Tách và xác định β lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

TRƯỜNG………………… KHOA……………………… LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tách xác định β-Lactam đối tượng sinh học phương pháp điện di mao quản LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………… CHƯƠNG - TỔNG QUAN………………………………………… 1.1 Giới thiệu chất kháng sinh β-lactam…………………………………………5 1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới …… 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam…………………………….11 1.3.1 Phương pháp quang học ……………………………………………… 11 1.3.2 Phương pháp điện hóa ………………………………………………… 12 1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 12 1.3.4.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) …… 14 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………17 2.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu …………………………………………….17 2.1.1 Đối tượng ……………………………………………………………… 17 2.1.2 Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………17 2.2 Giới thiệu chung phương pháp Điện di mao quản ……………………… 17 2.2.1 Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản……………………… 17 2.2.2 Thiết bị phương pháp điện di mao quản………………………… 18 2.2.3 Các trình xẩy mao quản………………………………… 19 2.2.4 Sự phân loại hay kiểu (mode) phương pháp điện di mao quản…………………………………………………………………………… 29 2.2.5 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 20 2.2.6 Phân tích định lượng phương pháp điện di mao quản………….26 2.3 Thực nghiệm…………………………………………………………………… 27 2.3.1 Máy móc dụng cụ …………………………………………………….27 2.3.2 Hóa chất ………………………………………………………………….27 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………….29 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β - Lactam …………………… 29 3.1.1 Chọn bước sóng phát chất …………………………………………29 3.1.2 Mao quản xử lý mao quản trước tách………………………… 30 3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu ………………………………………… 31 3.1.4 Độ điện di độ điện di hiệu dụng …………………………………… 32 3.1.5 Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di …………………………….33 3.1.6 Ảnh hưởng thành phần dung dịch đệm ………………………… 36 3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất tạo mixen SDS ……………….37 3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm…………………………………40 3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu ………………………………43 3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng điện di ……………………………………….45 3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mao quản …………………………47 3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu ……………………………………………….50 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích …………………………………………… 51 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn …………………… 51 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng đường chuẩn (LOQ)………………………………………………………………………… 54 3.2.5 Độ xác phép đo ………………………………………………55 3.2.6 Độ lặp lại phép đo ………………………………………………… 57 3.3 Phân tích mẫu thực …………………………………………………………… 59 3.3.1 Phân tích mẫu thuốc …………………………………………………….59 3.3.2 Phân tích mẫu máu …………………………………………………… 63 3.4 Ưu nhược điểm phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) …………………………………………………………………… 64 3.5 Hướng phát triển đề tài ………………………………………………… 65 PHỤ LỤC ……………………………………………………………… 71 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội ngày phát triển vấn đề sức khỏe người ngày trọng đặc biệt sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe β-Lactam thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho người, thú y từ chúng giới thiệu thị trường vào năm 1938 loại kháng sinh dùng nhiều Liều lượng cách dùng kháng sinh không dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ việc chữa trị bệnh khó khăn Ngồi cịn gây lãng phí cho người bệnh có bệnh virut khơng chữa kháng sinh dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán bệnh ảnh hưởng sức khỏe người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh máu gây bệnh thận, đặc biệt người cao tuổi Vì kiểm sốt phân tích thuốc kháng sinh người bệnh biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu sử dụng chúng Ở Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu tách xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm mơi trường chủ yếu cơng trình phân tích sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Phương pháp HPLC phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm thời gian phân tích ngắn Tuy nhiên phương pháp có số nhược điểm phải sử dụng lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao Ngược lại, phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng lượng hóa chất khơng đáng kể, tiết kiệm chi phí từ – lần, lượng mẫu bơm nhỏ HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao Tách xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) mẫu dược phẩm sinh học hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm phương pháp ngày thông dụng áp dụng nhiều phịng thí nghiệm phân tích mẫu dịch vụ Vì chúng tơi định chọn đề tài “ Tách xác định β-Lactam đối tượng sinh học phương pháp điện di mao quản” LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25] Là kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem hai nhóm sử dụng phổ biến lớn penicillin cephalosporin Các penicillin thu từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA) Các cephalosporin tự nhiên phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ kháng sinh thiên nhiên Cấu trúc phân loại: * Các penicillin Các penicillin có cấu trúc gồm vòng: vòng thiazolidin, vòng βLactam R CO S N H CH3 N CH3 O COOM Hình 1.1 Công thức cấu tạo kháng sinh penicillin Tên gọi chung cơng thức penicillin chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay R gốc khác nhau, cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có penicilin có độ bền, dược động học phổ kháng khuẩn khác Với M gốc cation thường là: K, Na, H Nhóm kháng sinh penicillin chia thành nhóm với hoạt tính khác LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 1.1 Phân loại cấu trúc số penicillin R tự nhiên Hoạt tính CH2- Penicillin Nhóm penicillin kháng penicilliiase Nhóm penicillin Tên kháng sinh Gồm Penicillin tự G nhiên dẫn chất.Phổ Benzyl (PENG) hẹp: vi khuẩn gram(+) Benzathin Không kháng β- lactamase CH3 C- Oxacillin Là Penicillin bán N O (OXA) 6-[(5-methyl-3-phenyl1,2-oxazole-4-carbonyl)amino] Cl nhóm I C- động vào vịng Cloxacillin CH3 (CLO) Kháng penicilliiase, không tác O N tổng hợp Phổ hẹp β – Lactam 6-{[3-(2-chlorophenyl )5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino} NH2NH2 Nhóm penicillin phổ rộng CH- Ampicillin (AMP) 6-([(2R)-2-amino-2- khuẩn gram (+) (-) phenylacetyl]amino) Amoxicilli n (AMO) Phổ rộng, tác dụng NH2NH2 Không CH- lactamase kháng βvà penicilliiase HO 6-{[(2R)-2-amino-2-(4hydroxyphenyl)-acetyl]amino} LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm vòng: vòng β-Lactam cạnh gắn với dị vòng cạnh, cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác gốc R R2 S R1 CO N H N5 O R3 COOM Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung cephalosporin chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi gốc R, cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn dược động học khác Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia cephalosporin thành hệ Các cephalosporin hệ trước tác dụng vi khuẩn gram dương mạnh hơn, gram âm yếu hệ sau Trong luận văn này, trình bày hệ I (CEP) hệ III (CEF) Bảng 1.2 Phân loại cấu trúc số cephalosporin Thế hệ Kháng sinh I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng Cephalexin mạnh vi khuẩn gram (+), (CEP) R1 R2 R3 H -CH3 CHNH2 yếu gram (-) Không bền dễ bị β-lactamase phá hủy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III: Tác dụng tốt vi khuẩn gram Cefixim (-), vi khuẩn gram (+) tác (CEF) H2N N H -CH=CH2 S N HOOCCH2O dụng penicillin cephalosporin hệ I Bền với βlactamase Tính chất: Các β-lactam thường dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit tan nước, dạng muối natri kali dễ tan; tan metanol số dung môi hữu phân cực vừa phải Tan dung dịch axit kiềm loãng đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH –NH2 Cực đại hấp phụ chủ yếu nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, dịch chuyển sang bước sóng ngắn dài, giảm độ hấp thụ) Các β-lactam axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh tác dụng Bảng 1.3 Hằng số axit kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 PEN 2.74 AMO 2.8 CLO 2.7 AMP 2.7 CEP 2.6 CEF 2.75 OXA 2.72 Tác dụng: Cơ chế: Các penicillin có khả acyl hóa D- alanin tranpeptidase, làm cho q trình tổng hợp peptidoglycan khơng thực Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại Ít tác dụng vi khuẩn gram (-) Mặc khác, penicillin cịn hoạt hóa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết vi khuẩn bị tiêu diệt Ngăn cản xây dựng giảm độ bền mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm tồn phát triển vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh β-lactamase, enzim có tác dụng mở vịng β-lactam, theo phản ứng nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh tác dụng Tất cách kháng không sinh β-lactamase để thực gọi kháng gián tiếp (được gọi kháng methicillin) Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm sốc phản vệ Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh thời kỳ cho bú Chống định dị ứng với thành phần thuốc 1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh Việt Nam giới Như cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động chế khác vi trùng khác Kháng sinh có tác dụng với bệnh vi trùng (bacteria), khơng có tác dụng với bệnh siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết tin tưởng sai lầm, nên khắp nơi giới, nước phát triển, người ta dùng kháng sinh nhiều, không cần thiết, không định không cách Năm 2000, bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, nửa đến 2/3 số toa coi khơng cần thiết.Theo R Gonzales [6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ngoại chẩn cho viêm đường hô hấp 60% trường hợp viêm đường hô hấp siêu vi, không cần không điều trị kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com kháng xuất vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo A.W McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao Các vi trùng kháng thuốc khơng khu trú địa phương với phương tiện giao thơng mau lẹ, vi trùng di chuyển đến khắp nơi giới vòng 24 D.P Raymond [17] năm Hoa kỳ có triệu người bị nhiễm trùng lây lan bệnh viện, nửa số vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người làm tốn ngân sách từ đến 10 tỉ đô-la Tại Việt Nam, theo báo cáo Nguyễn Kim Phượng J Chalker [4], năm 1997 23 trạm y tế Hải phòng, 69% bệnh nhân cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh liều lượng thời gian (dưới ngày) Theo [4] Qua thống kê khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, 70% bệnh nhân dị ứng dùng kháng sinh, có khơng trẻ em Sốc phản vệ dùng kháng sinh tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần bị kháng hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc Ampiciline 88%, Amoxiciline 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc Ampiciline gần 97% Amoxiciline 42% Các nhà chuyên môn báo động hậu nguy hiểm lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm Năm 1981, sau hội nghị Santa Domingo, nhà chuyên môn thành lập “Liên Hiệp Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Công thức cuối m = 20 Cx 200.10-6 (g) * Hàm lượng β-Lactam viên thuốc tính theo cơng thức sau % β-Lactam = (m / mthuoc) 100% Với mthuốc =  viên thuốc Sự khai khác hàm lượng so với kết in nhãn là: S | %b _ lactamsx  %b _ lactamdo | 100% %b _ lactamsx * Đánh giá độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn Ta có Cx nồng độ ban đầu chưa thêm chất chuẩn β-Lactam Cs: nồng độ thêm vào lượng dung dịch chuẩn C Hx Hs chiều cao trung bình dung dịch tương ứng Theo Cs = Hs Cx/ Hx Khi tính lượng β-Lactam thêm vào là: C’ = Cs – Cx (mg/l) Công thức thu hồi : %H = (C’/C).100% Bảng 3.15 Kết độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp thêm chuẩn mẫu thuốc Tên hoạt STT chất AMO CLO C 4 Chiều cao Thời gian C + C Cs %H (mAU) lưu (phút) x 2.5 3.6 4.9 7.2 2.7 3.8 4.7 7.1 8.35 8.30 8.28 8.26 13.78 13.71 13.67 13.65 2.1 3.1 4.1 6.1 2.43 3.43 4.43 6.43 3.02 92.4 4.12100.8 6.05 98.7 3.42 99 4.23 90 6.39 99 Hiệu suất trung bình %H/3 97.3 96 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CEP AMP PENG OXA CEF 4 4 4.2 5.3 5.8 8.1 3.6 4.4 5.5 7.1 4.1 5.1 5.7 7.6 5.4 6.6 7.7 9.9 1.8 2.3 2.9 3.9 10.71 10.77 10.77 10.75 11.23 11.27 11.31 11.30 11.67 11.63 11.63 11.59 12.69 12.66 12.64 12.63 13.27 13.24 13.21 13.50 4.38 5.38 6.38 8.38 4.06 5.06 6.06 8.06 4.79 5.79 6.79 8.79 4.86 5.86 6.86 8.86 3.4 4.4 5.4 8.4 5.53114.7 6.0583.43 8.45101.7 4.9690.22 6.2 107.1 8.0198.68 5.96116.8 6.6693.46 8.88102.2 5.94 108 6.93103.5 8.91101.3 4.3494.44 5.48103.9 7.3799.17 99.94 98.68 104.2 104.3 99.17 Bảng 3.16 Kết tính nồng độ Cx sai khác hàm lượng so với kết in nhãn thuốc Tên hợp Khối lượng %βchất hàm mthuốc Nồng độ STT thuốc tính %β-actamsx Lactam lượng ghi (g) Cx (mg/l) theo Cx (g) đo nhãn Sai số S so với hàm lượng in nhãn AMO 250mg AMO 0.0084 AMO 2.1 AMO 81.97 AMO 84 AMO 0.025 CLO CLO 250 2.43 CLO 2.43 CLO 81.97 CLO 97.2 CLO 0.186 mg 0.00972 CEP 500mg 2.3 4.38 0.018 87 87.6 0.007 62 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com AMP 500mg PENG 600mg OXA 500mg CEF 200mg 2.43 4.06 0.016 82.3 81.2 0.013 0.65 4.79 0.019 92.3 95.8 0.038 2.45 1.185 4.86 3.4 0.024 0.014 81.6 67.5 97.2 68 0.191 0.007 Trong loại thuốc phân tích thuốc chứa hoạt chất OXA có nhiều hàm lượng thuốc nhất, sau đến thuốc chứa CLO, PENG, AMO cuối CEF CEP Hiệu suất thu hồi cao > 97.3%, đạt yêu cầu cho phép > 95% 3.3.2 Phân tích mẫu máu [3] Mẫu máu lấy từ người tình nguyện độ tuổi từ 20 đến 25, cách tuần trước uống thuốc không dùng loại thuốc khác Mỗi người tình nguyện uống viên/ngày vào buổi sáng, trưa, tối uống liên tiếp ngày Viên cuối ngày thứ 3, sau uống lấy mẫu máu Lấy từ 1.5 đến 2ml lượng mẫu vào ống ependorf Ly tâm 15 phút 10.000 rpm để tách riêng phần hồng cầu, phần huyết bảo quản tủ lạnh -150C Trước phân tích lẫy mẫu khỏi ngăn đá để nhiệt độ phòng cho mẫu tan đá Hút 50 μl huyết vào ống ependorf thể tích 10 ml Lọai bỏ protein cách kết tủa với etanol tuyệt đối khoảng 200-300 μl, thêm 500 μl n-hexan ly tâm 15 phút 10.00 rpm tách riêng biệt lớp Dịch chiết thu lọc qua giấy lọc 0.45 μm Hút 200 μl dịch lọc làm bay khí N2 đến hết dung mơi Cặn hịa tan hỗn hợp 25 mM đêm Borat+100 mM SDS, pH= 7.75 Trộn cách đặt vào bể siêu âm phút Dung dịch đem đo phương pháp thêm chuẩn Mỗi mẫu đo bơm lặp lại lần Kết mẫu xử lý phần mềm thống kê origin 7.5 excel 63 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 3.17 Kết phân tích hàm lượng kháng sinh β-Lactam mẫu máu Khối Hàm Thời lượng lượng gian ST Tên loại ghi thêm lưu T thuốc uống nhãn vào (phút (mg/viên (mg/l ) ) ) 1 Amoxicilli n Cloxacillin 9.17 AMO 9.13 9.11 14.6 500 mg 14.31 CLO 14.23 14.15 Hiệu cao pic Cx Cs %H (mAU 2.3 3.5 4.8 7.1 2.7 3.5 5.1 6.9 suất trung bình ) 500 mg 9.21 Chiều 1.9 1.9 2.9 100.6 1.9 4.0 104.8 3 1.9 5.9 2.4 2.4 2.4 2.4 3.1 4.6 6.2 102.0 100.7 72.89 92.63 109.3 95.67 Thời gian lưu AMO CLO thay đổi so với mẫu chuẩn mẫu thuốc xử lý mẫu máu chưa đuổi hết dung môi hữu n-hexan khí N2 nên thời gian lưu tăng lên 3.4 Ưu nhược điểm phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 64 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương pháp MEKC phương pháp phân tích đại cho độ tin cậy hiệu tách cao Phương pháp xác định nhiều đối tượng khác bao gồm chất mang điện tích chất trung tính Phương pháp có số đặc điểm sau: - Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản nhiều so với kỹ thuật phân tích HPLC Chạy mẫu sắc ký chất vòng 14 phút - Dung dịch pha động mẫu phân tích thường pha nước deion sử dụng - Cột tách ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ tái sinh nhiều so với phương pháp HPLC Tuy nhiên phương pháp có số nhược điểm sau: - Do flowcell nằm mao quản nên độ nhạy phương pháp thấp nhiều so với phương pháp khác Giới hạn khoảng cỡ mg/l detector UVVIS, DAD Trong phương pháp khác như: HPLC có giới hạn nhỏ nhiều - Máy làm việc vùng điện áp cao nên phải cẩn trọng làm việc - Lượng mẫu sử dụng nhỏ ưu điểm phương pháp, đồng thời nhược điểm Khi lượng mẫu nhỏ dẫn đến sai số lớn phân tích hàm lượng lớn hệ số pha lỗng cao Đối với mẫu có hàm lượng nhỏ, tăng thời gian bơm mẫu gây tượng dỗng pic, hiệu suất tách khơng cao - Thời gian lưu của dung dịch phụ thuộc nhiều vào thành phần đệm, dung dịch điện ly địi hỏi phải cẩn thận tỉ mỉ 3.5 Hướng phát triển đề tài Trong luận văn này, điều kiện cịn hạn chế nên chúng tơi xác định hàm lượng β_Lactam phương pháp MEKC mẫu dược phẩm mẫu máu Phương pháp mở rộng phân tích dạng mẫu khác ví dụ như: mẫu nước tiểu, mẫu sữa,… hay mẫu môi trường như: nước 65 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thải bệnh viện, nước thải trại chăn ni gia súc Vì cần có nghiên cứu để phát triển phương pháp áp dụng vào thực tiễn KẾT LUẬN Qua sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách xác định kháng sinh AMO, AMP, CEP, PENG, OXA, CEF, CLO mẫu sinh học dược phẩm, thu kết sau: Khảo sát chọn thông số tối ưu cho trình chạy sắc ký: - Detector DAD – 198 nm - Chất tạo Mixen: SDS Dung dịch điện ly : 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20 kV - Sử dụng mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 56 cm, đường kính 50µm, loại bubble cell - Nhiệt độ mao quản 280C Đánh giá phương pháp phân tích: - Xây dựng đường chuẩn kháng sinh khoảng – 10 mg/l, hệ số tương quan đường chuẩn R2 > 0,99 - Giới hạn phát LOD kháng sinh từ 0,54 mg/l đến mg/l Giới hạn định lượng LOQ từ 1,8 mg/l đến3,34 mg/l 66 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Độ xác nồng độ 1mg/l; 5mg/l; 10mg/l nằm khoảng – 13.4 % - Hệ số biến động nồng độ 1mg/l; 5mg/; 10mg/l nằm khoảng 1.12 – 8.4% Phân tích hàm lượng kháng sinh mẫu thuốc mẫu máu - Với mẫu thuốc: hiệu suất thu hồi đạt từ 83.43% đến 116.8% - Với mẫu máu: hiệu suất thu hồi từ 72,89% tới 109.3% TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất lần thứ 3, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Thị Huyền Dương (2000), Tách phân tích đồng thời số chất quan trọng nhóm vitamin A phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao điện di mao quản, Luận án tiến sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội Ngọc Phương ( 2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo laodong.com.vn, 10-10-2006 Ngơ Quang Trung (2008), Xây dựng qui trình phân tích đồng thời số kháng sinh học b_lactam nghiên cứu tồn dư số khu vực bệnh viện Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học,ĐHQGHN Nguyễn Văn Đích (2005), "Khơng nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học đời sống, số 27 Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội 67 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu cao, Sách chuyên đề cho sinh viên chun ngành hóa phân tích, ĐH Quốc Gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội 10 Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hóa Dược, Tài liệu lưu hành nội cho sinh viên trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội TIẾNG ANH 11 A Fernández-González, R Badía and M E Díaz-Gar (2003), "Micellemediated spectrofluorimetric determination of ampicillin based on metal ioncatalysed hydrolysis", Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 223-231 12 Amber R Solangi (2007), ”Development of new analytical methods for 4quniolone antibacterials and cephalosporin antibiotics”, National Centre of Excellence in Analytical Chemistry/ University of Sindh 13 Althea W McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States", Journal Nature medicine, 9: 424 - 430 14 Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), "Application of capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins", Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239–246 15 Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008), "Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4), 1249- 68 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1253 16 C Y W Ang, W.H Luo, E.B Hansen, j.p Freeman, H,C Thompson (1996), "Rapid determination of ampicillin in bovine milk by liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 80(1), 107-190 17 D.P Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care Medicin, 29(6):1101-1108 18 F Belal, M M El-Kerdawy, S M El-Ashry and D R El-Wasseef (2000), "Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686 19 J.M Cha, S Yang, K.H Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57 20 James W.Jorgenson (1992), High performance capillary electrophoresis, Agilent Technoligies 21 L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening method for analytical control of antibiotic Residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of AnalyticaChimicaActa, 523(2004)21–28 22 M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C Cruces-Blanco, M del Olmo Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary electrophoresis", Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280 69 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 23 M.I Bailon-Perez,L.CuadrosRodr´ ıguez,C.Cruces-Blanco (2006), " Analysis of different -lactams antibiotics in pharmaceutical preparations Using micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752 24 Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono(2003),“Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means off luorescence, chemiluminescence and massspectrometry”, Journal of Mass Spectrometry,39(3), 329 – 340 25 Merk (1996), The Merck Index, 12th edition 26 R Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago Press, 23:757-762 27 Richard P Wenzel, M.D Michael B Edmond, M.D., M.P.H (2000), " Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine, 343:1961-1963 28 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line solid phase extraction", Analytica Chimica Acta,592(2), 187–192 29 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, 119(12), 2595-2601 70 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC SẮC ĐỒ ĐIỆN DI VÀ ĐƯỜNG THÊM CHUẨN CỦA β-LACTAM TRONG MẪU THỰC * Mẫu thuốc: 71 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 3.17 Sắc đồ điện di β-Lactam mẫu thuốc 72 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 Chiều cao pic (mAU) Chiều cao pic mAU y = 1.1829x + 2.48 R2 = 0.9994 -0.5 -1 -2.5 1.5 3.5 5.5 -0.5 -2.5 Nồng độ AMO (mg/l) Chiều cao pic (mAU) Chiều cao pic (mAU) -2 -1 -1 y = 0.8857x + 3.6 R2 = 0.9963 12 10 Chiều cao pic (mAU) Chiều cao pic (mAU) y = 0.86x + 4.12 R2 = 0.9945 1.5 2.5 3.5 4.5 Nồng độ AMP (mg/l) y = 1.12x + 5.44 R = 0.9996 0 -2 -4.5 -3.5 -2.5 -1.5 -0.5 -1 0.5 -4 Nồng độ CEP (mg/l) -6 5.5 -3 3.5 -4 1.5 Nồng độ CLO (mg/l ) y = 0.9543x + 4.188 R2 = 0.985 -5 y = 1.0943x + 2.66 R2 = 0.9972 2 -6 Nồng độ PENG (mg/l ) -4 -2 Nồng độ OXA (mg/l) 73 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chiều cao pic (mAU) Hình 3.18 Đường thêm chuẩn mẫu -4.8 -2.8 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 -0.8 thuốc β-Lactam phụ thuộc vào chiều cao pic y = 0.5286x + 1.8 R = 0.9988 1.2 3.2 5.2 Nồng độ CEF (mg/l) * Mẫu máu Hình 3.19 Sắc đồ điện di β-Lactam mẫu máu 74 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chiều cao pic (mAU) Chiều cao pic (mAU) -2.5 -0.5 y = 1.2029x + 2.32 R = 0.9994 1.5 3.5 y = 1.08x + 2.66 R = 0.9861 5.5 -2.5 Nồng độ AMO (mg/l) -0.5 1.5 3.5 5.5 Nồng độ CLO (mg/l) HÌnh 3.20 Đường thêm chuẩn AMO CLO mẫu máu phụ thuộc vào chiều cao pic 75 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... (mode) phương pháp điện di mao quản? ??………………………………………………………………………… 29 2.2.5 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 20 2.2.6 Phân tích định lượng phương pháp điện di mao quản? ??……….26... 3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu Trong kỹ thuật điện di mao quản đưa vào mao quản ba phương pháp phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) phương pháp Xiphong... chung phương pháp Điện di mao quản ……………………… 17 2.2.1 Nguyên tắc phương pháp điện di mao quản? ??…………………… 17 2.2.2 Thiết bị phương pháp điện di mao quản? ??……………………… 18 2.2.3 Các trình xẩy mao quản? ??………………………………