CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.5. Phƣơng pháp xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B
1.5.1. Phƣơng pháp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
MLPA đƣợc áp dụng để xác định những thay đổi bất thƣờng về số bản sao của các trình tự DNA trong hệ gen. Nguyên tắc của MLPA dựa trên việc khuếch đại đồng thời nhiều đầu dị thay vì khuếch đại trực tiếp từ khn DNA. Phƣơng pháp này gồm 5 bƣớc chính là (1) biến tính DNA, (2) lai đầu dò với trình tự đích, (3) thực hiện phản ứng nối giữa hai đầu dò cạnh nhau, (4) PCR khuếch đại đầu dò sau nối và (5) điện di mao quản để xác định số bản sao. Các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp MLPA đƣợc trình bày trên Hình 1.9.
Hình 1.9. Các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp MLPA. Đầu dò đƣợc thiết kế chứa trình tự gắn đặc hiệu với đích (màu xanh dƣơng), trình tự gắn mồi F, R (màu xanh lá mạ) và đoạn trình tự có kích thƣớc khác nhau (màu đỏ). Đầu tiên DNA đích đƣợc biến tính và lai với đầu dị. Đầu dị gắn khơng đặc hiệu sẽ đƣợc rửa đi, sau đó thực hiện phản ứng nối, hai đầu dò gắn đặc hiệu với đích cạnh nhau đƣợc nối lại nhờ enzyme ligase. Sau khi phản ứng nối diễn ra, các đầu dị trở thành khn cho phản ứng PCR sử dụng một cặp mồi duy nhất. Sản phẩm PCR đƣợc xác định kích thƣớc bằng điện di mao quản (sử dụng mồi F gắn chất phát huỳnh quang). Cuối cùng xác định số bản sao dựa vào kích thƣớc khác nhau của đoạn DNA đƣợc khuếch đại [44].
Ƣu điểm của phƣơng pháp MLPA là đơn giản, có độ chính xác cao và sau một phản ứng PCR có thể xác định đƣợc đa dạng mất đoạn của một cá thể. Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật này, nhóm nghiên cứu của Klonowska (2017) đã sử dụng 2 cặp đầu dò lai đặc hiệu với gen APOBEC3A và APOBEC3B, trên 2 cặp đầu dị thiết kế có 3 vị trí gắn của mồi F, R1 và R2 (Hình 1.10). Cặp mồi F và R1 đƣợc sử dụng để khuếch đại băng kích thƣớc 572 bp đặc hiệu cho alen nguyên vẹn (ký hiệu là I).
Cặp mồi F và R2, khi xảy ra mất đoạn sẽ kết hợp với nhau, khuếch đại băng có kích thƣớc 707 bp đặc hiệu cho alen mất đoạn (ký hiệu là D). Dựa trên sự xuất hiện băng sản phẩm PCR khác nhau giúp xác định đƣợc 3 kiểu gen của đa dạng mất đoạn
APOBEC3B. Nghiên cứu đã đƣa ra tần suất alen mất đoạn APOBEC3B tại Ba Lan
(6,5%) và góp phần vào bản đồ tần suất mất đoạn này trên thế giới [33].
Hình 1.10. Vị trí đầu dị và mồi trong kỹ thuật MLPA phát hiện đa dạng mất đoạn
APOBEC3B. Màu xanh và da cam biểu diễn exon của gen APOBEC3A và APOBEC3B. Màu đen thể hiện đầu dị, mũi tên thể hiện vị trí của mồi [33].