Luận văn tốt nghiệp bùi thị thu anh k25 sinh học thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thị Thu Anh PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thị Thu Anh PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS VÕ THỊ THƢƠNG LAN Hà Nội - 2019 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS TS Võ Thị Thương Lan, cô tận tình giúp đỡ bảo em thí nghiệm, gặp vấn đề cô định hướng giúp em làm thí nghiệm cách độc lập Cơ khơng dạy dỗ em thí nghiệm mà cịn giúp em biết cách trình bày luận văn phân tích báo khoa học Cô dạy dỗ em biết cách cư xử với người nguyên tắc ứng xử ngồi xã hội Cơ nhà giáo mà em quý mến muốn học hỏi thêm nhiều điều từ cô Em xin gửi lời cảm ơn đến Ths Tạ Bích Thuận, người ln an ủi động viên em em gặp khó khăn, nhờ có mà giây phút căng thẳng làm thí nghiệm trở nên nhẹ nhàng Cô giúp em có thêm nhiều động lực để hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Bệnh viện K Hà Nội, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Bệnh viện Nhi Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt luận văn Tiếp đến em xin cảm ơn Ths Ngô Thị Hà, Hv Nguyễn Thùy Ngân bảo giúp đỡ em tận tình q trình thí nghiệm xin gửi lời cảm ơn tới Hv Nguyễn Minh Khơi, em Nguyễn Thị Thanh Phịng thí nghiệm Sinh Y giúp đỡ chia sẻ khó khăn giúp em hoàn thành luận văn Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến với gia đình, bạn bè bên cạnh động viên nguồn động lực lớn giúp em vượt qua khó khăn công việc Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Bùi Thị Thu Anh TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Viết tắt APOBEC3 : Apolipo Protein B mRNA Editing enzyme Catalytic subunit bp : Base pair CGH : Comparative Genomic Hybridization CNV : Copy number variation Ct : Threshold cycle DCIS : Ductal carcinoma in situ DD : Deletion/Deletion genotype DNA : Deoxyribonucleic acid dNTPs : Deoxynucleotide triphosphates EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid HW : Hardy-Weinberg ID : Insertion/Deletion genotype IDC : Invasive ductal carcinoma II : Insertion/Insertion genotype ILC : Invasive lobular carcinoma kb : Kilobase LCIS : Lobular carcinoma in situ Mb : Megabase MLPA : Multiplex ligation-dependent probe amplification mRNA : Messenger ribonucleic acid NAHR : Non-allelic homologous recombination TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm OD : Optical density OR : Odds ratio PCR : Polymerase chain reaction SNP : Single nucleotide polymorphism ssDNA : Single-stranded DNA TBE : Tris - Borate - EDTA TNM : Tumor - Node - Metastasis TD-PCR : Touchdown polymerase chain reaction UDG : Uracil-DNA glycosylase UTR : Untranslated region ZD-CDAs : Zinc-dependent cytidine deaminase TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu 28 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện tối ƣu phản ứng PCR 30 Bảng 3.1 Điều kiện phản ứng PCR ban đầu 36 Bảng 3.2 Tổng hợp kiểu gen đoạn APOBEC3B nhóm mẫu 44 Bảng 3.3 Kết kiểm tra cân HW nhóm đối chứng 46 Bảng 3.4 Kết kiểm tra cân HW nhóm bệnh nhân 47 thalassemia Bảng 3.5 Kết phân tích đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy ung thƣ vú 48 Bảng 3.6 Số lƣợng mẫu nghiên cứu số cơng bố 48 Bảng 3.7 Kết phân tích đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy mắc bệnh di truyền thalassemia 51 Bảng 3.8 Liên hệ đa dạng đoạn APOBEC3B với số lâm sàng ung thƣ vú 55 Bảng 3.9 Sự thay đổi đa dạng đoạn APOBEC3B cặp ung thƣ vú liền kề 56 Bảng 3.10 Xu hƣớng thay đổi đa dạng đoạn APOBEC3B cặp ung thƣ vú liền kề 57 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1 Đặc điểm họ gen APOBEC3 ngƣời Hình 1.2 Mối liên hệ APOBEC3A với ung thƣ Hình 1.3 Vai trị APOBEC3B tiến trình ung thƣ Hình 1.4 Tái tổ hợp tƣơng đồng khơng alen (NAHR) hình thành CNVs 11 Hình 1.5 Mất đoạn hình thành hai gen APOBEC3A APOBEC3B nằm nhiễm sắc thể 22 13 Hình 1.6 Phân bố tần suất alen đoạn APOBEC3B số nơi giới 14 Hình 1.7 Tình hình ung thƣ vú giới Việt Nam năm 2018 16 Hình 1.8 Độ mơ học ung thƣ vú 18 Hình 1.9 Các bƣớc phƣơng pháp MLPA 22 Hình 1.10 Vị trí đầu dị mồi kỹ thuật MLPA phát đa dạng đoạn APOBEC3B 23 Hình 1.11 Phƣơng pháp phát sản phẩm realtime-PCR 24 Hình 1.12 Vị trí mồi xác định đa dạng đoạn APOBEC3B kỹ thuật 25 PCR Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số số mẫu 35 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm Hình 3.2 Kết phản ứng PCR 36 Hình 3.3 Kết tối ƣu tăng nhiệt độ gắn mồi phản ứng PCR 37 Hình 3.4 Kết PCR kiểm tra đa dạng đoạn APOBEC3B bệnh 38 phẩm ung thƣ vú Hình 3.5 Kết tối ƣu điều kiện phản ứng PCR 39 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự đoạn gen 490 bp khuếch đại cặp mồi 40 Ins-F Ins-R với ngân hàng gen NCBI Hình 3.7 Kết so sánh trình tự đoạn gen 700 bp khuếch đại mồi Del- 41 F Del-R với ngân hàng gen NCBI Hình 3.8 Vị trí xảy đa dạng đoạn APOBEC3B đoạn gen 700 bp khuếch đại mồi Del-F Del-R 42 Hình 3.9 Kết kiểm tra đa dạng đoạn APOBEC3B nhóm mẫu 43 Hình 3.10 Biểu đồ thể tỷ suất nguy (OR) đa dạng đoạn APOBEC3B với ung thƣ vú 49 Hình 3.11 Sự phân bố số ca mắc ung thƣ vú tần suất alen đoạn APOBEC3B giới 50 Hình 3.12 Biểu đồ tần suất alen đoạn APOBEC3B nghiên cứu ung thƣ vú 52 Hình 3.13 Biểu đồ thể đặc điểm phân bố nhóm tuổi, độ mô học, giai 54 đoạn ung thƣ vú kích thƣớc u bệnh nhân ung thƣ vú TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Họ gen APOBEC3 1.1.1 Đặc điểm họ gen APOBEC3 1.1.2 Mối liên hệ họ gen APOBEC3 với ung thƣ 1.2 Vai trò gen APOBEC3A APOBEC3B ung thƣ 1.3 Đa dạng di truyền 1.3.1 Đa dạng số (Copy Number Variation - CNV) 1.3.2 Đa dạng đoạn APOBEC3B nguy ung thƣ vú 12 1.4 Tổng quan ung thƣ vú 15 1.4.1 Tình hình ung thƣ vú 15 1.4.2 Phân loại ung thƣ vú 16 1.4.3 Độ mô học ung thƣ vú 18 1.4.4 Các giai đoạn ung thƣ vú 18 1.4.5 Các yếu tố tăng nguy ung thƣ vú 20 1.5 Phƣơng pháp xác định đa dạng đoạn APOBEC3B 21 1.5.1 Phƣơng pháp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) 21 1.5.2 Phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime-PCR) 23 1.5.3 Phƣơng pháp PCR 25 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu 27 2.2 Hóa chất thiết bị 27 2.2.1 Hóa chất 27 2.2.2 Thiết bị 28 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 28 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 2.3.2 Phƣơng pháp tách DNA tổng số 29 2.3.3 Phƣơng pháp PCR 30 2.3.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 30 2.3.5 Phƣơng pháp điện di 31 2.3.6 Phƣơng pháp đo mật độ quang học 31 2.3.7 Phƣơng pháp phân tích thống kê 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Tách chiết, kiểm tra chất lƣợng, nồng độ DNA tổng số 34 3.2 Tối ƣu điều kiện phản ứng PCR 35 3.3 Giải trình tự sản phẩm PCR 39 3.4 Xác định đa dạng đoạn APOBEC3B 42 3.5 Kiểm tra cân Hardy-Weinberg 44 3.5.1 Kiểm tra cân Hardy-Weinberg nhóm đối chứng 44 3.5.2 Kiểm tra cân Hardy-Weinberg nhóm bệnh di truyền thalassemia 46 3.6 Phân tích đa dạng đoạn APOBEC3B 47 3.6.1 Đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy mắc ung thƣ vú phụ nữ Việt Nam 47 3.6.2 Đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy mắc bệnh di truyền thalassemia 50 3.7 Tần suất alen đoạn APOBEC3B ngƣời Việt Nam 51 3.8 Mối liên hệ đa dạng đoạn APOBEC3B với thông số mô bệnh học, giai đoạn ung thƣ vú nhóm tuổi 53 3.9 Sự khác biệt đa dạng đoạn APOBEC3B mẫu ung thƣ vú mẫu liền kề (U - L) 55 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 217 L217 ID Phạm Thị T 48 1.2 11 218 L218 ID Vũ Thị A 44 1.8 219 L219 II Lê Thị N 65 10 220 L220 ID Chu Thị T 50 221 L221 ID Phạm Thị Thanh T 36 11 2 222 L222 ID Trần Thị H 38 11 2 223 L223 ID Trần Thị T 53 1.2 2 224 L224 II Hà Thị H 49 1.8 11 225 L225 ID Bùi Thị C 63 226 L226 ID Bùi Thị T 57 227 L227 ID Nguyễn Thị N 48 228 L228 ID Nguyễn Thị H 36 229 L229 ID Vũ Thị M 69 230 L230 II Hoàng Thị L 50 231 L231 ID Ngô Thị N 76 232 L232 ID Ngô Thị C 59 233 L233 II Đinh Thị N 68 1.5 234 L234 II Phạm Thị H 54 235 L235 ID Đặng Thị M 236 L236 ID 237 L237 238 2 12 2.5 14 2 67 2.3 11 Nguyễn Thị H 45 10 II Trịnh Thị H 35 14 L238 II Bùi Thị C 46 239 L239 ID Hà Thị Hồng T 60 240 L240 ID Nguyễn Thị L 54 2.5 12 241 L241 ID Vũ Thị H 55 11 2 Carcinom thể ống có vi xâm nhập Carcinom xâm nhập típ khơng đặc biệt Carcinom xâm nhập típ khơng đặc biệt Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinom thể nội ống Carcinom thể ống xâm nhập Carcinom thể ống xâm nhập Carcinom xâm nhập típ khơng đặc biệt Carcinoma thể onx Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma tiểu thùy xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể vi nhú Carcinoma thể ống xâm nhập Ung thƣ biểu mô ống xâm nhập Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma nội ống Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carcinoma thể ống xâm nhập Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carrcinom xâm nhập tip TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm không đặc biệt Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carrcinom xâm nhập tip không đặc biệt Carcinoma thể ông xâm nhập Carcinom xâm nhập típ khơng đặc biệt Carcinom thể ống xâm nhập Carcinom tiểu thùy xâm nhập Carcinoma tiểu thùy xâm nhập Carcinom thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Car thể onx Car thể tủy Car thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập 242 L242 ID Đinh Thị L 38 4 243 L243 ID Hoàng Thị Hồng H 57 1.5 16 244 L244 II Vũ Thị M 68 1.8 11 245 L245 ID Nguyễn Thị Yến L 43 10 2 246 L246 ID Nguyễn Thị C 48 3.5 2 247 L247 ID Phạm Thị T 61 1.5 11 248 L248 II Lê Thị D 27 249 L249 ID Nguyễn Thị C 44 1.5 19 2 250 251 252 253 254 L250 L251 L252 L253 L254 ID ID ID ID ID 53 41 43 40 64 2 255 L255 ID 256 L256 ID 257 258 L257 L258 ID ID Đặng Thị D Phạm Thị Bích L Trần Thị C Phạm Thị H Trần Thị N Hoàng Thị Thanh H Nguyễn Thị Mai L Dƣơng Thị S Phan Thị Minh Đ 259 L259 ID Vũ Thị M 55 260 261 262 L260 L261 L262 ID ID ID Trƣơng Thị T Lê Thị H Đỗ Kim T 41 63 40 263 L263 ID Lò Thị C 56 264 L264 ID Nguyễn Thị X 64 265 L265 ID Trần Thị Hồng L 52 2 266 L266 ID Nguyễn Thị N 53 2 267 L267 ID Cáp Thị T 49 2 59 2 Car thể ống xâm nhập 61 2 Car thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Car tiểu thùy xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập trội thành phần nội ống Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập 65 65 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 268 L268 ID Dƣơng Thị L 51 269 L269 ID Phi Thị L 43 2 270 L270 ID Vũ Thị P 64 2 271 L271 ID Nguyễn Thị Y 48 2 272 L272 II Trần Thị T 38 273 L273 DD Nguyễn Thị H 52 274 L274 ID Trần Thị Ánh H 40 2 275 L275 ID Nguyễn Thị T 41 276 277 L276 L277 ID ID Trần Thị N Hà Thị X 66 58 2 278 L278 ID Nguyễn Thị N 24 279 L279 ID Nguyễn Thị Đ 50 280 L280 ID Nguyễn Thị S 64 2 281 L281 ID Nguyễn Thị M 64 282 L282 ID Nguyễn Thị S 52 283 L283 ID Dƣơng Thị T 59 284 L284 ID Nguyễn Thị V 40 285 L285 II Nguyễn Thị L 38 286 L286 ID Trần Thị H 65 287 L287 ID Nguyễn Thị Bích T 47 288 L288 ID Lê Thị M 66 289 L289 ID Bùi Thị H 63 290 L290 ID Phan Thị Đam H 52 2 291 L291 ID Nguyễn Thị P 36 292 L292 ID Nguyễn Thị H 34 Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Carcinoma thể tủy Carcinoma thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carsarcoma Carcinoma thể ống xâm nhập Ung thƣ biểu mô thể vi nhú Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Vú phải: thể ống xâm nhập TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 293 L293 ID Vũ Thị L 50 294 L294 ID Phạm Thị T 60 295 L295 II Hoàng Thị M 67 296 L296 ID Ngô Thị Điệp H 59 2 297 L297 ID Hà Thị C 47 2 298 L298 II Nguyễn Thị T 46 299 L299 II Dƣơng Thị L 60 300 L300 ID Đỗ Thị L 56 2 Carcinoma tiểu thùy xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Car thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập Carcinoma thể ống xâm nhập TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Thông tin mẫu máu ngƣời khám sức khỏe ngƣời tình nguyện STT Ký hiệu Kiểu gen 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 M32 M33 ID II II ID ID DD II ID ID ID II ID ID DD II ID II II DD ID ID DD DD ID II ID ID II II DD ID ID II Họ tên Nguyễn Thị Thu H Dƣ Ngọc A Trƣơng Thùy D Phùng Thị Anh L Lại Thị P Nguyễn Hồng N Nguyễn Thị Kim D Nguyễn Hồng H Đinh Thị L Phạm Thị N Hà Thị Kim N Lê Thạch T Nguyễn Thị Thu T Tơ Thị T Hồng Thị Hồi T Phạm Thị Đ Lê Thị T Đinh Thị H Vũ Thị T Trần Thu H Nguyễn Thị Hải L Phạm Thị G Vũ Thị H Ngô Thị T Bùi Thị T Trần Thị Lan P Nguyễn Thị S Phạm Hƣơng G Hoàng Thị Thanh T Lƣờng Thị Kim D Hoàng Thị H Hồng Thị Bích H Triệu Hồng Y Tuổi Giới tính 30 22 31 36 30 29 24 27 25 38 20 20 20 24 23 25 30 20 24 27 24 31 26 27 61 30 53 31 Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 M34 M35 M36 M37 M38 M39 M40 M41 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M50 M51 M52 M53 M54 M55 M56 M57 M58 M59 M60 M61 M62 M63 M64 M65 M66 M67 M68 M69 M70 Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm ID II II ID II II ID ID ID ID II II ID ID ID II ID ID DD ID II ID ID II ID ID DD ID II II ID DD ID ID ID ID ID Đặng Thị Thanh T Phạm Thị Lan A Trần Thị Thu H Đỗ Thu T Hà Thị H Đỗ Thị H Lô Thị Đ Nông Thị T Triệu Thị Thu H Nông Thị Thu H Hứa Thị C Nguyễn Thị L Hà Thị Hải Y Nông Thị H Hoàng Thị T Bế Thị N Trần Thị N Đinh Mai H Nơng Phƣơng N Nơng Thị Hồi T Lèo Thị K Hà Thị K Đinh Thị Đ Đinh Thị T Đàm Thị H Hà Thị H Nông Thị T Long Thị H Ma Thị N Vi Thị T Đàm Thị C Lƣơng Thị T Hoàng Thị H Hoàng Thị M Bùi Thị Thanh H Trịnh Thị H Nguyễn Thị Mai D 13 31 36 32 23 31 34 48 34 28 54 58 54 52 53 50 61 38 41 24 Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 M71 M72 M73 M74 M75 M76 M77 M78 M79 M80 M81 M82 M83 M84 M85 M86 M87 M88 M89 M90 M91 M92 M93 M94 M95 M96 M97 M98 M99 M100 M101 M102 M103 M104 M105 M106 M107 Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm II ID II ID ID ID DD DD ID ID II ID ID DD II ID ID ID II ID DD II II ID DD ID ID DD II II ID II ID ID II ID ID Nguyễn Thị H Hoàng Thị Huyền N Nguyễn Thị D Phạm Thị K Bế Thị Mỹ L Phạm Thị P Nguyễn Thị N Phan Thị Kim C Trần Thị K Lê Thị O Bùi Thị Thanh H Trần Thị L Hoàng Thị T Phan Thị Lan A Nguyễn Lê Kim A Vũ Thị Ngọc H Nguyễn Ngọc A Đinh Thị Thùy D Đỗ Thị Quỳnh T Nguyễn Thị Mỹ D Lê Thị S Phạm Thị Minh H Nguyễn Thị Hải Y Bùi Thị Lan H Phạm Thu H Nguyễn Thị L Nguyễn Thị Hồng Y Hoàng Thị M Lê Thị T Khƣơng Thị H Phạm Thị Kim L Bùi Thị Thanh H Nguyễn Thị N Đặng Thị Thanh T Lại Thị H Nguyễn Thị H Dƣơng Thị Thanh V 48 34 43 42 39 26 45 25 35 33 36 41 48 30 41 40 45 31 30 26 47 34 47 34 30 35 36 47 42 34 39 47 44 38 Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 M108 M109 M110 M111 M112 M113 M114 M115 M116 M117 M118 M119 M120 M121 M122 M123 M124 M125 M126 M127 M128 M129 M130 M131 M132 M133 M134 M135 M136 M137 M138 M139 M140 M141 M142 M143 M144 M145 Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm ID ID II ID DD DD II II ID II DD ID Phạm Thị H Lê Minh N Dƣơng Thị Phƣơng H Đỗ Thị Phƣơng U Nguyễn Thùy N Nguyễn Thị H Nguyễn Thu T Ngô Thị H Bùi Thị Thu A Nguyễn Thu H Lê Thị G Bùi Thị H ID DD ID DD ID ID ID ID II ID II ID ID II II ID ID II ID ID ID II II DD II ID Trần Thị Thu H Nguyễn Thị N Trần Thị Thu T Trần Thị P Nguyễn Thùy L Lê Thị Đ Lƣơng Thị Thanh H Cao Thanh T Lƣơng Thị Ngọc M Nguyễn Phƣơng M Trần Bùi Khánh L Nguyễn Thị Vi A Đinh Thị G Trần Ngọc D Bùi Thị D Trần Thị H Bùi Thị Tuyết N Nguyễn Thị D Trần Cẩm N Trƣơng Thị Phƣơng C Nguyễn Thị Phƣơng T Nguyễn Thị L Nguyễn Thị Kim N Trần Thị H Nguyễn Hà C Nguyễn Thị N 37 44 40 32 25 46 26 31 24 17 47 21 41 25 23 35 23 29 20 20 20 20 20 20 20 21 20 21 21 20 20 20 21 20 22 20 20 20 Nữ Nữ Nữ Nữ nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 M146 M147 M148 M149 M150 M151 M152 M153 M154 M155 M156 M157 M158 M159 M160 M161 M162 M163 M164 M165 M166 M167 M168 M169 M170 M171 M172 M173 M174 M175 M176 M177 M178 M179 M180 M181 M182 M183 M184 Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm II DD ID ID ID ID ID ID ID II DD DD DD II ID II ID ID ID DD ID ID DD DD DD ID ID DD ID DD ID DD II II DD ID II ID DD Phạm Thị H Tô Phƣơng T Phạm Minh T Nguyễn Thị Thanh H Nguyễn Khánh L Mai Thị Q Nguyễn Thị Hải Y Nguyễn Thị Thanh L Nguyễn Thị N Đỗ Thị Thu T Bùi Yến L Đào Thị L Trần Thị L Giang Thị L Tạ Bích L Đỗ Thị Minh H Hồng Nhƣ P Phạm Thị N Đào Thị H Nguyễn Hoài L Vũ Thị Thu H Trần Thị Thùy L Nguyễn Lệ T Vũ Thị Vân A Phạm Thị Minh H Trần Thị Thu H Trần Thị Thùy L Đào Vân A Kiều THỊ THÙY L Lê Thu H Mai Hƣơng L NGUYỄN Quốc Đ Lê Thúy H Lê Lan D ĐÀO THỊ Kiều C Tống Thanh T Đỗ Thị Thu H Đàm Thị Thái H Nguyễn Thị G 21 20 20 20 22 20 20 20 20 20 20 20 21 20 20 20 20 20 20 20 20 20 21 20 20 20 20 19 33 36 33 Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 M185 M186 M187 M188 M189 M190 M191 M192 M193 M194 M195 M196 M197 M198 M199 M200 M201 M202 M203 M204 M205 M206 M207 M208 M209 M210 M211 M212 M213 M214 M215 M216 M217 M218 M219 M220 M221 Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm II DD DD ID II ID II II ID ID ID ID DD II II II II DD ID DD II II DD ID ID ID II II DD II ID II ID ID DD ID II Hứa Hồng T Đặng Chòi N Lƣơng Thị H Lê Thị N Nông Thị H Nguyễn Lan H Đinh Thị Ngọc B Lê Thị Đỗ Q Lê Thị T Đinh Thị Cẩm L Nguyễn Thị Minh L Lê Tuệ N Trần Thị T Nguyễn Thị Thúy H Mai Thị H Nguyễn Thị Kiều H Doãn Thị N Nguyễn Thị P Dƣơng Thị Lan H Trần Thị Thu H Nguyễn Thị Thúy N Hồng Thị D Ngơ Phƣơng U Lê Thị Thúy B Trần Thị Minh H Ngô Thị T Trần Thị Thu T Đinh Thị Thu H Chu Thị X Nguyễn Thị L Dƣơng Thị Lan H Trƣơng Thị Thu A Nguyễn Thị M Nguyễn Thị L Nguyễn Thị H Hà Thị Thúy H Nguyễn Thị D Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Danh sách mẫu máu bệnh nhân thalassemia cung cấp Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng STT Ký hiệu Kiểu gen Họ tên Tuổi Thalassemia Giới tính 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 ID II ID ID ID DD ID ID ID ID ID DD ID ID II II II II II DD ID II ID ID ID DD ID ID II ID ID ID DD Hà Thị T Trần Thị H Lê Lan D Trần Thị L Ng Thị Huyền T Lê Thị T Dƣơng Huyền T Ng Thị L Trần Thị N Lý Hƣơng C Đỗ Thị T Cầm Thị Khánh L Nguyễn Thùy A La Vân A Lê Thị C Nguyễn Thị H Nguyễn Thị Hải Y Nguyễn Huyền L La Huyền T Nguyễn Thị T Nguyễn Thị N Nông Thị H Ma Thị N Trƣơng Thị H Nguyễn Thị T Vũ Thị Kim L Hoàng Cẩm L Nguyễn Phƣơng D Nguyễn Thị Bạch K Dƣơng Hải T Ma Thị H Nguyễn Thị H Tạ Thị N 26 11 20 20 32 22 26 16 28 40 11 22 19 10 22 21 20 31 40 27 24 28 21 Thalassemia Beta-thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Beta-thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 T34 T35 T36 T37 T38 T39 T40 T41 T42 T43 T44 T45 T46 T47 T48 T49 T50 T51 T52 T53 T54 T55 T56 T57 T58 T59 T60 T61 T62 ID II ID II II ID ID ID II ID II II ID ID ID ID ID ID II II ID ID II ID ID ID ID II DD Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm Trần Thị N Nguyễn Thị T Đinh Phƣơng T Trịnh Thị Minh N Lê Thị Hồng A Ma Thị Thu H Hà Thị T Ng Thị Thu T Tạ Thị C Hoàng Minh T Nguyễn Thị H Nguyễn Tuyết L Vũ Mạnh Q Phạm Thị L Trịnh Thị N Ma Thị N Chẩu Thi L Nguyễn Thị P Lý Thị Thu T Nguyễn Thị T Hà Lê Kiều T Bùi Thanh H Lò Thị T Đào Thị M Trần Thị Thu P Giáp Thị L Đinh Thị H Đinh Hoàng Tú N Nông Thị D 20 18 11 13 28 14 34 53 30 13 52 52 26 44 16 24 17 15 27 19 34 Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Beta-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Quy trình tách DNA tổng số sử dụng kit PureLink® Genomic DNA (Invitrogen) DNA đƣợc tách chiết từ mẫu mô bệnh nhân ung thƣ vú sử dụng kit PureLink® Genomic DNA (Invitrogen) Quy trình gồm bƣớc nhƣ sau:  Cân khoảng 25 mg mẫu mô, cắt nhuyễn  Thêm 180 µL Digestion Buffer 20 µL Proteinase K trộn  Ủ 55 oC qua đêm, 15-20 phút trộn mẫu lần, trộn khoảng 4-5 lần trƣớc để mẫu qua đêm  Ly tâm 12 000 vòng/phút phút, chuyển dịch sang ống eppendorf  Thêm 20 µL RNase A, trộn đều, ủ phút nhiệt độ phịng  Thêm 200 µL Lysis Binding trộn  Thêm 200 µL Ethanol 99%, dùng pipet trộn  Chuyển dịch lên cột, ly tâm 12 000 vòng/phút phút  Chuyển cột sang ống thu thêm 500 µL Wash Buffer 1, ly tâm 12 000 vòng/phút phút  Chuyển cột lên ống thu thêm 500 µL Wash Buffer 2, ly tâm 12 000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng  Đặt cột lên ống eppendorf 1,5 ml Thêm 100 µL Elution Buffer ủ nhiệt độ phịng phút  Ly tâm 13 000 vòng/phút phút, thu đƣợc DNA tổng số Bảo quản -20 oC TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Quy trình tách DNA tổng số sử dụng kit ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega) DNA đƣợc tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia kit ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega) Quy trình gồm bƣớc nhƣ sau:  Mẫu máu đƣợc trộn nhẹ nhàng 10 phút  Chia 20 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml  Thêm 200 µL máu vào ống  Thêm 200 µL Cell Lysis Buffer, trộn ủ 10 phút 56 oC  Bổ sung 250 µL Binding Buffer, trộn  Chuyển hỗn hợp lên cột Ly tâm với tốc độ 13 000 vòng/phút phút  Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml Bổ sung 500 µL dung dịch Column Wash Ly tâm với tốc độ 13 000 vòng/phút phút, bỏ dịch Lặp lại bƣớc lần  Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml Thêm 200 µL Elution Buffer, ly tâm tốc độ 13 000 vòng/phút phút Thu dịch chứa DNA Bảo quản dịch chứa DNA -20 oC TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Quy trình tinh sản phẩm PCR sử dụng ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Sản phẩm PCR đƣợc tinh ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent gồm bƣớc:  Cho µL sản phẩm PCR vào ống eppendorf 1,5 ml  Bổ sung µL ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent vào ống trộn  Ủ hỗn hợp 37 oC 15 phút để enzyme phân giải dNTPs mồi thừa phản ứng PCR  Ủ hỗn hợp 80 oC 15 phút để bất hoạt enzyme Sản phẩm tinh sau đƣợc sử dụng để giải trình tự trực tiếp TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25- Sinh học thực. .. cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Bùi Thị Thu Anh TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25- Sinh học thực nghiệm BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT... skknchat@gmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25- Sinh học thực nghiệm xanh) Để thu đƣợc băng đặc hiệu nhất, tiếp tục chuẩn điều kiện tăng nhiệt độ gắn mồi lên 60 oC thu đƣợc kết Hình