Tối ưu hóa quy trình chiết xuất flavonoid từ nụ Vối (Cleitocalyx operculatus (Roxb) Merr .et Perry, Myrtaceae)

Bài viết Tối ưu hóa quy trình chiết xuất flavonoid từ nụ vối (Cleitocalyx operculatus (Roxb) Merr .et Perry, Myrtaceae) được nghiên cứu với mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dược liệu/dung môi đến hiệu suất chiết flavonoid từ nụ Vối; Xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ nụ Vối quy mô phòng thí nghiệm.

Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHỊNG TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT FLAVONOID TỪ NỤ VỐI (Cleitocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry, Myrtaceae) Ngô Thị Quỳnh Mai1, Nguyễn Thị Thu Phương1, Trần Thị Ngân1, Vũ Văn Huy1 TÓM TẮT 35 Cây Vối (Cleitocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry) sử dụng phổ biến Việt Nam làm nước uống hàng ngày c ng chữa số bệnh th ng thường Các kết nghiên cứu c ng tác dụng sinh học tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng virus, bảo vệ gan… Nghiên cứu thực nhằm tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao giàu flavonoid từ nụ Vối Kết thu điều kiện tối ưu để chiết xuất nụ Vối phương pháp chiết siêu âm là: nồng độ dung m i ethanol 70°, tỷ lệ DL/DM 1/40, thời gian chiết xuất 40 ph t, số lần chiết lặp lại lần Hiệu suất chiết thu 80.06% Từ khóa: Cleitocalyx operculatus, Vối, chiết xuất SUMMARY OPTIMIZATION OF FLAVONOID EXTRACTION FROM THE FLOWER BUDS OF VOI (CLEITOCALYX OPERCULATUS (ROXB) MERR ET PERRY, MYRTACEAE) Voi (Cleitocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry) is widely used in Vietnam and other Southeast Asia as a beverage as well as to treat some common diseases Reported researches Trường Đại Học Y Dược Hải Phịng Chịu trách nhiệm chính: Ng Thị Quỳnh Mai Email: ntqmai@hpmu.edu.vn Ngày nhận bài: 20.1.2022 Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 Ngày duyệt bài: 20.5.2022 240 indicated its biological effects, such as antioxidant, anti-iflamation, antiviral, hepatoprotecive activities… This study was carried out in order to optimize the extraction process flavonoid from the flower buds of Voi The optimal conditions for extracting Voi buds by ultrasonic extraction method were as follows: ethanol concentration of 70°, ratio DL/DM of 1/40, and extraction time of 40 minutes, for times The extract yield of flavonoid was 80.06% Keywords: Cleitocalyx operculatus, Vối, extraction I ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Vối có tên khoa học Cleitocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry ây gỗ nhỡ thuộc họ Myrtaceae, mọc hoang trồng phổ biển Việt Nam Trong dân gian, nụ Vối sử dụng nấu nước uống chữa mụn nhọt, lở loét[7] Các chất phân lập từ nụ vối c ng chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng ch ý chống oxy hóa,[4] ức chế tế bào ung thư,[6] bảo vệ gan,[2] chống tăng đường huyết,[3] chống viêm,[1] chống loãng xương, kháng virus[5] … Các nghiên cứu thành phần hóa học có mặt chủ yếu flavonoid, triterpene d n xuất phenolic nụ vối.[6, 9] Trong đó, flavonoid coi thành phần có hoạt tính sinh học quan trọng Mặc dù có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học TạP CHí Y học việt nam tP 515 - tháng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 chất phân lập c ng dịch chiết từ Vối chứng minh, nghiên cứu xây dựng tối ưu hóa quy trình chiết xuất để tạo ngun liệu cho sản xuất chế phẩm từ Vối hạn chế Do ch ng t i tiến hành đề tài với mục tiêu: - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dược liệu/dung môi đến hiệu suất chiết flavonoid từ nụ Vối - Xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ nụ Vối quy mơ phịng thí nghiệm II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Nụ Vối (Cleitocalyx operculatus) mua cửa hàng Viện Dược liệu vào tháng 11 năm 2020, sấy kh đến độ ẩm 95% nghiền nh rây qua rây 0,3 mm ột dược liệu sau bảo quản tủ lạnh dùng cho nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp định tính, định lượng flavonoid toàn phần nụ vối  Phương pháp định tính flavonoid [8] Flavonoid dược liệu định tính phương pháp ống nghiệm phương pháp sắc ký lớp m ng Phương pháp nghiệm sử dụng phản ứng hóa học với kiềm lỗng, phản ứng Cyanidin phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid Phương pháp định tính sắc ký lớp m ng: - Chuẩn bị: Dung dịch thử: Lấy ml dung dịch A, bốc cách thủy khoảng 1ml Dung dịch đối chiếu: chất chuẩn 2′,4′dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (DMC) pha methanol với nồng độ 1mg/ml Pha động: hệ dung môi n-hexan – ethylacetat (6:1) Pha tĩnh: m ng silica gel 60 F254 Thuốc thử màu: dung dịch H2SO4 10% ethanol - Tiến hành: Chấm riêng biệt lên m ng dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy m ng để kh nhiệt độ phòng Quan sát m ng ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại 254 nm 366 nm Sau m ng màu với thuốc thử H2SO4 10% ethanol quan sát sắc ký đồ Các vết tính Rf Phương pháp định lượng flavonoid phương pháp đo quang: Phương pháp định lượng dựa việc đo độ hấp thụ ánh sáng dung dịch phức tạo thành chất cần xác định với thuốc thử v hay hữu m i trường thích hợp chiếu chùm sáng Phương trình định lượng phép đo dựa định luật Lamber-Beer: A = K.C Trong đó: A: ộ hấp thụ quang K: Hằng số thực nghiệm C: Nồng độ chất phân tích Phương pháp có độ nhạy, độ ổn định c ng độ xác cao, cho phép xác định nồng độ chất khoảng 10-5 – 10-7 M ối với flavonoid, phức màu thường tạo dựa phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan… Hàm lượng flavonoid tồn phần nụ vối tính theo khối lượng quercetin (g) 100 g khối lượng m u dược liệu khô tuyệt đối 2.2.2 Phương pháp chiết xuất Ethanol dung m i thường sử dụng chế biến thực phẩm tính an tồn hiệu suất chiết flavonoid thấp dung m i hu c nh aceton, 241 Công trình nghiªn cøu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHỊNG ethylacetate, ethanol, methanol ây loại dung mơi xanh, thân thiện với m i trường không ảnh hưởng tiêu cực đến sức kh e người dư lượng q trình chế biển sản xuất cơng nghiệp Hỗn hợp ethanol nước sử dụng phổ biến chiết xuất polyphenol nói chung flavonoid nói riêng Phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm nhiệt độ thường có ưu điểm thiết bị hiệu suất chiết Các ưu điểm bao gồm: thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản vận hành dễ dàng, kh ng đắt tiền, chiết nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết đa dạng, giảm nhiệt độ áp xuất nên áp dụng với hoạt chất không bền với nhiệt, rút ngắn thời gian chiết Do đề tài này, chúng tơi lựa chọn chiết siêu âm với hỗn hợp dung m i ethanol nước, nhiệt độ thường làm phương pháp chiết flavonoid từ nụ Vối Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu suất chiết flavonoid từ nụ Vối Lần lượt tiến hành khảo sát yếu tố: nồng độ ethanol, tỷ lệ dung m i/dược liệu, thời gian chiết cách giữ nguyên yếu tố lại Khoảng biến thiên yếu tố sau:  Nồng độ ethanol: 10, 30, 50, 70 90%;  Tỷ lệ dược liệu/dung môi: 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 g/ml;  Thời gian chiết: 10, 20, 30, 40, 50 phút Kết định lượng flavonoid nụ Vối sử dụng làm để lựa chọn Mỗi thí nghiệm lặp lại lần lấy giá trị trung bình Kết khảo sát trước sử dụng cho khảo sát sau Số lần chiết khảo sát sau chọn điều kiện tối ưu III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Định tính flavonoid nụ Vối Lấy gam bột dược liệu cho vào bình nón, chiết siêu âm với 20 ml ethanol 90% vòng 30 ph t Dịch lọc (dung dịch A) sử dụng để tiến hành phản ứng định tính phương pháp hóa học làm dung dịch thử phép thử sắc kí lớp m ng 3.1.1 ịnh tính phản ứng hóa học Dung dịch A thu tiến hành phản ứng với dung dịch NaOH 10%, phản ứng Cyanidin phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Kết thu ảng3.1 Các phản ứng dương tính r , chứng t có mặt flavonoid m u nụ Vối nghiên cứu Bảng 3.1 Kết định tính flavonoid mẫu nghiên cứu STT Phương pháp Yêu cầu Phản ứng Cyanidin Sau vài phút chuyển từ màu vàng sang màu đ Phản ứng với dung dịch Xuất màu xanh đen FeCl3 5% Phản ứng với NaOH Xuất tủa màu vàng, tủa tan lượng 10% dư dung dịch NaOH 10 % 3.1.2 ịnh tính sắc ký lớp m ng Kết sắc ký lớp m ng trình bày hình 3.1 bảng 3.2 242 Kết +++ +++ +++ T¹P CHÝ Y häc viƯt nam tẬP 515 - th¸ng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 A B A B A B A B Ánh sáng UV 254 UV 366 TT H2SO4 trắng nm nm 10% Hình 3.1 Sắc kí đồ định tính flavonoid dịch chiết nụ Vối Chú thích: A: M u thử B: Chất chuẩn DMC Bảng 3.2 Kết SKLM dịch chiết nụ Vối STT Ánh sáng trắng λ254 λ366 TT H2SO4 10% Rf Không màu + Vàng nâu 0.11 Khồng màu + Hồng 0.22 Không màu Xám 0.31 Không màu Xám 0.42 Vàng + + Vàng 0.46 Khi quan sát ánh sáng trắng ánh quercetin với nồng độ xác 50, sáng tử ngoại 254 nm, sắc ký đồ 100, 200, 400, 600 800 µg/ml Lấy 1ml dịch chiết nụ Vối thấy xuất vết dung dịch chuẩn quercetin cho vào bình định màu vàng có vị trí chất chuẩn DMC với mức có dung tích 10ml có chứa sẵn 4ml H2O Rf 0.46 Tuy nhiên quan sát ánh sáng phân tích Thêm vào bình 0.3 ml NaNO2 5%, tử ngoại bước sóng 366 nm thấy xuất sau phút thêm 0.3 ml AlCl3 10%, sau thêm vết phát quang có Rf tương ứng ph t tiếp theo, cho thêm 2ml NaOH 1M 0.11 0.22 Sau màu thuốc sau thêm H2O cho đủ 10ml Dung dịch thử quan sát ánh sáng trắng, sắc kí lắc tiến hành đo độ hấp thụ đồ dịch chiết nụ Vối xuất thêm vết bước sóng 510nm Các m u trắng tương ứng màu xám với Rf 0.31 0.42 tiến hành điều kiện thay Trong vết thu được, vết có Rf lớn c ng AlCl3 nước cất vết đậm có vị trí tương ứng với DMC Dựa kết đo độ hấp thụ quang Do đó, DMC thành phần dịch dãy dung dịch chuẩn xây dựng đường chiết nụ Vối có độ phân cực thấp chuẩn biểu diễn phụ thuộc vào nồng độ 3.2 Định lượng flavonoid toàn phần quercetin y = 0,0004x + 0,016 với hệ số tương quan 0.9986 nụ Vối 3.2.1 Xây dựng đường chuẩn chất Trong khoảng nồng độ khảo sát, mật độ chuẩn quercetin quang đo có mối quan hệ tuyến tính với Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn nồng độ chất chuẩn quercetin Vì vy khong 243 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG chuẩn quercetin xây dựng từ bước để xác định hàm lượng flavonoid nguyên liệu nụ Vối kh Với mật độ quang thu áp dụng c ng thức tính tốn ta thu kết hàm lượng flavonoid tồn phần nụ Vối 19.617 mg/g tính theo quercetin 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng 3.3.1 Độ ethanol Tiến hành chiết siêu âm 5g bột nụ Vối với dung m i ethanol nồng độ 10%, 30%, 50%, 70%, 90% với tỷ lệ DL/DM 1/20 thời gian 30 ph t Mỗi điều kiện khảo sát lặp lại lần, lấy kết trung bình, so sánh kết để lựa chọn nồng độ dung m i thích hợp Hiệu suất chiết B Hiệu suất chiết Hiệu suất chiết (%) A Hiệu suất chiết (%) Hiệu suất chiết (%)(%) Hiệu suất chiết nồng độ khảo sát phù hợp để định lượng flavonoid toàn phần nụ Vối 3.2.2 Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần nụ Vối Cân 5g nụ Vối xay nh , chiết siêu âm với 100 ml methanol nhiệt độ phòng 30 ph t, gạn lấy dịch chiết ã nụ Vối chiết lại với 100 ml methanol điều kiện, lặp lại đến dịch chiết kh ng cịn phản ứng định tính flavonoid Kết quả, đến lần chiết thứ dịch chiết nhạt màu, thử định tính kh ng cịn phản ứng Dịch chiết lần gom lại c quay thu cao kh Lượng cao kh hịa tan methanol chuyển sang bình định mức 250 ml, bổ sung dung m i đến vạch Áp dụng phương pháp đo quang sử dụng đường C Hiệu suất chiết Hình 3.3 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng flavonoid thu A: nồng độ dung m i chiết : tỷ lệ DL/DM C: thời gian chiết 244 T¹P CHÝ Y häc viƯt nam tẬP 515 - th¸ng - sè ĐẶC BIỆT - 2022 Hàm lượng flavonoid thu tỷ lệ thuận với độ tăng nồng độ ethanol Khi tăng nồng độ ethanol từ 10% - 30% hàm lượng flavonoid tăng lên kh ng đáng kể Nồng độ ethanol từ 30% - 70% hàm lượng flavonoid tăng nhanh lên đến 90° hàm lượng flavonoid có tăng kh ng nhiều (Hình 3.3A) iều thay đổi nồng độ ethanol độ phân cực dung m i c ng thay đổi theo Nồng độ dung m i có độ phân cực tương đương với hợp chất chiết xuất hịa tan chất tốt Tuy với nồng độ ethanol 90% cho hàm lượng flavonoid lớn kh ng nhiều so với hàm lượng flavonoid thu nồng độ 70% lượng cồn sử dụng tăng 20% làm tăng chi phí tăng nguy gây cháy nổ, an toàn Do ta chọn nồng độ ethanol 70% cho thí nghiệm 3.3.2 Khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi Từ kết khảo sát nồng độ dung m i, quy trình chiết lặp lại giữ nguyên khối lượng dược liệu 5g, nồng độ dung m i 70%, nhiệt độ 30°C, thời gian chiết 30 ph t, với tỷ lệ DL/DM thay đổi, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40,1/50 Mỗi điều kiện khảo sát lặp lại lần lấy kết trung bình, so sánh kết để lựa chọn điều tiện tỷ lệ DL/DM thích hợp Kết cho thấy tăng tỷ lệ DL/DM từ 1:10 đến 1:30 hàm lượng flavonoid thu tăng lên đáng kể, tăng lên tỷ lệ 1:50 hàm lượng flavonoid có tăng chậm lại (Hình 3.3 ) Hiện tượng giải thích chất trình chiết xuất trình khuếch tán, động lực q trình chênh lệch gradient nồng độ flavonoid dược liệu dung m i Trong trình chiết xuất rắn l ng, lượng dung m i sử dụng định lượng chất thu nhận Khi tỷ lệ thấp, lượng dung m i nhanh chóng đạt đến trạng thái cân nhiên lượng chất chiết kh ng nhiều phải tốn nhiều lần chiết Khi thêm dung m i nồng độ chất hịa tan giảm xuống, trình khuếch tán tiếp tục đạt trạng thái cân giá trị cao Tuy nhiên đến giới hạn định lượng flavonoid kh ng tăng lên dù tăng dung m i ên cạnh lượng dung m i nhiều làm giảm hiệu kinh tế trình chiết xuất, tăng thể tích thết bị chứa đựng, tốn lượng để thu hồi dung m i Vì vừa để đảm bảo hiệu suất chiết vừa để tiết kiệm dung m i đề tài định lựa chọn tỷ lệ DL/DM 1:40 cho thí nghiệm 3.3.3 Khảo sát thời gian chiết xuấtTiến hành khảo sát mốc thời gian 10p, 20p, 30, 40p, 50p, nồng độ dung m i 70%, tỷ lệ DL/DM 1/40 (với khối lượng dược liệu tương tự bước 5g) điều kiện lặp lại lần, lấy kết trung bình So sánh kết để chọn điều kiện thích hợp Kết cho thấy tăng thời gian chiết từ 10 ph t đến 30 ph t hàm lượng flavonoid hiệu suất chiết tăng lên đáng kể, lên đến 40 ph t hàm lượng hiệu suất có tăng mức tăng chậm lại Khi thời gian chiết lên đến 50 ph t hàm lượng hiệu suất chiết khơng khơng tăng mà cịn giảm nhẹ (Hình 3.3C) Do để đảm bảo hàm lượng hiệu suất mức cao c ng tiết kiệm thời gian vận hành máy móc, đề tài lựa chọn thời gian tối ưu 40 phút 3.3.4 Lựa chọn điều kiện tối ưu khảo sát số lần chiết 3.3.4.1 Lựa chọn đánh giá lại điều kin ti u 245 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Dựa trình khảo sát ta xác định điều kiện tối ưu: - Nồng độ dung môi ethanol: 70° - Tỷ lệ DL/DM: 1/40 - Thời gian chiết xuất: 40 phút Từ đó, đề tài đánh giá lại hiệu suất chiết điều kiện tối ưu Kết cho thấy hiệu suất hàm lượng flavonoid lần chiết khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (RSD