CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Tối ƣu điều kiện phản ứng PCR
Chúng tôi sử dụng cặp mồi Ins-F/R để khuếch đại đoạn 490 bp đại diện cho alen nguyên vẹn và cặp mồi Del-F/R để khuếch đại đoạn 700 bp đại diện cho alen mất đoạn APOBEC3B. Tuy nhiên, sự tƣơng đồng trình tự giữa các thành viên trong họ gen APOBEC3 đặc biệt là giữa APOBEC3A và APOBEC3B (tƣơng đồng khoảng 92% khi so sánh trên ngân hàng gen NCBI) khiến mồi gắn không đặc hiệu và khuếch đại băng phụ. Vì vậy cần phải tối ƣu điều kiện PCR để thu đƣợc băng đặc hiệu với kích thƣớc mong muốn.
Để tiến hành chuẩn hóa điều kiện phản ứng PCR, trƣớc tiên chúng tơi chọn 2 mẫu ung thƣ vú ngẫu nhiên và thực hiện phản ứng PCR đơn mồi với từng cặp mồi Ins-F/R và Del-F/R, thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 3.1. Sản phẩm PCR đƣợc
C
Bảng 3.1. Điều kiện phản ứng PCR ban đầu
Cặp mồi Ins-F/R Cặp mồi Del-F/R
Thành phần Thể tích
(µL) Thành phần
Thể tích (µL)
H2O 4,1 H2O 3,9
Gotaq Master Mix 2x 7,5 Gotaq Master Mix 2x 7,5
Mồi Ins-F (10 µM) 0,2 Mồi Del-F (10 µM) 0,3
Mồi Ins-R (10 µM) 0,2 Mồi Del-R (10 µM) 0,3
Khn (20-30 ng) 3,0 Khuôn (20-30 ng) 3,0
Tổng 15,0 Tổng 15,0
Chu trình nhiệt chung cho cả hai cặp mồi
Giai đoạn biến tính bƣớc đầu: 94 o
C 5 phút Các giai đoạn trong chu kỳ: [94 o
C 30 giây 57 oC 30 giây 72 oC 30 giây]x40 chu kỳ Giai đoạn tổng hợp bƣớc cuối: 72 o
C 5 phút
Hình 3.2. Kết quả phản ứng PCR. (-): đối chứng âm bổ sung H2O thay DNA khuôn. Mẫu
V1, V2: mẫu ung thƣ vú. TC: thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Với điều kiện đƣợc trình bày trong Bảng 3.1, mẫu V2 khuếch đại bởi cặp mồi Del-F/R xuất hiện băng không đặc hiệu khoảng 390 bp (trong khung màu
xanh). Để thu đƣợc một băng đặc hiệu duy nhất, chúng tôi tiếp tục chuẩn điều kiện tăng nhiệt độ gắn mồi lên 60 o
C và thu đƣợc kết quả ở Hình 3.3 A.
Hình 3.3. Kết quả tối ƣu tăng nhiệt độ gắn mồi của phản ứng PCR. Kết quả điện di riêng rẽ
sản phẩm PCR của từng cặp mồi (A). Kết quả trộn sản phẩm PCR (B). (-): đối chứng âm bổ sung H2O thay DNA khuôn. Mẫu V1, V2: mẫu ung thƣ vú. TC: thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Sau khi tăng nhiệt độ gắn mồi, băng chính sáng rõ và khơng cịn xuất hiện băng phụ. Sản phẩm PCR của 2 cặp mồi đƣợc trộn với nhau để điện di qua đó tiết kiệm thời gian, hóa chất và dễ dàng kết luận kiểu gen của mỗi mẫu (Hình 3.3 B). Mẫu V1 có cả alen nguyên vẹn và alen mất đoạn đƣợc chọn làm đối chứng dƣơng cho những thí nghiệm tiếp theo.
Sử dụng điều kiện trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú khác V3, V4, V5. Tuy nhiên, phát hiện một số mẫu vẫn xuất hiện băng phụ (trong khung màu xanh Hình 3.4). Đặc biệt mẫu V4 xuất hiện băng phụ khoảng 390 bp đậm hơn băng chính 700 bp vì vậy cần tiếp tục tối ƣu điều kiện PCR.
Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra đa dạng mất đoạn APOBEC3B trên bệnh phẩm ung thƣ
vú. (-): đối chứng âm bổ sung H2O thay DNA khuôn. (+): đối chứng dƣơng là mẫu ung thƣ vú kiểu gen dị hợp mất đoạn APOBEC3B. V3, V4, V5: mẫu ung thƣ vú. TC: thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Chúng tôi sử dụng nguyên lý của kỹ thuật Touchdown-PCR (TD-PCR) để tối ƣu phản ứng. TD-PCR sử dụng nhiệt độ gắn mồi ban đầu lớn hơn nhiệt độ nóng chảy dự kiến (Tm) của mồi, sau đó dần dần chuyển tiếp đến một nhiệt độ gắn mồi thấp hơn trong các chu kỳ kế tiếp. Việc sử dụng nhiệt độ gắn mồi ban đầu lớn tạo điều kiện khắt khe để loại bỏ trƣờng hợp gắn mồi khơng chính xác với khn [16]. Chúng tôi sử dụng các nhiệt độ gắn mồi khác nhau cuối cùng đã tối ƣu thành công chu trình nhiệt (Mục 2.3.3) và thu đƣợc kết quả thể hiện trên Hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả tối ƣu điều kiện phản ứng PCR. (-): đối chứng âm bổ sung H2O thay DNA khuôn. (+): đối chứng dƣơng là mẫu ung thƣ vú kiểu gen dị hợp mất đoạn
APOBEC3B. V3, V4, V5: Mẫu ung thƣ vú. TC: thang chuẩn 100 bp (Fermentas).
Chúng tôi đã tối ƣu thành công điều kiện phản ứng PCR để xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B. Sản phẩm PCR của mẫu (+) đƣợc tinh sạch và dùng trực tiếp để giải trình tự và tách dịng để làm đối chứng dƣơng cho phản ứng PCR.