Nghiên cứu sơ chế, chiết xuất polysaccharide và triterpenoid thô từ quả thể nấm Linh chi

Bài viết Nghiên cứu sơ chế, chiết xuất polysaccharide và triterpenoid thô từ quả thể nấm Linh chi được nghiên cứu nhằm làm rõ ảnh hưởng của kỹ thuật sơ chế nguyên liệu, chiết xuất đến kết quả khai thác polysaccharide và triterpenoid từ nấm Linh chi (Ganoderma lucidum).

ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 3, 2021 41 NGHIÊN CỨU SƠ CHẾ, CHIẾT XUẤT POLYSACCHARIDE VÀ TRITERPENOID THÔ TỪ QUẢ THỂ NẤM LINH CHI PRELIMINARY PROCESSING, EXTRACTION OF TOTAL POLYSACCHARIDES AND TRITERPENOIDS FROM GANODERMA LUCIDUM FRUITING BODY Phạm Châu Huỳnh1*, Lê Văn Tình1, Lê Thị Thảo Tiên2, Phan Tiến Dũng1, Nguyễn Bá Ngọc3, Đặng Quang Hải4, Mạc Thị Hà Thanh4, Huỳnh Thị Kim Cúc3 Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng Trường Cao đẳng Lương thực - Thực phẩm Viện Phát triển Công nghệ Xanh Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng *Tác giả liên hệ: huynhpc@danang.gov.vn (Nhận bài: 21/9/2020; Chấp nhận đăng: 06/3/2021) Tóm tắt - Nghiên cứu nhằm làm rõ ảnh hưởng kỹ thuật sơ chế nguyên liệu, chiết xuất đến kết khai thác polysaccharide triterpenoid từ nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) Thực nghiệm cho thấy, hiệu suất thu nhận hoạt chất cải thiện xử lý thể nấm phương pháp ủ – sấy lạnh đông sâu – nghiền, giảm kích thước bột xay, tăng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, tăng thời gian ngâm, tăng số lần chiết lặp Hiệu suất thu nhận, thành phần chất chiết cịn phụ thuộc thành phần dung mơi (trong chiết xuất đơn) thứ tự sử dụng dung mơi (trong chiết xuất kép) Chiết nước thu ~100w% polysaccharide ~16–20w% triterpenoid có nguyên liệu, chiết tiếp EtOH thu kiệt phần triterpenoid lại bã Ngược lại, chiết EtOH, thu ~100w% triterpenoid nguyên liệu dịch chiết không chứa polysaccharide, sau tiếp tục chiết bã nước, thu ~78,5w% lượng polysaccharide có nguyên liệu Abstract - This study was aimed to clarify the effects of raw material preliminary processing, extraction technique on the extraction of polysaccharides and triterpenoids from Ganoderma lucidum fruiting body It was shown that the extraction efficiency of the active substances could be improved with the mushroom processed by annealing - drying or deep freezing – crushing, or by reducing the size of the raw material, increasing the ratio of solvent/raw materials, the immersion time, and the number of repetitions The extraction efficiency and the extract composition were shown depended on the solvent content (in single extraction) and the order in which the solvents were used (in double extraction) Extraction with water as the solvent was able to collect ~100w% polysaccharide and ~16–20w% triterpenoids in the materials, and further extraction with EtOH could harvest the remaining triterpenoid in the residues In contrary, in the extraction with EtOH, ~100w% triterpenoid was obtained from the raw material, the resulted extract contained no polysaccharide, and in further extraction of the residue with water, only ~78.5w% of the polysaccharide in the raw material was obtained Từ khóa - Linh chi (Ganoderma lucidum); polysaccharide; triterpenoid; chiết xuất; hiệu chiết xuất Key words - Lingzhi (Ganoderma lucidum); polysaccharide; triterpenoid; extraction; extraction efficiency Giới thiệu Cùng với phát triển khoa học công nghệ hợp chất thiên nhiên, nấm dược liệu ngày quan tâm giàu hoạt chất có khả chữa bệnh Nấm hương, nấm Khiêu vũ (Maitake), nấm Thái Dương (Agaricus) Linh chi (Ganoderma lucidum) nấm dược liệu điển hình Trong cộng đồng người Việt Nam, Linh chi Đông dược quý, sử dụng để tăng khả kháng bệnh tuổi thọ Khoa học thực chứng cho thấy, thể, sợi nấm, bào tử Linh chi giàu thành phần có hoạt tính sinh học, quan trọng polysaccharide tan nước (Gl-PS; chủ yếu β-1,3-glucan) triterpenoids (Gl-TP) [1] Cả Gl-PS [2], [3], Gl-TP [4], [5] hỗn hợp chiết thô từ Linh chi [6] chứng minh có hoạt tính kháng dạng khối u Hoạt chất Linh chi thể hiệu điều trị 20 loại bệnh, tăng huyết áp, hen suyễn, viêm phế quản, bệnh tim mạch… [1] Linh chi thường sử dụng hình thức ngâm rượu, bột mịn để pha vào đồ uống, thái lát/xay nhỏ sắc uống trà Một hướng chế biến chiết hoạt chất, sau đặc thành cao, sấy khơ đóng viên nang Dù vậy, chưa thấy có cơng bố cách hệ thống kỹ thuật sơ chế nguyên liệu chiết xuất hoạt chất từ Linh chi Mục đích nghiên cứu khảo sát điều kiện kỹ thuật công đoạn xử lý chiết xuất thể nấm nhằm thu nhận Gl-PS Gl-TP phục vụ hướng phát triển sản phẩm giá trị gia tăng từ chất chiết Linh chi Vật liệu Phương pháp 2.1 Vật liệu Nấm Linh chi (tươi) thu nhận từ Hợp tác xã Nấm An Hải Đông (TP Đà Nẵng) Chloroform (≥ 99%, khan), n-butanol (99,5w%, AR), methanol (MeOH; ≥ 99,8w%), vanillin (99w%), acetonitrile (99,8w%, khan), dichloromethane (≥ 99,9w%), phenol (≥ 99,5w%), Danang Centre for Biotechnology (Pham Chau Huynh, Le Van Tinh, Phan Tien Dung) College of Food Industry (Le Thi Thao Tien) Institute of Green Technology Development (Nguyen Ba Ngoc, Huynh Thi Kim Cuc) The University of Danang - University of Science and Technology (Hai Quang Dang, Thanh Ha Thi Mac) 42 Phạm C Huỳnh, Lê V Tình, Lê T T Tiên, Phan T Dũng, Nguyễn B Ngọc, Đặng Q Hải, Mạc T H Thanh, Huỳnh T K Cúc perchloric acid (ACS reagent, 60w%), thuốc thử Folin – Ciocalteu, oleanolic acid (chuẩn phân tích), lovastatin (chuẩn phân tích), petroleum ether (ACS reagent) từ Sigma – Aldrich D-glucose (chuẩn phân tích) từ Supelco Ethanol (EtOH; ≥ 99,9w%) từ Xilong Scientific 2.2 Phương pháp 2.2.1 Thu nhận xử lý mẫu nấm Quả thể nấm Linh chi tươi thu nhận theo Codex Methods of Sampling (năm 2004), loại bỏ dị vật, trộn để đồng mẫu, đưa vào thử nghiệm ngay, sấy hồng ngoại đến độ ẩm ~7w% bảo quản ~5°C, từ triển khai cho thí nghiệm 2.2.2 Thử nghiệm sơ chế nguyên liệu a Phương pháp sơ chế nguyên liệu Mẫu thể Linh chi tươi cắt thành mảnh (~2*2 cm), trộn đều, xử lý phương pháp: (1) Xử lý vi sóng phút, sau sấy khơng khí đối lưu 55°C 10 đến ~9w% ẩm (M-IRD, microwave treatment - infrared drying); (2) Sấy xạ hồng ngoại (λ~940nm) ~50°C 10 đến ~7w% ẩm (IR-D, infrared drying); (3) Làm dập, ủ 45°C 12 giờ, sau sấy xạ hồng ngoại (λ~940nm) ~50°C 10 đến ~7w% ẩm (F-IRD, fermentation – infrared drying); (4) Lạnh đơng sâu đến -70°C, sau nghiền vụn (ULT-G, ultra-low temperature freezing grinding) Mẫu chứng thể nấm tươi (FR, fresh sample) Các mẫu sau xử lý mẫu chứng phân tích hàm lượng Gl-PS Gl-TP theo phương pháp trình bày Mục 2.2.5 b Mức độ làm nhỏ nguyên liệu Quả thể nấm Linh chi khơ xay thành nhóm bột theo kích thước: d≤2mm, d≤3mm, d≤5mm, d≤10mm (sử dụng máy nghiền búa, tốc độ 4500 vịng/phút, sàng với kích thước lỗ khác nhau) Các mẫu bột theo kích thước chiết xuất Gl-PS Gl-TP cách độc lập, theo quy trình tham khảo từ [7] [9], có điều chỉnh, với dung mơi tương ứng nước EtOH (được chọn theo đặc tính tan hoạt chất) Để chiết Gl-PS, g mẫu ngâm 100mL nước 80°C, thu lấy dịch chiết lọc qua giấy lọc (Whatman No 4, Ø 20–25µm) Q trình lặp lần, dịch chiết phối trộn định lượng hoạt chất Đối với Gl-TP, thực tương tự trên, với dung môi EtOH (> 99.5w%) 2.2.3 Nghiên cứu điều kiện chiết xuất Chiết Gl-PS nước 80°C Gl-TP EtOH 99,5w% 80°C độc lập nhau, sử dụng bột Linh chi khô, độ ẩm ban đầu ~7w%, kích thước d≤3mm Về bản, quy trình chiết hoạt chất gồm cơng đoạn: (1) Phân tán g bột nấm vào dung môi (nước; EtOH) 80°C; (2) Ngâm nguyên liệu dung môi 80°C kết hợp khuấy đảo 90 phút; (3) Lọc chân không qua giấy lọc (Whatman No 4) để thu nước chiết Các thí nghiệm cụ thể sau: - Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: Chiết Gl-PS với mức tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (nước): 20/1, 30/1, 60/1 (L/kg) Lặp lại quy trình chiết lần Thực tương tự cho Gl-TP; dùng dung môi EtOH (>99.5V%) - Thời gian ngâm: Chiết Gl-PS với mức thời gian ngâm mẫu: 30, 60, 90 120 phút Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/20 Lặp lại quy trình chiết lần Thực tương tự với Gl-TP; dùng dung môi EtOH (>99,5V%) - Thực nghiệm số lượt chiết xuất Chiết Gl-PS nhiều lần: Đối với g Linh chi, tiến hành chiết Gl-PS lặp lần với dung môi nước Dịch chiết sau lần định lượng Gl-PS Chiết Gl-TP nhiều lần: Đối với g Linh chi, tiến hành chiết Gl-TP lặp lần với dung môi EtOH (>99,5V%) Dịch chiết từ lần định lượng Gl-TP 2.2.4 Khảo sát mô thức chiết xuất a Chiết xuất đơn (single extraction) Chiết bột nấm (d≤3mm) hỗn hợp dung môi EtOH (>99,5%) – nước 80°C, với nồng độ EtOH: 0, 25, 50, 75, 100V% Ứng với nồng độ EtOH, g mẫu ngâm 100mL dung môi 80°C, lọc hỗn hợp qua giấy lọc (Whatman No 4) thu dịch chiết Quá trình lặp lần Dịch chiết trộn định lượng hoạt chất Hiệu chiết (Eef) xác định theo công thức: 𝐴𝑆𝑠 𝐸𝑒𝑓 = ∗ 100% 𝐴𝑆0 Trong đó, ASs (mg) khối lượng hoạt chất chiết được, AS0 (mg) khối lượng hoạt chất có nguyên liệu ban đầu (xác định Mục 2.2.4) b Chiết xuất kép (double/dual extraction) Phương án (PA 1): Chiết xuất Gl-PS từ bột nấm Linh chi nước, sau chiết Gl-TP EtOH (>99,5w%) Trong thực nghiệm, g bột Linh chi (d≤3mm) ngâm 100mL dung môi 80°C, thu lấy dịch chiết lọc qua giấy lọc (Whatman No 4) Quá trình lặp lần, dịch chiết phối trộn định lượng hoạt chất Phương án (PA 2): Chiết xuất Gl-TP từ bột nấm Linh chi EtOH, sau sử dụng bã làm nguyên liệu để chiết Gl-PS nước Cách thực cụ thể PA 2.2.5 Phân tích định lượng hoạt chất a Phân tích định lượng Gl-PS Gl-PS chiết từ mẫu nấm theo phương pháp [7], có điều chỉnh Hai gram mẫu ngâm 50 mL nước 85°C giờ, sau lọc chân khơng qua giấy lọc (Whatman No 4) thu nước chiết Quá trình lặp lần Nước chiết trộn chung cô đặc đến ~100 mL, bổ sung 200 mL EtOH tuyệt đối, để yên 4°C 12 Hỗn hợp sau ly tâm (5000 vịng/phút, 10 phút), loại bỏ phần lỏng; Phần rắn rửa EtOH tuyệt đối làm khô, thu Gl-PS thô Gl-PS định lượng dựa phản ứng màu polysaccharide đơn phân (D-glucose) với phenol H2SO4 đặc [8] Cụ thể, Gl-PS thơ hịa tan định mức nước cất đến 25 mL Một mL dung dịch trộn với mL phenol 5w% mL H2SO4 đặc Hỗn hợp lắc 30 phút, sau đo độ hấp thụ (OD) bước sóng hấp thụ cực đại (λmax ~490 nm; Spectrophotometer Cary 60) Hàm lượng đường tính tốn dựa đường chuẩn glucose (Hình 1) ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 3, 2021 chiết theo kích thước bột xay Lượng Gl-TP thu từ bột nhóm d≤2mm, d≤3mm, d≤5mm tương đương nhau, ~1,20 lần so với lượng thu từ nhóm bột d≤10mm Trong đó, với kích thước bột khảo sát, hiệu chiết Gl-PS cao bột xay mịn So với chiết từ bột d≤10mm, hiệu chiết Gl-PS đạt 1,05, 1,10, 1,70 lần tương ứng với bột kích thước d≤3mm, d≤5mm, d≤10mm G l- P S & G l- T P , [w % ] b Phân tích định lượng Gl-TP Gl-TP chiết định lượng theo phương pháp [9], có điều chỉnh Hai gram bột mẫu cho vào 50mL EtOH 95V%, ngâm 70°C giờ, sau lọc chân khơng qua giấy lọc (Whatman No 4) thu lấy dịch chiết Quy trình lặp lần Nước chiết hỗn hợp cô đặc áp suất thấp thành sệt sấy khô 80°C Chất chiết khô rửa ~25 mL nước cất 10 phút sấy khô 80°C Thêm mL ether dầu vào chất chiết khô, siêu âm phút, để yên 10 phút ly tâm thu phần lắng Chất lắng rửa mL chloroform (2 lần), chưng áp suất thấp để loại chloroform, thu Gl-TP tinh Hòa tan Gl-TP tinh định mức đến 25 mL ethylacetate Lấy mL dung dịch Gl-TP chưng áp suất thấp để loại ethylacetate, thu Gl-TP rắn Cho vào ống nghiệm đựng chất rắn mL hỗn hợp dung dịch 5w% vanillin acetic acid băng mL perchloric acid Lắc (vortex) đến tan hoàn toàn chất rắn, để yên dung dịch 70°C 30 phút, sau làm lạnh bể nước đá (~3 phút) Lấy mL dịch định mức thành 10mL với acetic acid băng Hàm lượng Gl-TP xác định qua độ hấp thụ λmax =550nm (Agilent Spectrophotometer Cary 60) với oleanolic acid (Sigma Aldrich) chất chuẩn EtOH tuyệt đối làm mẫu trắng (Hình 1) 43 G l-P S (A ) G l-T P a a b b c b a b b b 0 FR M - IR D IR - D U L T -G F - IR D P h u o n g p h a p x u ly (B ) D -g lu c o s e , [ g /L ] 60 10 40 D -G lu c o s e 20 O le a n o lic a c id , [ g /L ] 15 80 G l- P S O le a n o lic a c id 0 G l- T P 20 100 0 0 G l- P S & G l-T P , [w % ] 120 D o h a p th u q u a n g (O D ) Hình Đường chuẩn D‐glucose oleanolic acid 2.2.6 Xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm GraphPad 2017 (GraphPad Software, Inc., USA) Kết định lượng biểu diễn dạng mean ±SD Sự sai khác kết thí nghiệm xác định phân tích phương sai, với mức ý nghĩa p FR & IR-D > M-ID Hiệu thu nhận Gl-PS từ mẫu ULT-G F-IRD gấp ~1,1 lần so với từ mẫu FR IR-D Hình 2B biểu diễn biến đổi lượng Gl-PS Gl-TP 2 3 5  10 K ic h th u o c b o t x a y , [m m ] Hình Phụ thuộc tổng lượng Gl-PS Gl-TP chiết vào điều kiện sơ chế nguyên liệu (tính theo w% chất khơ bột nấm) (A) Ảnh hưởng phương pháp chế biến nấm tươi; (B) Ảnh hưởng khác biệt kích thước nguyên liệu Các chữ biểu thị có hay khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p