Tổn thương tế bào thần kinh thông qua con đường phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B do trimethyltin trên chuột nhắt

Trimethyltin (TMT) đã được chứng minh gây ức chế biểu hiện của yếu tố dinh dưỡng thần kinh nguồn gốc từ não (Brain-derived neuophic factor-BDNF) trên mô hình chuột nhắt trắng. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá sự thay đổi hàm lượng BDNF, biểu hiện của Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), BDNF và mRNA BDNF trong vùng hồi hải mã thuộc não chuột được tiêm TMT.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu TỔN THƯƠNG TẾ BÀO THẦN KINH THÔNG QUA CON ĐƯỜNG PHOSPHOINOSITIDE-3-KINASE/ PROTEIN KINASE B DO TRIMETHYLTIN TRÊN CHUỘT NHẮT Trần Phi Hoàng Yến1, Dương Phước An1 TÓM TẮT Mục tiêu: Trimethyltin (TMT) chứng minh gây ức chế biểu yếu tố dinh dưỡng thần kinh nguồn gốc từ não (Brain-derived neuophic factor-BDNF) mơ hình chuột nhắt trắng Nghiên cứu thực nhằm đánh giá thay đổi hàm lượng BDNF, biểu Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), BDNF mRNA BDNF vùng hồi hải mã thuộc não chuột tiêm TMT Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng, giống đực, Swiss albino Phương pháp nghiên cứu: Chuột tiêm liều TMT 2,4 mg/kg, tiêm phúc mạc (i.p) nước muối sinh lý (sal.) Chuột mổ giờ, giờ, 12 giờ, ngày, ngày, ngày ngày sau tiêm TMT, tách lấy vùng hồi hải mã để đánh giá biểu protein TrkB, phospho-TrkB BDNF kỹ thuật Western blot phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase chép ngược để định lượng m-RNA BDNF Kết quả: Kết cho thấy hàm lượng BDNF giảm sau tiêm TMT (27,1 ± 2,2 pg/mg) kéo dài đến ngày (16,3 ± 2,4 pg/mg) sau tiêm TMT so với nhóm sal (32,2 ± 2,5 pg/mg) Bằng kỹ thuật Western blot, kết cho thấy biểu BDNF phospho-TrKB giảm từ sau tiêm TMT tiếp tục giảm ngày Kết luận: Kết chứng minh tổn thương gây chết tế bào thần kinh TMT gây thơng qua ức chế BDNF/TrkB receptor, từ ức chế đường tín hiệu Phosphoinositide-3-kinase/ protein kinase B (PI3K/Akt) Từ khóa: Trimethyltin, BDNF, TrKB, PI3K/Akt ABSTRACT NEURODEGENERATION VIA PHOSPHOINOSITIDE-3-KINASE/ PROTEIN KINASE B SIGNALING PATHWAY CAUSED BY TRIMETHYLTIN IN MICE Tran Phi Hoang Yen,Duong Phuoc An * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 29 - 34 Objectives: Trimethyltin (TMT) has been demonstrated to inhibit the expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in a white mouse model This study was performed by assessing the changes in BDNF content and expression of Tropomyosin receptor kinase B (TrkB) in the hippocampus of the brain of TMTinduced mice Materials and methods: Animals for this research is male mice, Swiss albino Methods: Mice were given a single dose of TMT at a dose of 2.4 mg/kg, peritoneal injection (i.p) or saline (sal.) Mice were operated at hours, hours, 12 hours, day, days, days and days after TMT injection, hippocampus was separated to evaluate the expression of TrkB and BDNF proteins by Western blot analysis and reverse transcription polymerase chain synthesis (RT-PCR) to quantify m-RNA BDNF Results: The results showed that TrkB protein expression and BDNF content decreased hours after TMT injection (27.1 ± 2.2 pg/mg) after single dose of 2.4 mg/kg TMT, i.p and lasted up to days (16.3 ± 2.4 pg/mg) Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS.DS Trần Phi Hoàng Yến ĐT: 0937878365 B - Khoa Học Dược Email: yen.tranphihoang@ump.edu.vn 29 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 after TMT injection as compared to sal group (32.2 ± 2.5 pg/mg) By Western blot, the results showed that the expression of BDNF and phospho-TrKB decreased from hours after TMT injection and continued to decrease until days Conclusion: The results may demonstrate TMT-induced neuronal cell death and injury through inhibition of the BDNF/TrkB receptor, which in turn inhibits the Phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling pathway Keywords: Trimethyltin, BDNF, TrKB, PI3K/Akt ĐẶT VẤNĐỀ Trimethyltin (TMT) - hợp chất hữu thiếc, thường tồn với vai trò chất ổn định plastic Đây hợp chất nhiều nghiên cứu giới công bố độc tính tế bào thần kinh, gây suy giảm trí nhớ; gây co giật tử vong Nhiều nghiên cứu nước thực nhằm chứng minh chế gây độc tính, làm thối hóa tế bào thần kinh TMT(1-3), hướng đến việc tìm kiếm thuốc điều trị cho bệnh liên quan đến thối hóa tế bào thần kinh suy giảm trí nhớ Tuy nhiên nay, chế gây tổn thương tế bào thần kinh TMT gây chưa chứng minh đầy đủ Một số nghiên cứu chứng minh Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), yếu tố dinh dưỡng thần kinh nội sinh Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), receptor BDNF tương tác với đường tín hiệu đồng điều chỉnh chức sống tế bào(4,5) Tại Việt Nam, nghiên cứu chủng chuột Swiss albino chứng minh TrkA/B vùng hồi hải mã có biểu giảm sau tiêm liều TMT 2,4 mg/kg(6) Nghiên cứu thực nhằm đánh giá ảnh hưởng TMT BDNF TrkB chủng chuột Swiss albino, chủng chuột sử dụng phổ biến nghiên cứu in vivo chuột Việt Nam nhằm góp phần vào nghiên cứu chế gây độc tính tế bào thần kinh TMT ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng, giống đực, Swiss albino, lô từ 6-8 con, cân nặng 24-26 g khoẻ mạnh, 30 khơng có biểu bất thường viện Vaccin Sinh Phẩm Y tế Nha Trang cung cấp Chuột nuôi ổn định 5-7 ngày trước tiến hành thử nghiệm phịng ni có chu trình 12h sáng tối (6:00 – 18:00), chuột cung cấp đầy đủ thức ăn viên (do viên Pasteur TP Hồ Chí Minh cung cấp) nước uống suốt trình thử nghiệm Chuột tiêm liều TMT (Sigma Aldrich) liều 2,4 mg/kg, tiêm phúc mạc (i.p) nước muối sinh lý (saline - sal.) Chuột giết sau gây mê urethane (1,2 g/kg chuột, i.p) thời điểm (3h), (6h), 12 (12h), ngày (1d), ngày (2d), ngày (3d) ngày (7d) sau tiêm TMT, sau mổ tách lấy vùng hồi hải mã Việc tách để lấy vùng hồi hãi mã thực đá gel, sau đặt vào ống eppendorf 1,5 ml cho vào nitơ lỏng, chuẩn bị thực thử nghiệm định lượng Các mẫu mơ sau sử dụng để đánh giá biểu protein TrkB BDNF kỹ thuật Western blot; định lượng BDNF ELISA test phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase chép ngược để định lượng mRNA BDNF Phương pháp định lượng để xác định hàm lượng protein tổng Mô vùng hồi hải mã nghiền đồng thể với PBS (1:20) tạo dịch đồng thể, ly tâm 10.000g nhiệt độ oC phút Phần suốt sau ly tâm sử dụng cho thử nghiệm hoá sinh để định lượng protein máy đo huỳnh quang Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen (REF Q32866; SN 1104001835), sử dụng kít Qubit Protein assay Q33212, Lot.No 977974 B - Khoa Học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Phương pháp định lượng BDNF ELISA test Hàm lượng BDNF mô xác định Aviva Systems Biology BDNF ELISA Kit (mouse) (OKBB00129) dựa công nghệ xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym sandwich tiêu chuẩn Phản ứng enzym xảy với chất tetramethylbenzidin xúc tác enzym horseradish peroxidase để tạo sản phẩm màu xanh lam Ủ hỗn hợp 10 phút điều kiện tránh ánh sáng Sau đó, thêm dung dịch làm dừng phản ứng có tính acid (Stop solution), hỗn hợp phản ứng chuyển sang màu vàng, đo độ hấp thu bước sóng 450 nm Kết tính tốn dựa việc xây dựng đường chuẩn BDNF có nồng độ BDNF protein thay đổi từ 0, 62,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000 10.000 pg/ml biểu diễn số pg BDNF/mg protein(7) Phương pháp phân tích biểu protein kỹ thuật Western blot Thực sắc ký điện di gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid, chuyển sang màng lai nitrocellulose; Ủ kháng thể đặc hiệu điều kiện oC từ 18-24 giờ: β-actin (1:10000); anti-TrkB (Ab-705) antibody (1:1000); phosphoTrkB (Tyr705) polyclonal antibody (1:400) BDNF polyclonal antibody (1:500) Rửa với TBSTween 10 phút x lần máy lắc Ủ kháng thể thứ cấp anti-Rabbit IgG - Horseradish Peroxidase (1:1000, Sigma-PM0100) Phát huỳnh quang phim X quang với thuốc thử làm tăng tín hiệu huỳnh quang (Enhanced chemiluminescence - Amersham, Arlington Heights, IL, USA) Kết phân tích dựa mật độ hiển thị phần mềm PhotoCapt MW (Phiên 10.01 for Windows; Vilber Lourmat, Marne la Vallée, France)(8) Nghiên cứu (Qiagen, Valencia, CA, USA) Quá trình phiên mã ngược thực ủ 37 oC, sử dụng mg RNA cho phản ứng Khuếch đại PCR thực 35 chu kỳ: biến tính 94 oC phút, ủ 60 oC phút kéo dài 72 oC phút Cặp mồi cho BDNF (332 bp), sense: 5'GAAGAGCTGCTGGATGAGGAC-3’ antisense: 5'-TTCAGTTGGCCTTTTGATACC-3', GAPDH (450 bp), sense: 5'-ACC ACAGTCCATGCCATC-3' antisense: 5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' Sản phẩm PCR hiển thị gel agarose 2% có chứa ethidium bromid Kết phân tích mật độ hiển thị phần mềm PhotoCapt MW (Phiên 10.01 for Windows; Vilber Lourmat, Marne la Vallée, France)(9) Phân tích liệu xử lý thống kê Dữ liệu phân tích ANOVA yếu tố phép kiểm Fischer’s PLSD Giá trị P nhỏ 0,05 xem có ý nghĩa thống kê KẾT QUẢ Phân tích định lượng BDNF ELISA test Kết định lượng xác định hàm lượng BDNF vùng hồi hãi mã ELISA test cho thấy hàm lượng BDNF giảm có ý nghĩa giai đoạn sớm sau tiêm TMT giảm mạnh thời điểm ngày, kéo dài ngày sau tiêm TMT Phương pháp phân tích định lượng mRNA BDNF kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)) Phân tích định lượng RT-PCR thực để định lượng mRNA BDNF vùng hồi hải mã RNA tổng chiết xuất từ vùng mô phân lập cách sử dụng RNeasy Mini kit B - Khoa Học Dược Hình Sự thay đổi hàm lượng BDNF (pg/mg protein) vùng hồi hải mã nhóm: chứng (sal.), sau tiêm TMT 3h, 6h, 12h, 1d, 2d, 3d 7d * p