SỮA CÔNG THỨC DẠNG BỘT CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL NATRI DODECYL SULFAT (SDS-CGE)

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA Dự thảo TCVN ………:2019 Xuất lần SỮA CÔNG THỨC DẠNG BỘT CHO TRẺ SƠ SINH – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL NATRI DODECYL SULFAT (SDS-CGE) Milk-dased infant formula powders – Determination of whey protein content by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) method HÀ NỘI – 2019 TCVN :2019 TCVN :2019 Lời nói đầu TCVN :2019 xây dựng sở tham khảo AOAC 2016.15 Quantification of whey protein content in Milk-based infant formula powders Sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) method; TCVN :2019 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN :2019 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN :2019 Sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh – Xác định hàm lượng whey protein phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfat (SDS-CGE) Milk-dased infant formula powders – Determination of whey protein content by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) method CẢNH BÁO  Phải sử dụng tiêu chuẩn an toàn cá nhân mơi trường tiến hành phương pháp Nhân viên phịng thí nghiệm xử lý dung mơi, axit thuốc thử phải hiểu biết nguy tiềm ẩn chúng Tham khảo Bản an toàn vật liệu (MSDS) để biết thông tin mối nguy thực biện pháp phịng ngừa thích hợp Chuyển dung mơi, bao gồm β-mercaptoethanol axit, bên tủ hút máy chiết hiệu Vì tích tụ β-mercaptoethanol, nên thực phân tích phịng thơng gió tốt Tốt nhất, lắp máy trực tiếp tủ hút Đảm bảo tất đồ thủy tinh không bị sứt mẻ có vết nứt Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng whey protein sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh điện di gel natri dodecyl sulfat (SDS-CGE) Tiêu chuẩn xác định tỷ lệ whey protein với casein khoảng từ 20:80 đến 80:20 Tiêu chuẩn khơng sử dụng để phân tích protein thủy phân protein thực vật sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh Nguyên tắc Các protein mẫu bị biến tính chất hoạt động bề mặt anion SDS khử βmercaptoethanol Các protein liên kết với điện tích SDS di chuyển điện trường chứa đầy gel phân TCVN :2019 tách phát detector UV 220 nm Casein whey protein tách thành hai nhóm khác nhau, khơng chồng pic, tỷ lệ tính dựa diện tích pic mà khơng cần đường chuẩn Hệ số hiệu chỉnh khối lượng diện tích (CF) 1,4 sử dụng cho whey protein so với casein phép tính hàm lượng whey protein Thuốc thử vật liệu thử Tất thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác 3.1 Đệm gel natri dodecyl sulfat-khối lượng phân tử (SDS-MW) 3.2 Bộ phân tích nhanh SDS-MW, bao gồm mao mạch trần (bar), cột mao quản silica nung chảy (đường kính 50 μm, dài 30 cm); Bộ đệm gel SDS-MW (3.1); Đệm mẫu SDS-MW (100 mM tris – HCl, pH 9,0; với SDS %); dung dịch nội chuẩn protein 10 kDa (3.3); dung dịch rửa axit (HCl 0,1 M); dung dịch rửa kiềm (NaOH 0,1 M ) SDS-MW cỡ tiêu chuẩn (10 kDa đến 225 kDa, 16 mg/ml) 3.3 Dung dịch nội chuẩn protein, 10 kDa 3.4 Nước loại ion, lọc qua màng lọc 0,45 μm 3.5 β-mercaptoetanol Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Proteome Lab PA 800 Plus tương đương trang bị detector UV cài đặt bước sóng 220 nm Diện tích pic tích phân phần mềm phù hợp 4.2 Cân phân tích, cân xác đến 0,0001 g 4.3 Nồi cách thủy kiểm soát nhiệt độ, 100 °C ± °C 4.4 Máy ly tâm, dùng cho lọ nhỏ dung tích 1,5 ml 4.5 Máy trộn vortex 4.6 Pipet điều chỉnh, có dung tích thích hợp 4.7 Lọ ly tâm, có nắp đậy kín, dung tích 2,0 ml 4.8 Ống ly tâm, đáy trịn, dung tích 10 ml TCVN :2019 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phịng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu khơng bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm bên có liên quan nên thoả thuận với vấn đề Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị dung dịch đệm dung dịch mẫu 6.1.1 Nạp thuốc thử vào đầu vào (trái) đầu (phải) hệ thống khay đệm  khay đệm xếp theo cấu hình nêu Phụ lục A (cấu hình khay đệm) Nếu sử dụng hệ thống tương đương làm theo hướng dẫn hệ thống 6.1.2 Dùng cân (4.2) cân khoảng 135 mg  mg sữa bột tách chất béo (hàm lượng protein khoảng 37 %) 500 mg ± 20 mg bột thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh (hàm lượng protein khoảng 11 %) vào ống ly tâm 10 ml (4.8) 6.1.3 Pha loãng mẫu đến ml cuối nước loại ion Trộn ống máy trộn vortex (4.5) dung dịch đồng Mỗi dung dịch cuối chứa từ 10 mg/ml đến 15 mg/ml protein 6.1.4 Chuẩn bị mẫu rửa giải sơ cách trộn % dung dịch natri dodecyl sulfat (SDS) với dung dịch nội chuẩn peptit 10 kDa tỷ lệ 84:1 Tổng thể tích dung dịch rửa giải sơ dựa tổng số mẫu phân tích mẫu (90 μl/mẫu) 6.1.5 Dùng pipet (4.6) lấy 10 μl dung dịch mẫu vào lọ ly tâm (4.7) riêng biệt 6.1.6 Lần lượt thêm 85 μl mẫu rửa giải sơ μl β-mercaptoetanol (3.5) vào lọ máy ly tâm (4.4) Trộn kỹ trước đun nóng lọ nồi cách thủy (4.3) 100 °C ± °C 10 Để nguội đến nhiệt độ phịng, sau ly tâm nhiệt độ phịng khoảng 000 r/min 6.1.7 Trộn máy trộn vortex (4.5) trước chuyển mẫu vào lọ bơm mẫu tương ứng 6.2 Tiến hành phân tích 6.2.1 Thiết lập phương pháp tách tối ưu để phân tích mẫu, bao gồm mẫu trắng dung dịch đệm (10 μl nước), MW kích thước chuẩn mẫu sữa bột tách chất béo TCVN :2019 6.2.2 Đối với chu trình tách (45 min), trước tiên hoạt hóa mao quản dung dịch rửa min, dung dịch rửa axit min, nước dung dịch đệm gel SDS 10 Thiết lập chương trình tách 30 6.2.3 Điện di mẫu điện –5 kV 20 s 6.2.4 Thực điện di điện không đổi với cường độ điện trường -497 V/cm mao quản giữ nhiệt 25°C dịch làm mát tuần hồn 6.2.5 Dịng điện tạo phải xấp xỉ 27 μA 6.2.6 Thông thường vial thuốc thử thực cho lần phân tích, nên cần tăng lượng vial thuốc thử có nhiều mẫu phân tích 6.2.7 Kiểm tra phù hợp hệ thống thử nghiệm cách sử dụng đánh dấu MW Tiêu chí chấp nhận phù hợp hệ thống sau: a) Thời gian di chuyển dung dịch chuẩn nội 12,3 ± 0,5 sử dụng thiết bị mao quản Nếu sử dụng mao quản thiết bị tương đương xác định thời gian di chuyển dung dịch nội chuẩn tương ứng Mơ hình di chuyển thời gian di chuyển bảy đánh dấu MW (10, 20, 35, 50, 100, 150 225 kDa) phải hồn tồn tách biệt vịng 30 phương pháp sử dụng thiết bị tương đương (xem phụ lục B) b) Tiêu chí chấp nhận cho quy trình tách Thời gian di chuyển dung dịch chuẩn nội phải 12,3 ± 0,5 (nếu sử dụng thiết bị tương đương thời gian di chuyển phải xác định trước) Chênh lệch chiều cao đỉnh pic nội chuẩn đến điểm uốn pic chuỗi miễn dịch globulin nặng (Ig H) pic albumin huyết bị (BSA) khơng vượt q 25 % chiều cao dung dịch nội chuẩn mẫu 6.2.8 Tích hợp electropherogram (eGram): Tich hợp eGram sữa bột tách chất béo (Phụ lục C) sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh (Phụ lục D) cách thiết lập đường từ 0,4 trước pic nội chuẩn đến điểm uốn đầu pic κcasein pic Ig H BSA (khơng có pic âm tạo tích hợp); thực tích hợp thủ cơng từ pic Ig H BSA đến pic cuối eGram (tích hợp tất pic sau pic Ig H BSA) Tham khảo Phụ lục B việc tách protein kích thước chuẩn MW 6.2.9 Xác định vùng casein TCVN :2019 Đối với sữa bột tách chất béo, cài đặt thời gian bắt đầu tích hợp casein trước pic β-casein (khoảng 3,1 sau pic nội chuẩn 10 kDa) Đối với sản phẩm công thức cho trẻ sơ sinh, xác định pic β-casein theo eGram sữa bột tách chất béo cài đặt thời gian bắt đầu tích hợp casein trước pic Đối với tất mẫu, cài đặt thời gian kết thúc điểm uốn cuối pic κ-casein, pic Ig H BSA (khoảng 7,0 sau dung dịch nội chuẩn 10 kDa) Tính kết Tách tổng pic ba vùng: hai vùng đầu eGram (các protein whey MW thấp MW cao hơn) vùng Vùng tương ứng với protein casein (Acn), hai vùng lại gộp lại để thu protein whey (Aw) Hàm lượng whey protein, W, tính phần trăm, tính cơng thức (1): Aw c W= A w c  A 100 (1) cn Trong Aw tổng diện tích protein thành phần; Acn diện tích casein thành phần; Aw.c diện tích protein thành phần, tính Cơng thức (2); Aw.c = Aw x 1,4 (2) Trong đó: 1,4 hệ số chuyển đổi khác tỉ lệ khối lượng whey protein casein CHÚ THÍCH Các pic eGram dịch chuyển từ đầu đến cuối trình chạy Pic nội chuẩn sử dụng để điều chỉnh thời gian di chuyển cho tất đỉnh eGram Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thơng tin sau đây: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu, biết; c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) điều kiện thao tác không quy định tiêu chuẩn xem tùy chọn, với TCVN :2019 tình bất thường ảnh hưởng đến kết quả; e) kết thử nghiệm thu được; f) kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối thu TCVN :2019 Phụ lục A (Tham khảo) Cấu hình khay đệm (đối với thiết bị Beckman) Đầu vào Đầu 10 TCVN :2019 Phụ lục B (Tham khảo) Hình B1  Tách protein kích thước chuẩn MW Phụ lục C (Tham khảo) 11 TCVN :2019 whey MW thấp Casein whey MW cao Hình C.1  eGram sữa bột tách chất béo Phụ lục D (Tham khảo) 12 TCVN :2019 Ví dụ sắc ký đồ MW Whey thấp Casein MW Whey cao Hình D.1  eGram bột sữa công thức cho trẻ sơ sinh Phụ lục E (Tham khảo) Kết thử liên phòng thử nghiệm 13 TCVN :2019 Kết liên phòng thử nghiệm hàm lượng whey protein mẫu bột sữa công thức cho trẻ sơ sinh Nền mẫu Whey cho trẻ sơ sinh Sản phẩm công thức cho trẻ tuổi Công thức Whey giàu α-Lac NIST SRM 1849ac Whey cho trẻ sơ sinh Công thức cho trẻ tuổi Công thức có thêm LF Cơng thức có thêm α-Lac Cơng thức có thêm α-Lac Cơng thức có thêm α-Lac Cơng thức với sữa nguyên liệu Công thức giảm CGMPd Công thức hữu Công thức với EDW Công thức với sữa nguyên liệu Mứcb Số phòng Trung Độ thu (whey thí bình hồi, % %) 53 40 65 32 60 50 ≥ 60 70 70 70 ≥ 60 70 60 60 60 nghiệm 19 19 19 19 19 19 18 19 19 19 19 19 19 19 19 (whey %) 56,71 41,69 65,51 43,11 60,69 49,99 63,63 73,24 68,92 69,26 63,40 69,41 64,92 60,56 62,36 106 104 100 134 101 100 106 105 98 99 106 99 108 101 104 b Công bố nhãn sản phẩm CGMP – Casein glycoMacro peptit EDW – Electrodialysis demineralized whey _ 14 RSDr, % RSDR, % HorRat 1,67 2,11 1,44 3,51 2,11 1,63 0,92 0,83 1,67 1,82 2,09 1,57 1,01 1,47 1,61 3,14 4,22 2,18 5,94 2,37 3,57 2,37 2,3 2,59 3,2 3,33 2,89 2,43 2,61 2,76 1,44 1,85 1,02 2,62 1,11 1,61 1,11 1,10 1,22 1,51 1,55 1,37 1,14 1,21 1,29 ... Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng whey protein sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh điện di gel natri dodecyl sulfat (SDS-CGE) Tiêu chuẩn xác định tỷ lệ whey protein với casein... Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN :2019 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN :2019 Sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh – Xác định hàm lượng whey protein phương pháp điện di gel natri. .. sữa công thức cho trẻ sơ sinh Nền mẫu Whey cho trẻ sơ sinh Sản phẩm công thức cho trẻ tuổi Công thức Whey giàu α-Lac NIST SRM 1849ac Whey cho trẻ sơ sinh Cơng thức cho trẻ tuổi Cơng thức có thêm