Gonzales [6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ngoại chẩn cho viêm đường hô hấp 60% trường hợp viêm đường hô hấp siêu vi, không cần không điều trị kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng xuất vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo A.W McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao Các vi trùng kháng thuốc không khu trú địa phương với phương tiện giao thơng mau lẹ, vi trùng di chuyển đến khắp nơi giới vòng 24 D.P Raymond [17] năm Hoa kỳ có triệu người bị nhiễm trùng lây lan bệnh viện, nửa số vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người làm tốn ngân sách từ đến 10 tỉ đô-la Tại Việt Nam, theo báo cáo Nguyễn Kim Phượng J Chalker [4], năm 1997 23 trạm y tế Hải phòng, 69% bệnh nhân cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh liều lượng thời gian (dưới ngày) Theo [4] Qua thống kê khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, 70% bệnh nhân dị ứng dùng kháng sinh, có khơng trẻ em Sốc phản vệ dùng kháng sinh tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần bị kháng hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc Ampiciline 88%, Amoxiciline 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc Ampiciline gần 97% Amoxiciline 42% Các nhà chuyên môn báo động hậu nguy hiểm lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm Năm 1981, sau hội nghị Santa Domingo, nhà chuyên môn thành lập “Liên Hiệp Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the 10 Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại lan tràn bệnh vi trùng kháng thuốc nước phát triển Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đề “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh” Kế hoạch đề cập đến hoạt động y tế tất quốc gia phát triển phát triển: Phịng thí nghiệm phải tăng cường khả chẩn đốn bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đốn nhanh chóng xác, đo lường độ nhạy kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa lưu hành thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành nước phát triển thuốc giả mạo, khơng phẩm chất, hàm lượng khơng có hoạt chất…… Nếu ngăn ngừa phát triển vi trùng kháng thuốc bảo vệ mơi trường sống, trì hữu hiêu kháng sinh, hạn chế chi phí y tế cứu đươc nhiều sinh mạng 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1 Phương pháp quang học Phương pháp đo quang phương pháp phân tích dựa tính chất quang học chất cần phân tích tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, ứng dụng nhiều xác định β-lactam, đặc biệt dược phẩm Các β-lactam hấp thụ UV không nhiều cực đại hấp thụ, chúng tạo phức với số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy phép đo Trong nhiều trường hợp, β-lactam thủy phân thành chất đơn giản để phân tích Các phương pháp phát quang dùng xác định β-lactam với độ nhạy cao dựa đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa βlactam A Fernández-González cộng [11] dùng Cu2+ thủy phân tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát thu 11 4.10-7M (0.16 mg/l) Phương pháp kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP thuốc uống, huyết thanh… Theo [18], F Belal cộng xác định AMO AMP thuốc uống phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến thủy phân kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau thêm PdCl2, KCl 2M Kết tạo phức màu vàng đo bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l giới hạn phát AMP 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l Wei Liu cộng [28], sử dụng phản ứng quang hóa β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp phân tích số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) sữa đạt độ nhạy cao: PEN 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP Kết kiểm chứng lại phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP mẫu 0.1 mg/l Tuy nhiên, không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, phương pháp quang học chủ yếu dùng xác định riêng rẽ chất kháng sinh đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định xác Ngồi ra, nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân phát hạn chế phương pháp 1.3.2 Phương pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa ứng dụng để phân tích β-lactam khơng phổ biến nhiều Theo [7], Daniela P Santos cộng sử dụng sensor điện phân tích AMO, đạt giới hạn phát 0.92 μM (0.39 mg/l) môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2 1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trong năm gần đây, phương pháp HPLC đóng vai trị vơ quan trọng việc tách phân tích chất lĩnh vực khác nhau, việc tách phân tích lượng vết chất Phương pháp HPLC với cột tách pha 12 đảo sử dụng rộng rãi để xác định kháng sinh β-lactam loại mẫu khác có nhiều ưu so với phương pháp khác có độ xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối máy HPLC cho phép phát xuất chất sau rửa giải Hiện có nhiều loại detector sử dụng cho mục đích mở rộng khả phân tích nhiều loại chất phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) lựa chọn ưu tiên phát phân tích chất đối tượng phức tạp Theo [29], Blanchflower WJ cộng dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin thịt, thận sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát sữa 2-10 μg/kg, thịt 25100 μg/kg J.M Cha cộng [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam nước sơng nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát phương pháp – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, – 15 ng/l với nước thải sau xử lý Một detector quan trọng phương pháp HPLC detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như [16] C.Y.W Yang cộng dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, μm) phân tích AMO sữa bị (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát 0.5 μg/kg 0.3 μg/kg Tuy vậy, β-lactam tạo phức phát huỳnh quang chế phát quang dựa phản ứng quang hóa [24, 16] 13 nên áp dụng với số chất phân tích riêng chất không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh lúc Tác giả Ngô Quang Trung [5] xây dựng quy trình phân tích đồng thời kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG nước thải bệnh viện khu vực Hà Nội Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10% Detector UV-VIS đo bước sóng 212 nm Xây dựng đường chuẩn kháng sinh khoảng 0.1 – mg/l, hệ số tương quan R > 99.8% Giới hạn phát LOD LOQ 0.4 0.1 mg/l Ngồi ra, cịn dùng detector khác detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích β-lactam Nói chung, phân tích kháng sinh đối tượng mẫu phức tạp thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu phương pháp đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp kháng sinh liên kết chặt chẽ với mẫu có nhiều chất nhiễu cần loại trừ 1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE sử dụng rộng rãi tính chất ưu việt hiệu tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn Phương pháp ứng dụng để tách xác định kháng sinh β-lactam nhiều đối tượng mẫu khác L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5 Tiến hành phân tích điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s Phương pháp cho phép tách kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V CLO ứng dụng phân tích mẫu nước thải trang trại chăn nuôi Giới hạn phát từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch 14 chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15% Độ thu hồi 96% Biyang Deng cộng [15] sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO nước tiểu người với giới hạn phát thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng μg/l – mg/l độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối khơng lớn 2.2% thời gian phân tích ngắn phút/ mẫu Attila Gaspar cộng [14] tách xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8 Phương pháp tách 14 kháng sinh vòng 20 phút, giới hạn phát 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát 0.42 – 1.62 mg/l Trong CEP CEF có giới hạn phát tương ứng 1.62 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính – 200 mg/l Mục đích phương pháp ứng dụng để nghiên cứu độ bền kháng sinh họ Cephalosporins nước nhiệt độ khác (+25, +4 -180C) Kết cho thấy kháng sinh giảm nồng độ khơng lớn 20% nhiệt độ phịng sau pha loãng M.I.Bailon-Perez cộng [22] sử dụng phương pháp CZE detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin mẫu nước ( nước sông, nước thải…) Giới hạn phát tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp 10% Phương pháp MEKC M.I Bail´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C Cruces-Blanco [23] xác định loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu chọn 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất 15 điện di điện di 25 kV Giới hạn phát LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7% Độ thu hồi từ 91 – 95.6% .Nhìn chung, phương pháp quang học phương pháp điện hóa dễ tiến hành, đơn giản xác định chất riêng rẽ, điều khó cho việc phân tích mẫu có đa thành phần Với phương pháp HPLC kết tách tốt, độ xác, độ nhạy cao giá thành chi phí phân tích mẫu lớn Vì phương pháp MEKC bước phát triển khắc phục nhược điểm phương pháp quang, điện, HPLC mà kết đáng tin cậy Trong luận văn này, nghiên cứu theo hướng tác giả L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [21], M.I Bail ´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C Cruces-Blanco [23] mẫu dược phẩm sinh học 16 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng Xác định hàm lượng kháng sinh mẫu thuốc mẫu máu mảng đề tài thực tế quan trọng Như đã đề cập luận văn này, vấn đề lạm dụng không hàm lượng kháng sinh đem lại nhiều tác hại ảnh hưởng đến sức khoẻ người Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chọn để nghiên cứu penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin (AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) kháng sinh β-lactam sử dụng phổ biến 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung đề tài cần giải là: - Lựa chọn phương pháp nghiên cứu phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với detector DAD - Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách kháng sinh -lactam tách xác định đồng thời kháng sinh -lactam như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ… - Đánh gía thống kê phương pháp phân tích - Áp dụng phân tích số mẫu thuốc mẫu máu - Đánh giá ưu khuyết điểm phương pháp 250C 2.2 Giới thiệu chung phương pháp Điện di mao quản [7,8,20] Để thực nhiệm vụ luận văn, kỹ thuật tách chọn phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 2.2.1 Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản 17 - Nguyên tắc tách: dựa sở tính chất điện di (sự di chuyển Mobility) phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) mao quản (đường kính 25 - 100 m ID) dung dịch chất điện giải có chất đệm pH thích hợp, tác dụng từ trường điện E định cung cấp nguồn cao chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa CEC kỹ thuật tách thực mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển tách chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, tốn mẫu hố chất khác phục vụ cho tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, tách chất xẩy nhanh hiệu cao - Cơ chế điện di: Sự điện di phần tử chất tan (các ion) ống mao quản chế di chuyển khác chất tan ( chất phân tích ), tác dụng lực điện trường E định (Electric Field Force: EFF) tính chất (đặc trưng) dịng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), phụ thuộc vào điện tích kích thước chúng (Trong dòng EOF gọi dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm) 2.2.2 Thiết bị phương pháp điện di mao quản - Trang thiết bị hệ: Theo nguyên tắc, để thực điện di, hệ thống máy phải có phận sau: Buồng điện cực, bình điện di điện cực trơ (Au hay Pt), Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt mao quản), Nguồn cấp cao chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển trình điện di (sắc ký) chất, Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách), Bộ phận phát chất sau tách (detector), Bộ phận điều nhiệt cho mao quản, Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách chất hỗn hợp mẫu Các phận xem sơ đồ ngun lý mơ tả hình 18 Hình 2.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 2.2.3 Các trình xẩy mao quản Trong trình điện di, tác dụng lực điện trường E, điện V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, mao quản có trình là: Sự xuất lớp điện kép sát thành mao quản, Trong mao quản có dịng điện i (5 – 200 A), Xuất dòng điện di thẩm thấu, EOF, Sự tương tác chất mẫu pha động (MP) với thành mao quản, Sự khuếch tán, hay hội tụ vùng mẫu chất, di chuyển, Sự phân bố chất pha (động tĩnh), mao quản có pha tĩnh thật hay pha tĩnh giả (Mixen, hệ MEKC), Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên, Sự phân tán, gradient truyền nhiệt từ tâm mao quản xung quanh Sự di chuyển (sự điện di) chất (như ion âm, ion dương, phần tử trung tính) mao quản Đây q trình tạo sắc ký chất Nhưng trình (1-8) lại có tương tác ảnh hưởng đến trình 9, làm tốt làm xấu trình điện di chuyển chất 19 Đó q trình ln xẩy mao quản HPCEC Trong trình xẩy đó, có q trình dẫn đến tách chất, trình khác (1-8) lại ảnh hưởng đến trình 9, trực tiếp, gián tiếp Vì thế, muốn có kết điện di tốt, thiết phải xem xét tất q trình yếu tố liên quan đến q trình mao quản Tức phải tối ứu hoá điều kiện điện di cho loại đối tượng mẫu chất cần xác định, để có hiệu tách cao 2.2.4 Sự phân loại hay kiểu (mode) phương pháp điện di mao quản Sắc ký điện di mao quản đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh phức tạp, tuỳ theo chế, chất, đặc điểm tách (sự điện di) xẩy ống mao quản mà người ta thường phân chia thành loại hay kiểu (Mode) khác nhau, gán cho kiểu tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt sử dụng chúng cho thích hợp Cụ thể kiểu là: Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE) Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE) Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary ElectroKenetic:MEK hay MCEK) Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE), Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF) Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP) 2.2.5 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết ngắn gọn MEKC) kiểu kỹ thuật tách theo chất điện di có sử dụng kết hợp tính chất kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh Nó kiểu tách sắc ký (separation mode) kỹ thuật CE ứng dụng rộng rãi sinh học, y học dược Nó kiểu 20