CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Giải trình tự sản phẩm PCR
Để khẳng định sự khuếch đại đặc hiệu chúng tôi tiến hành tinh sạch và giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của cả 2 cặp mồi (Phụ lục 3). Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 490 bp đƣợc so sánh với ngân hàng gen NCBI, chúng tơi thu đƣợc kết quả tƣơng đồng 100% với trình tự của gen APOBEC3B trên NST 22 của ngƣời, phù hợp với mục đích phát hiện alen ngun vẹn (Hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 490 bp khuếch đại bằng cặp mồi Ins-F và Ins-
R với ngân hàng gen NCBI. “Query”: trình tự sản phẩm PCR (đoạn 490 bp); “Sbjct”: trình tự đoạn gen tham chiếu trên nhiễm sắc thể 22 của ngƣời; “Identities”: độ tƣơng đồng tính theo tỷ lệ % các nucleotide giống nhau trên tổng số nucleotide đƣợc so sánh.
Khi so sánh đoạn 700 bp với cơ sở dữ liệu chúng tôi thấy 100% tƣơng đồng với hệ gen ngƣời mang mất đoạn APOBEC3B hoàn toàn trùng khớp với trình tự
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 700 bp khuếch đại bằng mồi Del-F và Del-R
với ngân hàng gen NCBI. Query: trình tự sản phẩm PCR (đoạn 700 bp); Sbjct: trình tự đoạn gen tham chiếu trên nhiễm sắc thể 22 mang mất đoạn APOBEC3B của ngƣời [76].
Trên đoạn 700 bp chúng tơi xác định đƣợc trình tự của hai gen APOBEC3A
và APOBEC3B, vị trí xảy ra đa dạng mất đoạn trên APOBEC3A là 38962626 (thuộc exon 5) và trên APOBEC3B là 38992562 (thuộc exon 8). Bên cạnh đó chúng tơi xác định đƣợc 350 bp tƣơng đồng của hai gen nơi xảy ra trao đổi tƣơng đồng khơng alen dẫn tới mất đoạn (Hình 3.8). Trên đoạn 700 bp xác định đƣợc hồn tồn trình tự 350 bp tƣơng đồng; trong khi đoạn 490 bp chỉ xác định đƣợc 255 bp (95 bp cịn lại nằm ngồi vùng khuếch đại của cặp mồi Ins-F/R).
Hình 3.8. Vị trí xảy ra đa dạng mất đoạn APOBEC3B trên đoạn gen 700 bp khuếch đại bằng mồi Del-F và Del-R.
Nhƣ vậy, hai đoạn trình tự 490 bp và 700 bp chúng tơi thu đƣợc chính xác và đại diện cho alen nguyên vẹn và alen mất đoạn. Các kết quả trên một lần nữa khẳng định tính chính xác của các mồi dùng trong nghiên cứu đảm bảo đƣợc độ tin cậy và khơng có hiện tƣợng dƣơng tính giả.