Các hợp chất steroit và triterpenoit từ quả thể nấm linh chi đỏ (ganoderma lucidum l ) ở nghệ an luận văn thạc sỹ hóa học

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN HUY HÙNG CÁC HỢP CHẤT STEROIT VÀ TRITERPENOIT TỪ QUẢ THỂ NẤM LINH CHI ĐỎ (GANODERMA LUCIDUM L.) Ở NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN HUY HÙNG CÁC HỢP CHẤT STEROIT VÀ TRITERPENOIT TỪ QUẢ THỂ NẤM LINH CHI ĐỎ (GANODERMA LUCIDUM L.) Ở NGHỆ AN Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TRẦN ĐÌNH THẮNG NGHỆ AN - 2012 LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc thực phịng thí nghiệm chun đề Hố hữu cơ, Khoa Hố; Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Vinh; Viện Hố học - Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Trần Đình Thắng giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện suốt q trình thực luận văn Tơi chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình thầy: - PGS TS Lê Văn Hạc nghiên cứu đóng góp ý kiến giúp tơi hồn thành luận văn - PGS TS Nguyễn Khắc Nghĩa nghiên cứu đóng góp ý kiến giúp tơi hồn thành luận văn - ThS Đỗ Ngọc Đài giúp thu mẫu thực vật - TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) giúp định danh mẫu thực vật Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cơ, cán bộ mơn Hố Hữu cơ, Khoa Hoá, Khoa Đào tạo Sau đại học-Trƣờng Đại học Vinh; bạn đồng nghiệp; học viên cao học; sinh viên; gia đình ngƣời thân động viên giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Vinh, tháng 10 năm 2012 Tác giả Nguyễn Huy Hùng DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc kí cột) FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng phun mù electron) H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: singlet br s: singlet tù t: triplet d: dublet dd: dublet duplet dt: dublet triplet m: multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Đ.n.c.: Điểm nóng chảy MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới nấm 1.1.1 Đặc điểm hình thái chung 1.1.2 Sự đa dạng chất chuyển hóa nguồn gốc từ nấm 1.1.3 Tác dụng dƣợc lý số loại nấm 1.2 Chi Ganoderma 1.3 Nấm linh chi 1.3.1 Đặc điểm hình thái 10 1.3.2 Thành phần hóa học số lồi nấm linh chi 11 1.3.2.1 Các sterol 11 1.3.2.2 Lanostanoit tritecpenoit 12 1.4 Tác dụng dƣợc lý 25 1.4.1 Polysaccarit kháng u 26 1.4.2 Các chất chuyển hóa kháng sinh 27 1.4.3 Chất chuyển hóa có đặc tính chống oxy hóa 28 1.5 Nấm linh chi đỏ 29 1.5.1 Mô tả 29 1.5.2 Thành phần hoá học: 30 1.5.3 Sử dụng hoạt tính 34 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 36 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 36 2.1.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 36 2.1.2 Phƣơng pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất 36 2.1.3 Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 36 2.2 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 37 2.2.1 Hoá chất 37 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 37 2.3 Nghiên cứu hợp chất 37 2.3.1 Thu mẫu 37 2.3.2 Phân lập hợp chất 38 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Hợp chất A 40 3.2 Hợp chất B 55 3.3 Hợp chất C 67 3.4 Hợp chất D 81 KẾT LUẬN 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 94 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Từ 2000 năm qua, loại nấm thuộc chi linh chi đƣợc giới y học hàng đầu phƣơng Đông quan tâm, sản phẩm có nguồn gốc từ linh chi có khối lƣợng bán hàng cao thị trƣờng thực phẩm y tế Đài Loan, Trung Quốc Gần đây, thể bào tử nấm nhận đƣợc quan tâm giới y học, mà nguồn hứa hẹn ngành dƣợc phẩm [1] Nhiều hợp chất với hoạt động tim mạch, điều hòa miễn dịch, gây độc tế bào, giảm đau, trị đái tháo đƣờng, chất chống oxy hóa, chất diệt trùng đƣợc cô lập hai thập kỷ qua Chỉ có hai lồi G lucidum (linh chi đỏ; xích chi) G applanatum (cổ linh chi) thu đƣợc 130 loại chất chuyển hóa với khung loại lanosterol ergosterol (provitamin D2) Sự xuất chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu loại nấm tự tổng hợp phân tử lớn từ cacbon đioxit lƣợng ánh sáng mặt trời khơng có chất diệp lục, đó, sinh trƣởng nấm đƣợc định chủ yếu vào loại chất dinh dƣỡng chất nền,thêm ảnh hƣởng điều kiện khí hậu, dẫn đến thay đổi hợp chất chuyển hóa thứ cấp nấm vùng khác hay chất khác [3-4] Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa loại thực vật đa dạng sinh học điều kiện thuận lợi cho đa dạng loại nấm phát triển Ở Việt Nam có nghiên cứu đến thành phần hóa học nấm, chúng tơi chọn đề tài: “Các hợp chất steroit triterpenoit từ thể nấm linh chi đỏ (Gnaoderma lucidum L.) Nghệ An” nhằm phân lập, xác định thành phần hóa học thể nấm linh chi đỏ, góp phần phát triển thảo dƣợc Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn này, chúng tơi có nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp hợp chất từ nấm linh chi đỏ - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ nấm linh chi đỏ Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu dịch chiết từ nấm linh chi đỏ Việt Nam Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới nấm Nấm nhóm lớn sinh vật (khoảng 500.000 lồi đƣợc mơ tả, nhƣng ngƣời ta ƣớc tính có từ đến 1,5 triệu loài) đƣợc phân bố rộng rãi tự nhiên, góp phần vào phân hủy chất hữu tham gia vào chu trình sinh học, số gây bệnh cho động vật thực vật Ban đầu, loại nấm đƣợc phân loại giới thực vật Tuy nhiên, áp dụng sinh học phân tử nghiên cứu phân loại học chúng gần giống với động vật giới thực vật Nấm sinh vật có nhân điển hình thƣờng tế bào khác với tế bào thực vật, thành phần thành tế bào lục lạp thiếu chất diệp lục, nhân có thành tế bào diện ergosterol màng tế bào chất [8], phƣơng thức sinh sản Nấm vi sinh vật dị dƣỡng hóa nên lấy chất dinh dƣỡng cách hấp thụ chuyển hóa hợp chất hữu sinh vật khác tổng hợp đƣợc từ lƣợng ánh sáng mặt trời cacbon đioxit Các chất dinh dƣỡng đƣợc hịa tan enzyme tiết ra, sau hấp thu qua thành tế bào đƣợc phân phối khuyếch tán đơn giản nguyên sinh chất Cùng với vi khuẩn, nấm nguyên nhân thối rữa phân hủy chất hữu [16] Điều ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển chúng tự nhiên kết hợp với chất hữu phân hủy, tham gia vào chu trình tự nhiên cacbon chu trình tự nhiên khác Thơng thƣờng chúng sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính, thơng qua bào tử, sinh sản hàng triệu tế bào nấm, lần có khả phát triển thành quần thể nấm Các bào tử sinh sau có hợp hai hạt nhân hai sợi nấm tƣơng thích phân bào giảm nhiễm 1.1.1 Đặc điểm hình thái chung Giới nấm đƣợc xác định dựa tập hợp đặc điểm chung, nhƣng khơng thiết phải tất nhóm đặc điểm xuất nhau, là: Tổ chức đơn bào, đa bào hay lƣỡng hình, khơng thật hình thành mơ tế bào Phần lớn loại nấm bao gồm sợi nấm sợi mỏng có vách ngăn với khơng có vách ngăn Khi có điều kiện cần thiết độ ẩm sợi nấm phát triển theo nhiều hƣớng để hình thành một khối sợi nấm thể Thực vật chủ yếu lƣu trữ vật chất dạng tinh bột, nhƣng nấm chủ yếu lƣu trữ dạng glycogen tƣơng tự nhƣ giới động vật Thành tế bào chủ yếu gồm polysaccarit protein khác Các polysaccarit quan trọng chitin (polyme Nacetyl glucosamine hay 2-(axetylamin)-2-deoxy-D-glucozơ), mannan (polyme mannozơ) glucan (polyme glucozơ) Chủ yếu ƣa khí, có số yếm khí chọn lọc Dị dƣỡng dinh dƣỡng, loại enzym tiêu hóa đƣợc phân tán bề mặt chất nền, làm mùm chất biến chất mùn thành nguồn cung cấp chất dinh dƣỡng 1.1.2 Sự đa dạng chất chuyển hóa nguồn gốc từ nấm Các chất chuyển hóa thứ cấp đối tƣợng nhiều đề tài nghiên cứu nấm, liên quan nhiều đến thành phần chất hóa học sản phẩm từ tự nhiên, phân loại nhƣ sau: Chất chuyển hóa thứ cấp mà khơng có can thiệp từ axetat H2N HO HO HO O NHCH3 HN O HO HCO C CH3 O O HO NH NH OH HO NH C Estroptomicin (1) NH2 N N N N COOH H3C HO N NH2 H3C CH3 + CH3 O Muscarin (2) 84 Hình 3.62: Phổ 13C hợp chất D Hình 3.63: Phổ 13C hợp chất D 85 Hình 3.64: Phổ HSQC hợp chất D 86 Hình 3.65: Phổ HSQC hợp chất D 87 Hình 3.66: Phổ HMBC hợp chất D 88 Hình 3.67: Phổ HMBC hợp chất D 89 Hình 3.68: Phổ HMBC hợp chất D 90 Hình 3.69: Phổ HMBC hợp chất D 91 Hình 3.70: Phổ HMBC hợp chất D Bảng 3.3 Số liệu phổ hợp chất D 92  ppm C DEPT Thực nghiệm CH2 35,8 CH2 27,9 CH 79,0 C 38,7 CH 49,2 CH2 23,0 CH 120,3 C 143,0 C 146,0 10 C 37,4 11 CH 116,3 12 CH2 38,0 13 C 44,0 14 C 50,3 15 CH2 32,0 16 CH2 28,0 17 CH 51,0 18 CH3 16,0 19 CH3 23,0 20 CH 36,1 21 CH3 18,4 22 CH2 36,0 23 CH2 25,0 24 CH 146,0 25 C 146,0 26 C 127,0 Tài liệu 93 27 CH3 12,0 28 CH3 26,0 29 CH3 28,2 30 CH3 16,0 Từ số liệu phổ thực nghiệm đối chiếu với tài liệu, khẳng định hợp chất D axit ganoderic Y COOH HO KẾT LUẬN 94 Nghiên cứu thành phần hoá học dịch chiết nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum L.) thuộc họ Ganodermaceae Việt Nam thu đƣợc số kết nhƣ sau: Nấm Linh chi đỏ chiết với dung môi metanol ngày, cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao metanol thô (121g) Bằng phƣơng pháp phân bố cao metanol nƣớc chiết với dung môi chọn lọc chƣng cất chân không thu đƣợc 28 g cao etyl axetat 33g cao butanol Phân lập hợp chất từ cao etyl axetat phƣơng pháp sắc ký thu đƣợc hợp chất A (123mg), hợp chất B (31mg), hợp chất C (19mg) hợp chất D (15mg) Sử dụng phƣơng pháp phổ đại: phổ hồng ngoại IR, phổ khối lƣợng phun mù (ESI-MS), phổ khối lƣợng (EI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC HSQC để xác định cấu trúc hợp chất tách đƣợc Các kết phổ xác định: hợp chất A ergosterol; hợp chất B esgosterol peroxit; hợp chất C ganodermadiol; hợp chất D axit ganoderic -Y TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 95 Vũ Văn Chuyên, Lê Trần Chấn, Trần Hợp (1987), Địa lý họ Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thƣợng Dong ngƣời khác (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1992), Cây cỏ Việt Nam, Montreal Trần Văn Sung (2002), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hoá hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Hùng Việt (1985), Các phương pháp sắc ký, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Antonio G G., León F., Rivera A., Padrón J., javier G.J., Zuluaga J., Quintana J., Estévez F., Bermejo J., (2002), New anostanoids from the fungus Ganoderma concinna, J Nat Prod., 65, 417-421 Arnao M., Cano A., Acosta M., (1999), Methods to measure the antioxidant activity in plant material A comparative discussion, Free Rad Res., 31, 89-96 Bojana B., Marin B., Zhang JS., (2007), Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotech Ann Rev., 13, 265–301 Chen R.Y, Yu D.Q., (1990), Progress on triterpenoids of Ganoderma 10 Lucidum, Acta Pharm Sin., 25(12), 940–953 El-Mekkawy S., Meselhy M.R., Nakamura N., Tezuka Y., Hattori M., 11 Kakiuchi N., Shimotohno K., Kawahata T., Otake T., (1998), 96 Phytochem, 49, 1651-1657 Gan K.H., Fann Y.F., Hsu S.H., Kuo K.W., Lin C.N., (1998), Mediatión 12 of the cytotoxicity of lanostanoids and steroids of Ganoderma tsugae through apoptosis and cell Ctcle, J Nat Prod., 61, 485-487 Gao J.J., Min B.S., (2002), New triterpene aldehides, lucialdehides A-C, 13 from Ganoderma lucidum and their against murine and human tumor cells, Chem Pharm Bull., 50(6), 837-840 Jiang J.G., Norio N., Byung S.M., Akiko H., Feng Z., Masao H., (2004), Quantitative Determination of Bitter Principles in Specimens of 14 Ganoderma lucidum Using High-Performance Liquid Chromatography and Its Application to the Evaluation of Ganoderma Products, Chem Pharm Bull., 52(6), 688-695 Jong S.C., Birmingham J.M., (1992), Medicinal benefits of the 15 mushroom Ganoderma Adv Appl Microbiol, 37, 101-34 Jordan 16 K.Z., (2004), Biologically active compounds from Aphyllophorales (Polypore) fungi, J Nat Prod., 67, 300-310 Kino K., Yamashita A., Yamaoka K., (1989), Isolation and 17 characterization of a new immunodulatory protein, Ling Zhi-8(LZ-8), from Ganoderma lucidium, J Biol Chem., 264, 472-478 Kohoda H., Tokumoto W., Sakamoto K., Fuji M., Hirai Y., Yamasaki 18 K., Komoda Y., Nakamura H., Ishihara S., Uchida M., (1985), The biologically active constituents of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst Histamine release-inhibitory triterp- enes Chem Pharm Bull., 33, 1367-1374 Konda H., Wakako T., Akamoto K., Fujii M., Hiray Y., Yamazaki K., 19 Komoda , Nakamura H., Ishihara S., Uchida M., (1985), The biologically constituents of Ganoderma lucidum (FR) KARST, histamine release inhibitory triterpenes, Chem Pharm Bull., 33(4) 97 1367-1374 Lin C.N., Fann Y.F., Chung M., (1997), Steroids of formasan 20 Ganoderma tsugae, Phytochi., 46, 1143-1146 Lin L.J., Shiao M.S., (1987), Separation of oxytriterpenoids from 21 Ganoderma lucidum by high-performance liquid chromatography, J Chromatogr., 410, 195-200 Lin Z.B, Wang P.Y., (2006), The pharmacological study of Ganoderma 22 spores and their active compounds, J Peking Univ (Health Sciences)., 38(5), 541–547 Min B.S., Gao J.J., Hattori M., (2001), Anticomplement activity of 23 triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum, Planta Med., 67, 811–814 Min B.S, Gao J.J., Nakamura N., (1998), Triterpenes from the spores of 24 Ganoderma Lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells, Chem Pharm Bull., 48(7), 1026–1033 Min B.S., Gao J.J., (2002), Triterpenes frm the Spors of Ganoderma 25 lucidum and their cytotoxicity against Meth-A and LLC Tumor Cell, Chem Pharm Bull., 48(7), 1026-1033 Min B.Y., Gao J.J., Nakamura N., Hattor M., (2000), Triterpenes from 26 the spores of Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against Meth-A and LLC tumor cells, Chem Pharm Bull., 48, 1026-1033 27 Mothana R.A.A., Jansen R., Juelich W.D., Lindequist U., (2000), J Nat Prod., 63, 416-418 Nieto I.J., Valencia M.A., (2002), Esteroles, ácidos grasos e 28 hidrocarburos de los cuerpos fructíferos de Ganoderma Australe, Bol Soc Chil Quím., 47 Nishitoba T., Sato H., Shirasu S., Sakamura S., (1986), Evidence on the 29 strain-specific terpenoid pattern of Ganoderma lucidum, Agric Biol 98 Chem., 50, 2151-2154 Pannala A.S., Chan T.S., O’Biren J., Rice E.C., (2001), Flanonoid B30 ring chemistry and antioxidant activity: fast reaction kinetics, Biochem Biophys Res Comm., 282, 1161-1168 Peter K., Anh N., Kiet T.T., Brigitte S., Hans M.D., Albert H., Udo G., 31 (2001), Colossolactones, New triterpenoid metabolites from a Vietnamese mushroom Ganoderma colossum, J Nat Prod., 64, 236239 Smania A.J., Delle M.F., Smania E.F.A., Cuneo S.R., (1999), 32 Antibacterial activity of steroidal compounds isolated from Ganoderma applanatum (Pers.) Pat (Aphyllophoromycetideae) fruit body, Int J Med Mushrooms., 1, 325-330 Song T.Y., Yen G.C., (2002), Antioxidant properties of Antrodia 33 camphorata in submerged culture, J Agric Food Chem., 50, 33223327 Sonoda Y., Sekigawa Y., Sato Y., (1988), In vitro effects of oxygenated 34 lanosterol derivatvies on cholesterol biosynthesis from 24, 25dihydrolanosterol, Chem Pharm Bull., 36, 966-973 Toshihiro A., Masaaki T., Motohiko U., Harukuni T., Takashi S., 35 Yumiko K., (2005), Oxygenated Lanostane-Type Triterpenoids from the Fungus Ganoderma lucidum, J Nat Prod., 68, 559-563 Weete J.D., Fuller M.S., Huang M.Q., Gandhi S., (1989), Fatty acids 36 and sterols of selected hypochytriomycetes and chytridromycetes, Exp Mycol., 13, 183–195 Wu T.S., Shi L.S., Kuo S.C., (2001), Cytotoxicity of Ganoderma 37 lucidum Triterpenes, J Nat Prod., 64, 1121-1122 ... thành phần hóa học nấm, chọn đề tài: ? ?Các hợp chất steroit triterpenoit từ thể nấm linh chi đỏ (Gnaoderma lucidum L. ) Nghệ An? ?? nhằm phân l? ??p, xác định thành phần hóa học thể nấm linh chi đỏ, góp... VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN HUY HÙNG CÁC HỢP CHẤT STEROIT VÀ TRITERPENOIT TỪ QUẢ THỂ NẤM LINH CHI ĐỎ (GANODERMA LUCIDUM L. ) Ở NGHỆ AN Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 60.44.27 LUẬN VĂN... (linh chi đỏ; xích chi) G applanatum (cổ linh chi) thu đƣợc 130 loại chất chuyển hóa với khung loại lanosterol ergosterol (provitamin D 2) Sự xuất chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu loại nấm tự tổng hợp