Chiết xuất Steviosid và Rebaudiosid A từ cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) bằng phương pháp xanh

Nghiên cứu tiến hành khảo sát và tối ưu hóa quy trình tách chiết các steviol glycosid từ cỏ ngọt. Quy trình tách chiết bao gồm các bước: Chiết xuất cỏ ngọt, loại màu dịch chiết bằng phương pháp gia vôi và tinh chế các steviol glycosid bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion.

Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 15 - 2022 CHIẾT XUẤT STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA BERTONI) BẰNG PHƯƠNG PHÁP XANH Đinh Trường Sơn1, Lâm Bích Thảo1, Nguyễn Nhật Minh1, Nguyễn Văn Trí1, Lê Văn Minh1* Nguyễn Đan Thảo2 Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh (*Email: lvminh05@gmail.com) Ngày nhận: 11/3/2022 Ngày phản biện: 10/4/2022 Ngày duyệt đăng: 29/4/2022 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành khảo sát tối ưu hóa quy trình tách chiết steviol glycosid từ cỏ Quy trình tách chiết bao gồm bước: Chiết xuất cỏ ngọt, loại màu dịch chiết phương pháp gia vôi tinh chế steviol glycosid phương pháp sắc ký trao đổi ion Quy trình sử dụng “phương pháp xanh” để thu nhận chất từ cỏ mà không sử dụng dung môi hữu trình chiết tách Cỏ sau chiết nóng với nước thu cao lỏng gia vơi với tỉ lệ 1/1 (kl/kl) 5oC 10 phút để loại bỏ tạp chất màu Sau đó, dịch chiết tiếp tục triển khai qua cột sắc ký trao đổi anion cation để tinh chế hoạt chất Kết khảo sát ghi nhận điều kiện sắc ký tối ưu cột anion: tỉ lệ cao chiết/nhựa 1/4 (kl/kl), số lần chạy lần, tốc độ dòng 10 mL/phút; cột cation: tỉ lệ cao chiết/nhựa 4/1 (kl/kl), số lần chạy lần, tốc độ dòng 15 mL/phút Hiệu suất chiết tách quy trình tinh chế 2,12% 2,31% Từ khóa: Ca(OH)2, cỏ ngọt, rebaudiosid A, sắc ký trao đổi ion, steviosid Trích dẫn: Đinh Trường Sơn, Lâm Bích Thảo, Nguyễn Nhật Minh, Nguyễn Văn Trí, Lê Văn Minh Nguyễn Đan Thảo, 2022 Chiết xuất steviosid rebaudiosid A từ cỏ (Stevia rebaudiana bertoni) phương pháp xanh Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 15: 205-217 * TS Lê Văn Minh – Giám đốc Trung Tâm Sâm Dược Liệu TP Hồ Chí Minh 205 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô GIỚI THIỆU Cây cỏ (Stevia rebaudiana Bertoni) loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam Mỹ, trồng Việt Nam Lá cỏ có chứa nhiều hợp chất steviol glycosid steviosid, rebaudiosid A, rebaudiosid C, rebaudiosid B, rebaudiosid D, rebaudiosid E dulcosid A (Kinghorn Soejarto, 1991) Trong độ rebaudiosid A gấp 250 - 450 lần so với đường mía steviosid gấp 150 300 lần so với đường mía (Cramer Ikan, 1986) Các steviol glycosid loại chất tạo tự nhiên, không sinh lượng, hỗ trợ điều trị số bệnh lý đái tháo đường (Lailerd et al, 2004), rối loạn lipid huyết, tăng huyết áp (Dyrs et al, 2005) Ngồi ra, steviol glycosid cịn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm (Ghosh et al, 2008) Hai hợp chất steviosid rebaudiosid A steviol glycosid có độ cao, chiếm hàm lượng lớn cỏ đối tượng lựa chọn để làm sản phẩm chất tạo thay chất tạo hóa học Ở Việt Nam có số nghiên cứu tiến hành phân lập tinh steviol glycosid từ cỏ ngọt, nhiên hiệu suất tách chiết phương pháp thấp 0,1 - 2% quy trình tách chiết sử dụng nhiều loại dung môi hữu cơ, không an tồn cho sức khỏe người dùng, khó áp dụng quy mô lớn Trong nghiên cứu này, đánh giá “phương pháp xanh” tách chiết steviol glycosid từ cỏ Đây phương pháp tách chiết đơn giản, sử dụng dung mơi độc hại với hiệu suất tách Số 15 - 2022 chiết tương đối cao, có khả áp dụng quy mơ cơng nghiệp PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Nguyên liệu: Lá cỏ sấy khơ có độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam V (Bộ Y Tế, 2017) 13% xay thành bột mịn (qua rây 355), lưu giữ túi nilon kín bảo quản nơi khơ mát Mẫu thu hái Thanh Hóa (vào tháng 03/2021) Dung môi chất chuẩn: Ca(OH)2 (Việt Nam), aceton (Merck), isopropanol (Merck), Amberlite IRP64 (Đức), Amberlite FPA98Cl (Đức), steviosid (Sigma-Aldrich, CAS 5781789-7); rebaudiosid A (Sigma-Aldrich, CAS 58543-16-1) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Qui trình thực hiện: Chiết xuất cỏ với dung môi nước thu cao lỏng, cao lỏng loại màu sơ phương pháp gia vôi tinh chế phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion 2.2.1 Chiết xuất cao lỏng cỏ Quy trình chiết xuất cỏ tiến hành theo báo cáo Hồ Thị Mỹ Linh (2018) cách lấy 1,0 kg bột cỏ chiết hồi lưu cách thủy với nước theo tỷ lệ dược liệu/nước 1/20 (g/mL) 60 phút nhiệt độ 90 oC Lọc dịch chiết qua giấy lọc Whatman No.1 tiến hành cô bay dung môi máy cô quay chân không (Buchi R-300, Thụy Sĩ) 70 oC thu cao lỏng 206 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 2.2.2 Gia vôi Gia vôi phương pháp loại màu tạp sử dụng Ca(OH)2, điều kiện gia vôi dịch chiết cỏ theo nghiên cứu trước Abou-Arab et al (2010) Lemus-Mondaca et al (2012) với tỷ lệ cao/Ca(OH)2 = 1/1 (g/g), nhiệt độ oC 10 phút loại tủa với chất trợ lọc diatomite Dịch sau loại tủa trung hòa acid citric đến pH = 2.2.3 Tinh chế hoạt chất Dịch sau gia vôi tinh chế hoạt chất cách tiến hành sắc ký trao đổi ion (qua cột anion sau qua cột cation), thông số khảo sát để tối ưu hóa điều kiện sắc ký trao đổi ion gồm: Tỷ lệ cao/nhựa (g/g), số lần chạy cột tốc độ dòng chảy (mL/phút) Mỗi thí nghiệm khảo sát lặp lại lần lấy giá trị trung bình a) Khảo sát tỷ lệ cao/nhựa (g/g): Lấy 200 mL dịch lọc cho chảy qua cột có khối lượng nhựa với tỷ lệ khối lượng cao/nhựa 1/1; 1/2; 1/3; 1/4 (cột anion) tỷ lệ khối lượng cao/khối lượng nhựa 4/1; 2/1; 1/1; 1/2 (cột cation) với tốc độ dòng 10 mL/phút b) Khảo sát số lần chạy cột: Lấy 200 mL dịch lọc cho chảy qua cột có khối lượng nhựa với tỷ lệ khối lượng cao/ khối lượng nhựa khảo sát, cột anion có tốc độ dòng 10 mL/phút với số lần khảo sát 1; 2; 3; lần cột cation có tốc độ 12 mL/phút với số lần chạy khảo sát 1; 2; lần c) Khảo sát tốc độ dòng chảy: Lấy 200 mL dịch lọc tiến hành với điều kiện thích hợp khảo sát trên, khảo sát qua Số 15 - 2022 cột anion cation với tốc độ dòng chảy 2,5; 5; 10; 15; 20 mL/phút Quá trình gia vôi tinh chế hoạt chất kiểm tra định tính sắc ký lớp mỏng với mỏng silica gel 60 F254 (Merck) khai triển với hệ dung môi pha động n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) phát vết chất thuốc thử H2SO4 10% Đồng thời đo quang phổ vùng Vis (bước sóng 420 nm 670 nm) máy đo phổ UV-Vis (Beckman Coulter DU-730, Đức) để xác định độ màu đo độ giảm màu sắc (L*, a*, b*) máy đo màu (CHN Spec CS-520, Trung Quốc) để xác định độ khác biệt màu sắc ΔE 2.2.4 Các cơng thức tính a) Xác định độ màu: Độ màu xác định theo công thức Fuh Chiang (1990): Độ màu = 1‒ A420 sau (hoặc A670 sau ) A420 trước (hoặc A670 trước ) (A420, A670 độ hấp thu 420 nm 670 nm, trước sau chạy cột) b) Đo cường độ màu: Độ khác biệt màu sắc (ΔE) xác định theo công thức Vega-Galves (2012): E*ab  (L*-L0 )2 +(a*-a )2 +(b*-b0 )2 (L0, a0, b0: Giá trị trước loại màu; L*, a*, b*: Giá trị sau loại màu) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Steviol glycosid diterpen glycosid có khung aglycol steviol liên kết với nhiều phân tử đường, steviosid rebaudiosid A 207 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô steviol glycosid chiếm hàm lượng chủ yếu cỏ Các steviol glycosid dùng làm chất tạo tự nhiên, có tính an toàn cao, sử dụng nhiều làm phụ gia kĩ nghệ thực Số 15 - 2022 phẩm dược phẩm để tạo độ cho sản phẩm Steviol glycosid thu nhận chủ yếu từ Cỏ với phương pháp hóa lý khác 3.1 Chiết xuất cao cỏ Bảng Hiệu suất chiết cao cỏ Khối lượng nguyên liệu (kg) 1,0 Khối lượng cao (kg) 0,67 Độ ẩm Độ ẩm cao nguyên liệu (%) (%) 10,7 65,6 Hiệu suất chiết (%) 25,81 n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) Hình Sắc kí đồ diện steviosid rebaudiosid A cao lỏng cỏ 1: chuẩn steviosid, 2: chuẩn rebaudiosid A, 3: cao lỏng cỏ Sắc kí đồ cho thấy vết thử cao cỏ sau khai triển sắc ký lớp mỏng hệ dung môi n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) có diện vết chất có màu sắc giá trị Rf tương đồng với chuẩn steviosid rebaudiosid A (Hình 1) 3.2 Gia vơi Cao lỏng cỏ tiến hành cho gia vôi với Ca(OH)2 theo tỷ lệ cao/Ca(OH)2 1/1 (g/g), nhiệt độ oC 10 phút, dịch sau gia vơi có pH = 11 trung hòa acid citric đến pH = Kết kiểm tra định tính TLC, đo quang phổ để xác định độ màu đo màu để xác định độ khác biệt màu sắc (Bảng 2) 208 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô A Số 15 - 2022 B Hình 2A Dịch chiết cao cỏ trước (1) sau gia vôi (2) Hình 2B Sắc kí đồ định tính cao cỏ trước gia vơi sau gia vôi 1: chuẩn steviosid, 2: chuẩn rebaudiosid A, 3: cao trước gia vôi, 4: cao sau gia vôi Bảng Thông số dịch cỏ sau gia vôi Dịch trước gia vôi Dịch sau gia vôi Độ màu (%) Độ màu (420 nm) Độ màu (670 nm) 3,55±0,16 3,19±0,11 10,14±0,33 2,84±0,07 1,52±0,09 46,32±0,25 Kết Bảng cho thấy q trình gia vơi loại bỏ phần lớn sắc tố diệp lục hấp thu hai bước sóng 420 nm (giảm 10,14%) 670 nm (giảm 46,32%) Do đó, màu sắc dịch chiết sau gia vôi giảm đáng kể so với trước gia vơi Hình 2A Độ giảm màu báo cáo phù hợp với nghiên cứu Abou-Arab et al (2010) hiệu loại màu tạp gia vôi đo 420 nm Độ khác biệt màu sắc ΔE L* a* b* 15,68±0,36 31,94±0,13 1,30±0,12 3,11±0,04 17,81±0,47 8,45±0,33 15,49±0,21 760 nm 23,2% 41,92% Ngoài ra, sắc ký đồ định tính Hình 2B cho thấy, q trình xử lý với vôi loại số vết tạp chất phân cực mà không làm steviol glycosid Điều cho thấy tác dụng đáng kể q trình xử lý với vơi giúp loại tương đối tạp chất màu tạo thuận lợi cho giai đoạn tinh chế sắc ký trao đổi ion 209 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 15 - 2022 3.3 Tinh chế hoạt chất 3.3.1 Khảo sát trình trao đổi anion a) Tỷ lệ cao/nhựa 84,6 80 a 87,5 a (C) 670 nm 100 76,1 Độ màu (%) Độ màu (%) (B) 420 nm 60,9 60 34,7 40 17,1 20 80 58,8 65,9 b 77,8 b 69,8 30 60 1/1 1/2 1/3 1/4 c 24,9 26,9 c 27,8 c 19,9 20 40 12,9 10 20 0 Độ khác biệt màu sắc 40 E (A) 100 1/1 1/5 1/2 1/3 1/4 1/1 1/5 Tỉ lệ cao/anion (g/g) 1/2 1/3 1/4 1/5 Tỉ lệ cao/anion (g/g) Tỉ lệ cao/anion (g/g) Hình Độ màu bước sóng 420 nm (A), độ màu bước sóng 670 nm (B) độ khác biệt màu sắc ΔE (C) dịch chiết theo tỷ lệ cao/nhựa cột anion (a: p = 0,1961, b: p = 0,8040, c: p > 0,05) b) Số lần chạy cột 420 nm 94,8 a (C) 670 nm 100 84,6 88,2 80 60 40 (B) a Độ màu (%) Độ màu (%) 94,7 30,4 20 b 88,6 Số lần chạy cột 31,1 90 80 73,6 c 32,1 c 26,9 30 76,1 19,2 70 20 10 60 50 Độ khác biệt màu sắc 40 b E (A) 100 Số lần chạy cột Số lần chạy cột Hình Độ màu bước sóng 420 nm (A), độ màu bước sóng 670 nm (B) độ khác biệt màu sắc ΔE (C) dịch chiết theo số lần chạy cột anion (a: p > 0,9999, b: p = 0,9893, c: p = 0,9744) 210 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 15 - 2022 c) Tốc độ dòng chảy 420 nm a a 96,3 96,1 94,8 a 90 80 65,8 70 57,7 60 50 2,5 5,0 10 92,0 15 b 89,7 90 b 88,2 (C) 40 b 80,8 79,9 80 32,2 c 32,1 c 27,5 18,3 20 70 10 60 50 20 2,5 Tốc độ dòng (mL/phút) Độ khác biệt màu sắc 32,6 c 30 E Độ màu (%) 100 670 nm (B) 100 Độ màu (%) (A) 110 5,0 10 15 2,5 20 5,0 10 15 20 Tốc độ dịng (mL/phút) Tốc độ dịng (mL/phút) Hình Độ màu bước sóng 420 nm (A), độ màu bước sóng 670 nm (B) độ khác biệt màu sắc ΔE (C) dịch chiết theo tốc độ dòng cột anion (a: p > 0,05, b: p > 0,05, c: p > 0,05) d) Định tính dịch qua cột anion sắc ký lớp mỏng n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) Vết 1, 2: steviosid rebaudiosid A Vết 3: dịch trước cột Vết 4, 5, 6, 8: tỉ lệ 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 Vết 1, 2: steviosid rebaudiosid A Vết 3: dịch trước cột Vết 4, 5, 6, 7: tỉ lệ lần chạy cột 1,2,3,4 Vết 1, 2: steviosid rebaudiosid A Vết 3: dịch trước cột Vết 4, 5, 6, 7, 8: tỉ lệ tốc độ dòng chảy 2,5; 5; 10; 15; 20 Hình Sắc kí đồ định tính dịch chiết khảo sát tỷ lệ cao/nhựa (A), số lần chạy cột (B) tốc độ dòng chảy (C) cột anion Kết khảo sát tỷ lệ cao/nhựa cho thấy độ giảm màu tăng dần từ tỷ lệ 1/1 đến 1/5, tỷ lệ 1/4 1/5 độ giảm sắc khơng có khác biệt (p = 0,1961) Vì vậy, để tiết kiệm nhựa lựa chọn tỷ lệ cao/nhựa 1/4 Khi tăng số lần chạy cột từ đến lần thấy màu sắc dịch chiết nhạt dần, nhiên kết sau chạy cột lần có độ giảm màu khơng có khác biệt (p = 0,8040) Do để tiết kiệm thời gian số lần chạy lựa chọn cho cột anion lần Mặt khác, thí nghiệm khảo sát tốc độ dòng theo mức tăng dần từ 2,5 đến 20 mL/phút thấy tốc độ cao khả loại màu cột anion kém, độ giảm màu dịch chiết giảm tốc độ dòng tăng từ 2,5 đến 20 mL/phút Tuy nhiên, kết 211 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô đánh giá thống kê cho thấy tốc độ 2,5; 5; 10 mL/phút độ giảm màu không khác biệt (p > 0,05) hiệu so với hai tốc độ còn lại (p < 0,001) Để tiết kiệm thời gian tốc độ dòng lựa chọn 10 mL/phút Quan sát sắc ký đồ định tính cho thấy mẫu dịch cỏ sau qua cột anion có diện hai chất steviosid rebaudiosid A (Hình 6) dòng chảy 10 mL/phút Kết thúc trình chạy cột với điều kiện trên, dịch chiết thu có độ màu 94,8% (420 nm) 88,2% (670 nm); độ khác biệt màu sắc ΔE 31,08 Dựa vào kết cho thấy trình trao đổi anion loại bỏ lượng lớn chất màu tạp khỏi dịch chiết mà đảm bảo độ bền chất ngọt, đem lại hiệu tiềm việc tinh chế chất quy mơ cơng nghiệp Sau q trình khảo sát yếu tố, điều kiện phù hợp lựa chọn để chạy cột anion tỷ lệ cao/nhựa 1/4 (g/g); số lần chạy cột lần với tốc độ 99.0 99,5 a 99,3 a a a 98,5 98.5 98.0 40 99,4 99.5 98,9 99.0 b 99,4 b 99,4 b 2/1 1/1 35 33,3 c 33,7 c c 33,6 33,6 1/1 1/2 c b 30 25 98.5 20 98.0 4/1 Độ khác biệt màu sắc (C) 670 nm 100.0 Độ màu (%) Độ màu (%) 99,3 a) Khảo sát tỷ lệ cao/nhựa cation (B) 420 nm 99.5 3.3.2 Khảo sát trình trao đổi cation E (A) 100.0 Số 15 - 2022 1/2 4/1 2/1 Tỉ lệ cao/cation (g/g) 1/1 4/1 1/2 2/1 Tỉ lệ cao/cation (g/g) Tỉ lệ cao/cation (g/g) Hình Độ màu bước sóng 420 nm (A), độ màu bước sóng 670 nm (B) độ khác biệt màu sắc ΔE (C) dịch chiết theo tỷ lệ cao/nhựa cột cation (a: p > 0,05, b: p > 0,05, c: p > 0,05) b) Số lần chạy cột (B) 420 nm (A) 99,20 99.0 98.5 40 98,47 a a 98,31 98.0 Số lần chạy cột a 99.5 99.0 98,89 b 99,11 b 99,14 35 b E 99.5 Độ khác biệt màu sắc (C) 670 nm 100.0 Độ màu (%) Độ màu (%) 100.0 33,3 c 33,4 c 33,7 c 30 25 98.5 20 98.0 Số lần chạy cột Số lần chạy cột Hình Độ màu bước sóng 420 nm (A), độ màu bước sóng 670 nm (B) độ khác biệt màu sắc ΔE (C) dịch chiết theo số lần chạy cột cation (a: p > 0,05, b: p > 0,05, c: p > 0,05) 212 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 15 - 2022 c) Khảo sát tốc độ dòng 102 98,5 a 100 97,3 98 96 94,5 b b 99,4 99,2 Độ khác biệt màu sắc (C) b 99,3 98,9 40 b 35 33,8 c c c 33,0 33,3 33,2 c 30,3 E a Độ màu (%) Độ màu (%) 99,0 a 99,3 670 (B) 420 nm (A) 100 95 89,9 30 25 90 20 94 2,5 5,0 10 15 2,5 20 5,0 10 15 2,5 20 Tốc độ dòng (mL/phút) 5,0 10 15 20 Tốc độ dòng (mL/phút) Tốc độ dòng (mL/phút) Hình Độ màu bước sóng 420 nm (A), độ màu bước sóng 670 nm (B) độ khác biệt màu sắc ΔE (C) dịch chiết theo tốc độ dòng chảy cột cation (a: p > 0,05, b: p > 0,05, c: p > 0,05) d) Định tính dịch qua cột cation sắc ký lớp mỏng n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) 1, 2: steviosid rebaudiosid A 3, 4, 5, 6: tỉ lệ cao/cation 4/1, 2/1, 1/1, 1/2 1, 2: steviosid rebaudiosid A 3, 4, 5: tỉ lệ lần chạy cột 1, 2, 1, 2: steviosid rebaudiosid A 3: dịch trước cột 4, 5, 6, 7, 8: tỉ lệ tốc độ dòng chảy 2,5; 5; 10; 15; 20 mL/phút Hình 10 Sắc kí đồ định tính dịch chiết khảo sát tỷ lệ cao/nhựa (A), số lần chạy cột (B) tốc độ dòng chảy (C) cột cation Kết khảo sát khối lượng cao/nhựa cation tỉ lệ 4/1, 2/1, 1/1 1/2 cho thấy khơng có khác biệt độ giảm màu độ thay đổi màu sắc (p > 0,05) Khi tăng số lần chạy cột từ đến lần, độ giảm màu thay đổi màu sắc tương đương (p > 0,05) Mặt khác, kết khảo sát tốc độ dòng chảy, tốc độ 2,5; 5; 10; 15 mL/phút cho kết độ giảm màu tương đương (p > 0,05) tốt so với tốc độ 20 mL/phút (p < 0,001) Sau trình khảo sát yếu tố, điều kiện phù hợp lựa chọn để tinh chế cao tỷ lệ cao/nhựa cation 4/1 (g/g); số lần chạy cột lần tốc độ dòng chảy 15 mL/phút Kết thúc trình chạy cột với điều kiện trên, độ màu dịch đạt đến 97,3% (420 nm) 99,3% (670 nm); độ khác biệt màu sắc ΔE đạt 33,21 Quá trình sắc ký với nhựa cation sử dụng để loại lượng màu tạp còn sót lại dịch cỏ mà cột 213 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô anion chưa loại Do lượng tạp chất chủ yếu loại giai đoạn gia vôi sắc ký với nhựa anion nên trình trao đổi cation sử dụng lượng nhựa số lần chạy cột đáng kể so với cột trao đổi anion Định tính sắc ký lớp mỏng mẫu dịch cỏ sau trao đổi cation có diện chất steviosid rebaudiosid A (Hình 10) 3.3.3 Tinh rebaudiosid A Số 15 - 2022 chế steviosid Cao lỏng cỏ sau xử lý gia vôi tinh chế với sắc ký trao đổi ion cô bay dung môi thu nhận cao tinh chế Hòa tan cao aceton, phần không tan rửa nhiều lần với ethanol tinh khiết 80% thu rebaudiosid A, dịch hòa tan cho bay aceton rửa nhiều lần iso-propanol tinh khiết thu steviosid n-butanol - acid acetic - nước (4 : : 5) Hình 11 Sắc kí lớp mỏng sản phẩm tinh chế đối chiếu với chất chuẩn 1: chuẩn steviosid, 2: chuẩn rebaudiosid A, 3: steviosid tinh chế, 4: rebaudiosid A tinh chế Kết kiểm tra sắc kí lớp mỏng cho thấy sản phẩm tinh chế có Rf màu sắc tương đồng với hai chất chuẩn steviosid rebaudiosid A đối chiếu chứng tỏ hai sản phẩm tinh chế thu steviosid rebaudiosid A Bảng Khối lượng hiệu suất tinh chế steviol glycosid Khối lượng (g) Độ ẩm (%) Hiệu suất (%) Nguyên liệu 1000 10,7 Cao lỏng thô 670 65,60 25,81 214 Cao tinh chế 280 2,25 30,65 18,90 Rebaudiosid A 20,65 2,12 2,31 Steviosid Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Hiệu suất thu nhận steviosid rebaudiosid A từ cỏ 2,12% 2,31% tính khối lượng nguyên liệu khô Kết phù hợp với nghiên cứu Gupta et al (2013) đánh giá hàm lượng steviosid - 10% rebaudiosid A - 5% Trước đây, nhiều báo cáo tách chiết steviol glycosid sử dụng phương pháp chiết phân đoạn cổ điển với n-butanol, sau tiến hành kết tinh lại ethanol methanol cho hiệu suất thu nhận steviosid rebaudiosid A cao (từ - 8%) (Kovylyaeva et al, 2007) Tuy nhiên, phương pháp sử dụng nhiều dung môi độc hại sản phẩm steviol glycosid thu nhận sử dụng thực phẩm dược phẩm Ngoài ra, phương pháp chiết với n-butanol sử dụng lượng dung mơi lớn chi phí cao, khó thu hồi, tái sử dụng nhựa trao đổi ion Do đó, việc sử dụng nhựa trao đổi ion phương pháp tối ưu, tiết kiệm chi phí, có tiềm nâng cấp quy mô lớn việc tách chiết steviol glycosid từ cỏ KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, steviol glycosid tách chiết phương pháp xanh, sử dụng dung môi thân thiện với môi trường nhằm tách chiết steviol glycosid với tính an tồn cao phát triển quy mơ cơng nghiệp Trước tiên, Cỏ chiết hồi lưu cách thủy với nước thu cao lỏng chứa chất tạo (hiệu suất chiết 25,81%) Tiếp theo steviol glycosid tinh chế qua giai đoạn (1) gia vôi, (2) sắc ký trao đổi anion (3) sắc ký trao đổi cation Các trình khảo sát xử lý thống kê để chọn thông Số 15 - 2022 số tối ưu Hiệu suất tinh chế hai hoạt chất steviosid rebaudiosid A dung môi xanh 2,12 % 2,31 % Steviosid rebaudiosid A chiết xuất từ cỏ tinh chế theo quy trình, sử dụng dung mơi xanh cho hiệu suất cao, ứng dụng quy mô công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Abou-Arab, A Esmat, A Azza, Abu-Salem, M Ferial, 2010 Physicochemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant African Journal of Food Science, vol.4(5): 269281 Bộ Y tế, 2017 Dược điển Việt Nam Hà Nội Nhà xuất Y học vol.5: 1116-1117 Cramer B, Ikan R., 1986 Sweet glycosides from the Stevia plant Chemistry in Britain, vol.22: 915-916 Dyrskog S.E., Jeppensen P.B., Colombo M., Abudula R., Hermansen K., 2005 Preventive effects of soy based diet supplemented with stevioside on development of type diabetes Metabolism, vol.54: 1181-1188 Fuh, W.S., Chiang, B.H., 1990 Purification of Steviosides by Membrane and Ion Exchange Processes Journal of Food Science, vol.55(5): 1454–1457 Ghosh S., Subhudhi E., Nayak S., 2008 Antimicrobial assay of Stevia rebaudiana Bertoni leaf extracts against 10 pathogen International Journal of Integrative Biology, vol.2(1): 27-31 215 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Hồ Thị Mỹ Linh, 2018 Nghiên cứu quy trình chiết hợp chất steviol glycoside từ Cỏ (Stevia rebaudiana B.) Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa TPHCM comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects Food Chemistry, vol.132(3): 1121-1132 Kinghorn A.D, Soejarto D.D., Nabors L.B., Gelardi R.C., 2012 Alternative Sweeteners New York: Marcel Dekker, 157-171 Lailerd N., Saengsirisuwan V., Sloniger J.A., Toskulkao C, Henriksen E.J., 2004 Effects of stevioside on glucose transport activity in insulinsensitive and insulin-resistant rat skeletal muscle Metabolism, vol.53, 101-107 10 Gasmalla M A A., Yang R., Musa A., Hua X., Zhang W., 2014 Physico-chemical Assessment and Rebauidioside A Productively of Natural Sweeteners (Stevia rebaudiana Bertoni) Journal of Food and Nutrition Research, vol.2(5): 209-214 11 Lemus-Mondaca R., VegaGálvez A., Zura-Bravo L., Ah-Hen K., 2012 Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A Số 15 - 2022 12 Vega-Gálvez A., Ah-Hen K., Chacana M., Vergara J., MartínezMonzó J., García-Segovia P., LemusMondaca R., Di Scala K., 2012 Effect of temperature and air velocity on drying kinetics, antioxidant capacity, total phenolic content, colour, texture and microstructure of apple (var Granny Smith) slices Food Chemistry, vol.132, 51-59 13 Gupta E., Purwar S., Sundaram S., Rai G K., 2013 Nutritional and therapeutic values of Stevia rebaudiana: A review Journal of Medicinal Plants Research, vol.7(46), 3343-3353 14 Kovylyaeva G I., Bakaleinik G A., Strobykina I Y., Gubskaya V I., Sharipova R R., Al’Fonsov V A., Tolstikov A G., 2007 Glycosides from Stevia rebaudiana Chemistry of Natural Compounds, vol.43(1), 81-85 216 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 15 - 2022 ISOLATED AND PURYFIED STEVIOSIDE AND REBAUDIOSIDE A FROM STEVIA (STEVIA REBAUDIANA BERTONI) BY GREEN METHOD Dinh Truong Son1, Lam Bich Thao1, Nguyen Nhat Minh1, Nguyen Van Tri1, Le Van Minh1* and Nguyen Dan Thao2 Ho Chi Minh City Research Center of Ginseng and Medicinal Materials University of Technology - Viet Nam National University HCMC (*Email: lvminh05@gmail.com) ABSTRACT This study was carried out to investigate and optimize the process of purifying steviol glycosides from stevia The extraction procedure consisted of three steps: Extracting stevia with water, color removal by liming, and purifying steviol glycosides by ion exchange chromatography The study used a “green method” to obtain sweeteners from stevia without using organic solvents The crude stevia extraction procedure was adding lime to remove impurities and color The resulting de-pigmentation fluid was further purified by ion exchange processes The results showed that the optimal anion exchange condition was the stevia extract/anion ratio of 1/4 (w/w); the number of column runs were times; and the flow rate was at 10 mL/min For the cation exchange process, the effective removal condition was the stevia extract/cation ratio of 4/1(w/w); the number of column runs was time; and the flow rate was at 15 mL/min The yields of two purification processes were 2.12% and 2.31%, respectively Keywords: Ion exchange chromatography, Ca(OH)2, rebaudioside A, stevioside, Stevia 217 ... LIỆU THAM KHẢO Abou-Arab, A Esmat, A Azza, Abu-Salem, M Ferial, 2010 Physicochemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant African Journal of... Zura-Bravo L., Ah-Hen K., 2012 Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A Số 15 - 2022 12 Vega-Gálvez A. , Ah-Hen K., Chacana M., Vergara J., MartínezMonzó J., Garc? ?a- Segovia... Physico-chemical Assessment and Rebauidioside A Productively of Natural Sweeteners (Stevia rebaudiana Bertoni) Journal of Food and Nutrition Research, vol.2(5): 209-214 11 Lemus-Mondaca R., VegaGálvez A. ,