CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.5. Phƣơng pháp xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B
1.5.2. Phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime-PCR)
Realtime-PCR là kỹ thuật PCR mà trong đó kết quả khuếch đại DNA đích đƣợc hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Do đó, khơng cần phải tiến hành các thí nghiệm xác định và kiểm tra sản phẩm bằng điện di nên tiết kiệm thời gian và công sức. Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng chất gắn huỳnh quang để phát hiện sự khuếch đại của DNA đích. Hai phƣơng pháp phổ biến để xác định các sản phẩm khuếch đại trong realtime-PCR là: (1) Thuốc nhuộm huỳnh quang có khả năng gắn với sợi đơi DNA (ví dụ SYBR Green) và (2) các đầu dò oligonucleotide đƣợc đánh dấu huỳnh quang bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA đích chỉ phát tín hiệu khi sản phẩm đƣợc tổng hợp (ví dụ Taqman probe, Beacon probe) [8]. Hai
Hình 1.11. Phƣơng pháp phát hiện sản phẩm realtime-PCR. Phƣơng pháp dùng
thuốc nhuộm huỳnh quang khi có mặt DNA đƣợc khuếch đại nó sẽ chèn vào và phát tín hiệu huỳnh quang giúp định lƣợng sản phẩm PCR. Phƣơng pháp sử dụng các đầu dò đặc hiệu gắn huỳnh quang dùng một đoạn oligonucleotide với đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (đƣợc gọi là reporter) và đầu 3’ gắn chất hấp thụ tƣơng ứng (gọi là quencher). Trong giai đoạn gắn mồi của phản ứng PCR, đầu dị gắn bổ sung với trình tự DNA đích. Đến giai đoạn tổng hợp, enzyme Taq DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’ sẽ phân giải reporter khỏi quencher giúp giải phóng tín hiệu huỳnh quang tới thiết bị ghi nhận tín hiệu [8, 72].
Với kỹ thuật realtime-PCR hai nhóm nghiên cứu của Long (2013) và Xuan (2013) sử dụng phƣơng pháp 2ΔΔCt (Ct - chu kỳ ngƣỡng) đã xác định thành công kiểu gen đa dạng mất đoạn APOBEC3B. Cơng thức ΔΔCt đƣợc tính tốn nhƣ sau:
ΔΔCt = (Ct gen nội kiểm − Ct gen khảo sát) mẫu nghiên cứu – (Ct gen nội kiểm − Ct gen khảo sát) mẫu đối chứng . Hai nghiên cứu đã đƣa ra đƣợc mối liên hệ của đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ ung thƣ vú của phụ nữ Trung Quốc và phụ nữ châu Âu [15, 36].