Nghiên cứu định lượng estriol không liên hợp (uE3) bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân lập thời gian (TRFIA)

Bài viết Nghiên cứu định lượng estriol không liên hợp (uE3) bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân lập thời gian (TRFIA) bước đầu đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp TRFIA trong việc định lượng nồng độ uE3 dựa trên phản ứng cạnh tranh giữa uE3 của mẫu và uE3 đánh dấu Eu3+ với kháng thể đơn dòng uE3.

Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2021 ISBN: 978-604-82-5957-0 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ESTRIOL KHÔNG LIÊN HỢP (uE3) BẰNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG PHÂN LẬP THỜI GIAN (TRFIA) Trần Khánh Hòa Trường Đại học Thủy lợi, email: hoatk@wru.vn GIỚI THIỆU CHUNG Estriol (E3) ba dạng estrogen thể người xuất thai kỳ thai tiết Nồng độ E3 huyết thai phụ phụ thuộc vào tình trạng thai nhi, chức bánh sức khỏe thai phụ [4] Có 02 loại estriol huyết thai phụ: estriol liên hợp với sunfate glucuronides estriol không liên hợp (uE3), đặc hiệu thai tiết Trong thai kỳ (tuần thai từ 15 đến 20), nồng độ uE3 thay đổi theo thai kỳ thường giảm thai nhi mắc hội chứng Down Sự kết hợp uE3 với alpha-fetoprotein (AFP), human chorionic gonadotropin (hCG) beta human chorionic gonadotropin (beta hCG) sử dụng rộng rãi để tăng độ nhạy sàng lọc hội chứng Down cho thai phụ thai kỳ [1] Định lượng nồng độ uE3 bác sỹ định cho phụ nữ có nghi ngờ mắc ung thư vú ung thư buồng trứng [2] Có nhiều phương pháp sử dụng để định lượng uE3 huyết như: phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA), phương pháp điện hóa phát quang (CLIA), phương pháp Elisa cạnh tranh [1]… kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phân lập thời gian (Time-resolved fluoroimmunoassay TRFIA) sử dụng nguyên tố đất (Eu3+, Sm3+,…) để đánh dấu (labeling) phương pháp có nhiều ưu điểm ứng dụng rộng rãi lĩnh vực y sinh Huỳnh quang nguyên tố có khác biệt lớn đỉnh hấp thụ phát xạ (lớn 250 nm), thời gian phát quang kéo dài (vài trăm micro giây), tín hiệu thấp nên phương pháp TRFIA có độ nhạy, độ xác cao, tuyến tính phạm vi rộng [1] Nghiên cứu bước đầu đánh giá khả ứng dụng phương pháp TRFIA việc định lượng nồng độ uE3 dựa phản ứng cạnh tranh uE3 mẫu uE3 đánh dấu Eu3+ với kháng thể đơn dòng uE3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các hóa chất dùng nghiên cứu dạng tinh khiết dùng cho phân tích y sinh Hóa chất bao gồm: đĩa 96 giếng (bề mặt Polystyrene) (hãng Corner); Streptavidin 2,5 µg/mL; Dung dịch đệm phosphate buffer solution (PBS) 0,01M có pH 4,9 chứa NaN3 0,05%; Dung dịch khóa giếng bovine serum albumin (BSA) 1% (hãng Sigma Aldric); kháng thể uE3 - biotin với nồng độ khác nhau, dung dịch tăng cường (Enhance solution), kháng nguyên cạnh tranh Eu3+labeled uE3-BSA (50ng/mL), dung dịch chuẩn uE3 (hãng Perkin Elmer (A, B, C, D, E, F có nồng độ 0,00; 0,58; 1,09; 4,69; 13,20 45,20 nmol/l) [3] Thiết bị đo: máy đo huỳnh quang Victor 2D (hãng Perkin Elmer) Định lượng uE3 phương pháp (TRFIA) gồm bước bản: 1- Cố định Streptavidin giếng Mỗi giếng thêm 200 µL Streptavidin 2,5 µg/mL, ủ 4oC, rửa lần dung dịch nước muối NaCl 0,9% Khóa giếng cách thêm 300 µL dung dịch BSA 1% PBS 0,01M, ủ 2h 4oC, rửa lần dung dịch PBS 0,01M 2- Cố định kháng thể giếng polystyren thông qua liên kết Streptavidin Biotin 311 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2021 ISBN: 978-604-82-5957-0 Thêm 150 µL kháng thể uE3 - biotin vào giếng polystyrene cố định streptavidin bề mặt Ủ 45 phút nhiệt độ phịng sau rửa lần dung dịch PBS 0,01M 3- Phản ứng cạnh tranh uE3 mẫu với uE3 đánh dấu huỳnh quang Thêm chất đánh dấu mẫu chuẩn vào giếng (tỉ lệ thể tích 50:50 µL), tiếp tục ủ tiếng nhiệt độ phịng sau rửa lần dung dịch PBS 0,001M 4- Thêm 200 µL dung dịch tăng cường đo cường độ huỳnh quang thu máy Victor 2D Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ kháng thể uE3-biotin, độ lặp, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng xây dựng đường chuẩn phép phân tích Lựa chọn nồng độ kháng thể uE3-Biotin 0,75 µg/mL cho khảo sát 3.2 Khảo sát độ lặp phép phân tích Độ lặp phép phân tích khảo sát với 10 thí nghiệm tương đương giếng với nồng độ dung dịch kháng thể uE3biotin 0,75 µg/mL với chuẩn D (uE3= 4,69 nmol/L) Cường độ huỳnh quang thu được trình bày Bảng Bảng Cường độ huỳnh quang dung dịch kháng thể uE3 - Biotin 0,75 µg/mL nồng độ mẫu chuẩn D (uE3= 4,69 nmol/l) STT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng thể uE3 - Biotin Nghiên cứu khảo sát với nồng độ khác kháng thể uE3 - Biotin (0,50; 0,75; 1,00; 1,50; 2,50; 3; 4; µg/mL) với mẫu chuẩn A (uE3 = 0) Kết trình bày Hình Cường độ huỳnh quang 9888 10605 9559 9411 9539 STT 10 Cường độ huỳnh quang 10725 9650 8947 10526 9169 Độ lệch chuẩn (SD) = 620; Hệ số biến thiên (CV) = 3,2% Giá trị tương đồng với giá trị CV dao động từ 3,3% - 10,3% kit uE3 nhà sản xuất Perkin Elmer (Mỹ) [3] 3.3 Xây dựng đường chuẩn Sử dụng loại giếng cố định kháng thể điều kiện tối ưu (nồng độ kháng thể uE3-Biotin 0,75 µg/mL) để đo huỳnh quang mẫu kháng nguyên uE3 chuẩn A, B, C, D, E, F Cường độ huỳnh quang đo được trình bày Bảng đây: Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào nồng độ kháng thể uE3 - Biotin Bảng Cường độ huỳnh quang đo với mẫu chuẩn uE3 với nồng độ kháng thể uE3- biotin 0,75 µg/mL Khi nồng độ kháng thể uE3 - Biotin tăng từ 0,5 µg/mL đến 2,5 µg/mL cường độ huỳnh quang tăng đạt cực đại Sau đó, cường độ giảm mạnh tăng nồng độ lên µg/mL, chồng xếp lên kháng thể uE3-biotin Như vậy, sử dụng khoảng nồng độ kháng thể uE3 Biotin từ 0,5 µg/mL đến 2,5 µg/mL để cố định kháng thể uE3 - biotin lên bề mặt giếng polystyrene có gắn streptavidin 312 Mẫu A1 A2 A3 A4 A5 A6 Nồng độ mẫu chuẩn (nmol/L) 0,00 0,58 1,09 4,69 13,2 45,2 Cường độ huỳnh quang 32168 23866 19149 9888 5001 2449 Logarit cường độ huỳnh quang 4,507 4,378 4,282 3,995 3,699 3,406 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2021 ISBN: 978-604-82-5957-0 Đường chuẩn phân tích uE3 xây dựng sở hồi quy phi tuyến, biểu diễn phụ thuộc logarit nồng độ huỳnh quang theo nồng độ mẫu chuẩn Phương trình đường chuẩn: y = y0 + A1e  x/t1 + A 2e x/t2 + A 3e x/t3 y0 = 1,62124; A1 = 3,1916.1014; t1 = 0,10888; A2 = 3,1916.1014; t2 = 0,10888; A3 = 297741,97932; t3 = 0,37043 3.4 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Nghiên cứu đo dung dịch kháng thể uE3Biotin 0,75 µg/mL với mẫu chuẩn A Giá trị cường độ huỳnh quang 10 mẫu trắng thể Bảng Bảng Cường độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn A Giếng Cường độ huỳnh quang Giếng Cường độ huỳnh quang 34784 33049 32168 30049 36448 38275 35025 34953 32792 10 35251 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu bước đầu cố định kháng thể uE3 lên bề mặt giếng polystyren dựa liên kết Streptavidin Biotin Khảo sát xác định nồng độ kháng thể uE3-Biotin uE3 cố định 0,75 µg/mL cho tín hiệu huỳnh quang tốt Đánh giá độ lặp phép phân tích với mẫu uE3 chuẩn có nồng độ 4,69 nmol/L cho hệ số biến thiên CV = ± 3,2%, gần với giá trị CV kit uE3 thương mại hãng Perkin Elmer Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) dựa độ lệch chuẩn tín hiệu dung dịch mẫu trắng Kết thu được: LOD = 0,2729 nmol/L LOQ = 0,8269 nmol/L Giá trị gần tương đồng với giá trị LOD LOQ kit uE3 thương mại hóa hãng Perkin Elmer Trong thời gian tới, nghiên cứu khảo sát thêm ảnh hưởng steroid Các steroit nội tiết tố phụ nữ (progesterone testosterone,… Các nội tiết tố thay đổi tùy theo chu kỳ kinh nguyệt thời kỳ mang thai Về cấu trúc hóa học, steroit có cấu trúc gần tương tự nên việc khảo sát độ đặc hiệu có ý nghĩa quan trọng phân tích steroit, có uE3 TÀI LIỆU THAM KHẢO Giá trị trung bình: 34279 Độ lệch chuẩn: SD = 2332 Sử dụng phần mềm Origin, biểu diện phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào nồng độ mẫu chuẩn: y = a + b.rx Với a = 4845; b = 28202 r = 0,56505 Kết phân tích thu giá trị LOD = 0,2729 nmol/L, giá trị LOQ = 0,8269 nmol/L tương đương với giá trị LOD = 0,3 nmol/L cao giá trị LOQ = 0,4 nmol/L kit định lượng uE3 hãng Perkin Elmer Mặc dù giá trị LOQ cao so với kit xét nghiệm uE3, chênh lệch khơng nhiều nên hồn tồn ứng dụng phương pháp để định lượng nồng độ uE3 huyết thai phụ thai kỳ 2 313 Analytical Methods, A direct competitive inhibition time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of unconjugated estriol in serum of pregnant women; Yong-ping Tang, Su-qing Zhao, Ying-song Wu, Jianwei Zhouc and Ming Li, 2013, 5, 4068 Clinical Chemistry, Measurement of Unconjugated Estriol in Serum by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry and Assessment of the Accuracy of Chemiluminescent Immunoassays, Xianzhang Huang, David C Spink, Erasmus Schneider, Helen Ling, Alex J Rai, Thomas G Rosano, Baorong Chen,6 and Zhimin (Tim) Cao, 260-268 (2014) Perkin Elmer, 2012, Delfia/AutoDELFIA unconjugated estriol (uE3) kit, B095-101 Võ Văn Đức, 2010, Tài liệu hướng dẫn sàng lọc & chẩn đoán trước sinh, Trường đại học Y Dược Huế  ... Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Nghiên cứu đo dung dịch kháng thể uE3Biotin 0,75 µg/mL với mẫu chuẩn A Giá trị cường độ huỳnh quang 10 mẫu trắng thể Bảng Bảng Cường độ huỳnh. .. huỳnh quang 10 mẫu chuẩn A Giếng Cường độ huỳnh quang Giếng Cường độ huỳnh quang 34784 33049 32168 30049 36448 38275 35025 34953 32792 10 35251 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu bước đầu cố định. .. tiếp tục ủ tiếng nhiệt độ phịng sau rửa lần dung dịch PBS 0,001M 4- Thêm 200 µL dung dịch tăng cường đo cường độ huỳnh quang thu máy Victor 2D Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ kháng thể uE3-biotin,