ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nông nghiệp

Tạo dòng tế bào có DNA tái tổ hợp - Sau khi chọn lọc được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng ta tiến hành nuôi cấy tế bào bằng môi trường thích hợp - DNA tái tổ hợp có thể được nuôi

Trường DH Nông Lâm Tp.HCMKhoa Ngoại ngữ- Sư phạm

Lớp DH10SP

Báo cáo chuyên đề môn:

Di truyền ứng dụng trong thủy sản

Chủ đề:

Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong nông nghiệp

Thực hiện:

Nguyễn Minh Dung_10132031

Võ Thị Thùy Như Nguyễn_10132042Phạm Ngọc Vinh_10132019

- Kĩ thuật tổ hợp DNA còn gọi là kĩ thuật chuyển gen gồm 7 bước.

Các bước của kĩ thuật chuyển gen

1 Ly trích DNA (Thu nhận gen)

2 Cắt DNA (Chọn vector)

3 Trộn DNA và nối (Tạo DNA tái tổ hợp)

4 Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào đích

5 Chọn dòng tế bào có DNA tái tổ hợp

6 Tạo dòng tế bào có DNA tái tổ hợp

7 Biểu hiện gen

Sơ đồ kĩ thuật chuyển gen

Vi khuẩn tái

tổ hợp

Biểu hiện gen

Các nghiên cứu ứng dụng khác

Vi khuẩn

tái tổ hợp

Các nghiên cứu ứng dụng khác

Các enzym giới hạn

Vi khuẩn tự bảo vệ chống lại sự xâm nhiểm của virus bằng cách tạo ra các enzym giới hạn (RE: restriction enzymes)

Tên gọi, hoạt động RE Gọi theo tên loài vi khuẩn mà enzym được ly trích.

Chữ I viết hoa (tên chi), chữ II, III viết thường (chữ cái đầu tên loài), chữ IV viết hoa (tên chủng), nếu cùng loài vi khuẩn có nhiều RE thì thêm số La

- Mỗi trình tự có từ 4 – 6 cặp base

- Trình tự có tính đối xứng nghịch đảo (hai

mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi đọc theo cùng một chiều 5’→3’

Đầu tà (blunt end) Đầu dính (stickey end)

Kĩ thuật chuyển gen

1 Thu nhận gen: 3 phương pháp

- Thu nhận từ bộ gen (genom): dùng các enzym cắt RE cắt genom thành những gen nhỏ rời rạc và trích gen mong muốn ra khỏi genom

- Từ con dường tổng hợp hóa học

+ Xác định trình tự gen

+ Tổng hợp các đoạn oligonucleotide (3 – 16 nucleotide) + Nối các đoạn oligonucleotide bằng enzym ligase

- Thu nhận gen từ mRNA với enzym phiên mã ngược

2 Chọn vector chuyển gen

- Vector là phân tử DNA có khả năng tự nhân đôi, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gen cần thiết

- Vector cần có các đặc điểm:

+ có trình tự khời đầu sự nhân đôi Ori

+ có trình tự nhận biết (nơi cắt của RE)

+ có trình tự điều hòa ( có promotor giúp phiên mã gen lạ) + có gen đánh dấu đảm bảo nhận biết sự tồn tại của DNA tái tổ hợp trong tế bào

a Plasmid

- Là những đoạn DNA ngắn (2 – 5kp), dạng vòng nằm ngoài NST tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn

- Đặt điểm:

+ có khả năng tự nhân đôi

+ có điểm khởi đầu Ori

+ có mang các gen kháng kháng sinh hay gen dùng đánh dấu

+ chuyên chở đoạn gen có kích thước 5 – 10kp

- Là những vector nhân tạo được nối giữa plasmid và trình

tự cos của phageλ

Vector là NST nhân tạo

của nấm men

Kĩ thuật chuyển gen

3 Tạo DNA tái tổ hợp

- Từ gen và vector phù hợp người ta tạo các DNA tái tổ hợp bằng các enzym công cụ

- VD: sử dụng enzym cắt hạn chế để cắt gen và plasmid tạo hai đầu dính tương ứng, sau đó dùng DNA ligase nối gen và plasmid tạo DNA tái tổ hợp

4 Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào đích

- Biến nạp - Bắn gen.

- Dung hợp - Vi tiêm.

- Sử dụng vi khuẩn Agrobacterrium.

5 Chọn dòng tế bào có DNA tái tổ hợp

- Chọn dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng ta tiến hành nuôi cấy tế bào trong môi trường thích hợp, nhờ vào gen đánh dấu có thể tìm được tế bào có DNA tái tổ hợp

- Nhân dòng tế bào tái tổ hợp trong tế bào đích: các Dna tái tồ hợp trong tế bào vi khuẩn được phân chia ngẫu nhiên trong tế bào vi khuẩn ở thế hệ tiếp theo Vì vậy cần nhân dòng các bản sao DNA tái tổ hợp (shock nhiệt

ở 420C trong 2 phút)

6 Tạo dòng tế bào có DNA tái tổ hợp

- Sau khi chọn lọc được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng ta tiến hành nuôi cấy tế bào bằng môi trường thích hợp

- DNA tái tổ hợp có thể được nuôi cấy bằng phương pháp vsv, hay phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật, tế bào động vật,… Đối với thực vật phải tạo được cây chuyển gen như bắp chuyển gen, đậu nành chuyển gen

7 Biểu hiện gen

- Sau khi tạo được dòng tế bào có DNA tái tổ hợp, chúng

ta phải biểu hiện được gen mong muốn

- VD: Chuyển gen Insulin của người vào tế bào E.coli thì E.coli phải sản xuất được Insulin của người; chuyển gen kháng thuốc trừ sâu vào thực vật thì cây con phải có tính kháng thuốc trừ sâu

+ máy luân nhiệt

PCR được thực hiện từ 20 – 40 chu kì, mỗi

chu kì gồm 3 bước:

- Biến tính

- Gắn mồi

- Tổng hợp

Một số hình ảnh của cây chuyển gen

Bắp cải chuyển gene chống virus

Cây chuyển gene

II Ứng dụng kĩ thuật di truyền

trong nông nghiệp

Thế nào là một cây chuyển gen?

- Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều Cây chuyển gen

gen được đưa vào nhân tạo thay vì thông qua lai tạo

- Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được gen chuyển

phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc

từ những loài khác biệt hoàn toàn

- Thực vật tạo ra được gọi là “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại

hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hoá, chọn lọc thuần hoá, chọn lọc

và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài

Tại sao phải tạo cây chuyển gen?

- Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống

tìm cách tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực tổ hợp lại các gen

vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng

mong muốn Phương pháp này được thực hiện

bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy chuyển hạt phấn

hoa của cây khác

- Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó

chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thể cùng loài

hoặc có họ hàng gần Phải mất nhiều thời gian họ hàng gần

mới thu được những kết quả mong muốn và

thường là những đặc tính quan tâm lại không

tồn tạ

tồn tại trong những loài có họ hàng gần

- Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống

cùng lúc đưa vào một thực vật những gen mong

muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không sinh vật sống khác nhau

chỉ giữa các loài cây lương thực hay những loài có

họ gần

- Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà

tạo giống thực vật đưa ra giống mới nhanh hơn

và vượt qua những giới hạn của tạo giống truyền

thống

Tại sao phải tạo cây chuyển gen?

Cây chuyển gen được tạo ra như thế nào?

- Cây chuyển gen được tạo ra thông qua kỹ thuật di truyền

truyền Các gen quan tâm được chuyển từ cá thể này

sang cá thể khác Hiện có hai phương pháp chính để chuyển một gen vào bộ gen thực vật

+ Phương pháp thứ nhất: cần dùng một dụng cụ có tên là “súng bắn gen” Gen chuyển được bao bọc ra súng bắn gen

ngoài những hạt kim loại vô cùng nhỏ, những hạt này sau đó được đưa vào tế bào thực vật theo phương pháp

lí học Một vài gen có thể bị thải loại và không gắn vào

bộ gen của cây được biến nạp

+ Phương pháp thứ hai: là sử dụng vi khuẩn để đưa vi khuẩn

gen mong muốn vào bộ gen của thực vật

Cây chuyển gen được tạo ra như thế nào? Cây chuyển gen được trồng ở đâu?

- Hầu hết những nghiên cứu về cây chuyển gen đều được tiến hành ở các nước phát triển, chủ yếu là

Bắc Mỹ

Bắc Mỹ và Tây âu Tuy nhiên gần đây nhiều nước Tây âu

đang phát triển cũng đang bắt đầu những nghiên cứu

chuyển gen vào nông nghiệp (như Aventis, Dow

AgroSciences, DuPont/Pioneer, Monsanto và Syngenta)

Cây chuyển gen được trồng ở đâu?

- Năm 1994, giống cà chua Calgene chuyển gen Calgene

chín trở thành cây chuyển gen đầu tiên được sản xuất và tiêu thụ ở các nước công nghiệp Từ đó tới các nước công nghiệp

nay đã có thêm một số quốc gia trồng cây chuyển gen làm tăng hơn 20 lần diện tích cây chuyển gen trên toàn thế giới tăng hơn 47 lần

- Diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha (1996) lên 90 triệu ha (2005), có 14 nước được coi là 14 nước

có diện tích trồng cây chuyển gen thuộc loại lớn

(mega-countries

(mega-countries) với diện tích trồng từ 50.000 ha trở

lên, trong đó có 10 nước đang phát triển và 10 nước đang phát triển 4 nước

công nghiệp

công nghiệp các nước có diện tích trồng lớn (xếp

theo thứ tự từ lớn tới bé): Hoa Kỳ, Achentina, Brazil, Canada, Trung Quốc, Paraguay, Ấn độ, Nam Phi, Urugoay, Ôxtralia, Mexico, Rumani, Philippine và Tây Ban Nha (Theo James, 2005)

Những lợi ích tiềm tàng

của cây chuyển gen

- Ứng dụng cây chuyển gen trong nông nghiệp đã có những lợi ích rõ rệt:

+ Tăng sản lượng sản lượng

+ Giảm chi phí sản xuất chi phí

+ Tăng lợi nhuận nông nghiệp lợi nhuận

+ Cải thiện môi trường

- Những cây chuyển gen thế hệ thứ nhất làm thế hệ thứ nhất giảm chi

phí

phí sản xuất Ngày nay, các nhà khoa học đang hướng dẫn

tạo ra những cây chuyển gen thế hệ thứ hai có đặc điểm thế hệ thứ hai

tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích dinh dưỡng

hợp cho công nghiệp chế biến Lợi ích của những cây công nghiệp chế biến

trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng

- Bao giờ cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới Bao gồm:

+ Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm dị ứng giảm dinh dưỡng vào thực phẩm giảm dinh dưỡng

+ Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây phát tán những gen biến nạp

trồng sang họ hàng hoang dại

+ Sâu bệnh có nguy cơ Sâu bệnh tăng cường tính kháng với các chất độc

các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen

+ Nguy cơ cây có gen kháng sâu bệnh tiết chất độc tác động tới sinh vật không phải sinh vật cần diệt vật không phải sinh vật cần diệt

Những nguy cơ tiềm ẩn

của cây chuyển gen Kết luận về cây chuyển gene

- Người ủng hộ cho rằng cây chuyển gene sẽ cho sản phẩm với các chức năng, hương vị, màu sắc, hình dạng mới

dạng mới; người phản đối thì cho rằng cây chuyển

gene làm mất đi yếu tố tự nhiên vốn có trong sản

phẩm

phẩm và họ có quyền được biết thực phẩm của họ có

nguồn gốc thế nào, chứa những chất gì

- Bên cạnh những điểm còn chưa rõ ràng về cây chuyển gene nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này có vai

trò không thể phủ nhận

trò không thể phủ nhận được Tuy vậy vẫn còn một

số vấn đề đáng lo ngại

số vấn đề đáng lo ngại Để giải quyết những vấn đề

này thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy, có cơ sở khoa học

- Cuối cùng vì tầm quan trọng của lương thực thực phẩm cho con người, nên các chính sách liên quan tới cây chuyển gene sẽ phải dựa trên những cuộc tranh luận cởi mở và trung thực có sự tham gia của mọi

thành phần trong xã hội

thành phần trong xã hội

Kết luận về cây chuyển gene Một số ví dụ cụ thể

Cà chua chuyển gen bảo quản được lâu hơn

Một số ví dụ cụ thể

Cà chua chuyển gen bảo quản được lâu hơn

- Các nhà nghiên cứu đã kéo dài “cuộc sống” của cà chua thêm 60 ngày bằng cách ức chế các loại men gây ra thêm 60 ngày

quá trình chín của quả.

- Các nhà khoa học đã xác định được hai loại men, phát hai loại men

triển trong cà chua trong giai đọan quả đã trưởng thành để

xúc tiến sự chín của quả Tuy nhiên các men này cũng làm thịt quả mềm ra và đó chính là lý do không giữ được lâu, gây tổn thất lớn, thường lên tới 40% sau khi thu hoạch

- Họ đã dùng kỹ thuật gen để bắt các gen này “ngủ

yên”, khiến cho thịt quả vẫn rắn, độ cứng tăng lên được

gấp đôi, nhờ vậy kéo dài được một thời gian mới bị thối

nhũn Công trình này do Viện nghiên cứu hệ gen của Ấn

Độ thực hiện và công bố trên Proceedings of the

National Academy of Sciences

National Academy of Sciences (Thông báo của Viện

hàn lâm khoa học quốc tế)

- Cây cà chua chuyển gen vẫn mọc bình thường và

cung cấp rau quả tươi có giá trị dinh dưỡng cao, không

có gì khác biệt đối với cà chua thường Công nghệ xử lý

men chín đối với cây cà chua hoàn toàn có thể áp dụng

với các loại rau quả khác

với các loại rau quả khác.

Theo LiveSciences

Các mức độ chín của cà chua

- Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM vừa nghiệm thu đề tài “Nghiên cứu chuyển gen IPT tạo cytokinin vào cây bắp cải cấy mô và khả năng tái sinh cây chuyển gen

năng tái sinh cây chuyển gen” do ThS Bùi Đình

Thạch (Viện Sinh học nhiệt đới) thực hiện nhằm chuyển gen IPT tạo cytokinin vào cây bắp cải cấy

mô bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen (10/06/2008)

Bắp cải cấy mô

và khả năng tái sinh cây chuyển gen

- Trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro,

cytokinin có vai trò

cytokinin có vai trò rõ rệt trong việc giữ cho mô

lá tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố Thực tiễn sản xuất giống cây trồng nói chung, cây rau ăn lá cho thấy việc xử lý cytokinin ngoại sinh mang ý nghĩa thương mại rất cao vì cytokinin giúp duy trì xanh tươi lâu hơn

trì xanh tươi lâu hơn của rau sau thu hoạch và

kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành

- Nghiên cứu đã tiến hành:

+ Khảo sát tính chống chịu của tử diệp bắp cải nuôi Khảo sát

cấy in vitro 7 ngày tuổi đối với hygromycin(5-40mg/l), chất được dùng làm tác nhân chọn lọc cho cây chuyển gen

+ Chuyển gen IPT tạo cytokinin vào cây bắp cải cấy Chuyển gen IPT

mô bằng phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens và kiểm tra cây chuyển gen nhờ phương pháp chọn lọc với hygromycin, nhuộm Gus, PCR

+ Tái sinh cây chuyển gen (thiết kế tổ hợp các chất Tái sinh cây chuyển gen

kích thích sinh trưởng thực vật cho quá trình tạo chồi, tạo rễ và phát triển thành cây trưởng thành)

Bắp cải cấy mô

và khả năng tái sinh cây chuyển gen

- Cây bắp cải chuyển gen IPT có hàm lượng

cytokinin cao hơn

cytokinin cao hơn so với cây đối chứng Môi trường

thích hợp nhất cho tái sinh đối với cây bắp cải chuyển gen IPT là môi trường MSS3 (MSS3 có khoáng đa lượng và vi lượng MS, 2 lần vitamin B5, Ag(NO)3 4mg/l, đường 30 g/l, BA 3 mg/l và AIB 0.3mg/l)

Theo đó nghiên cứu sẽ:

- Khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa của cây chuyên chỉ tiêu sinh hóa

gen như hoạt tính của enzym bisphosphate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, nitrate reductase để có kết luận chính xác

- Tìm hiểu nhiều hơn về vai trò của gen IPT trong vai trò của gen IPT

cây chuyển gen

- Nghiên cứu mối liên hệ giữa tác động của gen IPT trên cây bắp cải chuyển gen với ethylene nội sinh và ethylene

ngoại sinh trong quá trình lão suy…

Bắp cải chuyển gene IPT

Bắp cải cấy mô

và khả năng tái sinh cây chuyển gen Lợi ích của cây thuốc lá chuyển gen

- Một nhóm nghiên cứu lớn thuộc một vài tổ chức nghiên cứu Châu âu đã tham gia vào một phần của dự

án Pharma-Planta

án Pharma-Planta Dẫn đầu nhóm nghiên cứu là giáo

sư Mario Pezzotti của đại học Verona, nhóm bắt đầu tạo cây thuốc lá chuyển gen có khả năng sản xuất ra

interleukin

interleukin có hoạt tính sinh học (IL-10), một loại (IL-10)

cytokine

cytokine có khả năng chống viêm chống viêm

- Thuốc lá từ lâu đã được biết là không có lợi cho sức khỏe, nhưng hiện nay các nhà khoa học vừa thành công trong một nghiên cứu thử nghiệm sử dụng cây thuốc lá chuyển gen để tạo thuốc trị các

bệnh tự miễn dịch và dễ bị viêm bao gồm luôn cả bệnh tiểu đường

bệnh tiểu đường.

Lợi ích của cây thuốc lá chuyển gen

- Họ thử 2 loại IL-10 có nguồn gốc khác nhau (một thử 2 loại IL-10

từ virus và 1 từ chuột) và cuối cùng là tái sinh cây chuyển gen

chuyển gen để xem loại nào hoạt động hiệu quả nhất.