chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (fmd)

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lở mồm long móng Foot and Mouth Disease – FMD hiện nay vẫn đang còn gây thiệt hại kinh tế quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới, mặc dù nó đã được thanh toán hoặc khống ch

Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học

Lớp DH06SH

P

Tiểu luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC GIA CẦM

CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG

(FMDV) BẰNG KỸ THUẬT GENE

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease – FMD) hiện nay vẫn đang còn gây thiệt hại kinh tế quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới, mặc dù nó đã được thanh toán hoặc khống chế thành công tại nhiều nước Bệnh gây thành dịch ở nhiều loài động vật móng guốc chẵn, chủ yếu là trâu, bò và lợn Bệnh lở mồm long móng được biết đến như nạn đại dịch của các đàn bò, cừu và lợn tại nhiều nước từ thế kỷ XIX Bệnh có ở khắp thế giới Cuối thế kỷ XIX, đại dịch đã hoành hành ở hầu hết châu Âu, kéo dài hơn 10 năm không tắt, gây bệnh cho hàng chục triệu bò, cừu Nửa đầu những năm 50 của thế kỷ XX, lại có một vụ dịch mới kéo dài gây thiệt hại lớn cho đàn gia súc ở nhiều nước thuộc châu Âu ở châu Á và châu Phi, bệnh cũng xảy ra trầm trọng như ở châu Âu, hầu hết các nước đã từng có bệnh Điều làm đau đầu các nhà dịch tễ học là tại nhiều nước và khu vực, sau nhiều năm liên tục tiêm phòng vacxin cho đàn gia súc và áp dụng các biện pháp kiểm soát bệnh nghiêm ngặt, bệnh tưởng như đã hoàn toàn biến mất, nay bỗng nhiên lại bùng phát dữ dội Điển hình ở Đài Loan năm 1997 từ nguồn dịch là vài con lợn mắc bệnh trên một chiếc thuyền buôn, trong vòng 2 tháng bệnh nhanh chóng lan ra hàng ngàn trại chăn nuôi lợn, làm suy sụp nền kinh tế chăn nuôi, thiệt hại khoảng 2 tỷ USD Để chẩn đoán lở mồm long móng, đầu tiên căn cứ vào dấu hiệu lâm sàng của bệnh Tuy nhiên điều này có thể bị nhầm lẫn do những bệnh có triệu chứng tương tự Ở trâu, bò bệnh viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis, VS) rất giống bệnh lở mồm long móng Ở lợn, bệnh mụn nước

ở lợn (swine vesicular disease, SVD) và bệnh mụn nước ban đỏ (vesicular exanthema ò swine, VES) tuy khác căn nguyên nhưng có triệu chứng giống nhau Sự phát hiện sớm giai đoạn nhiễm bệnh và xác định đúng bệnh nếu có thể trước khi xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng là yếu tố chủ yếu cho sự khống chế bệnh hiệu quả, ngăn chặn bệnh lây lan Điều

đó đòi hỏi phải có phương pháp chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, chính xác có thể cho kết quả trong vòng 24g Hơn nữa, sự xác định kịp thời typ đặc hiệu của virus thuộc địa và đặc

tính phân tử của nó là rất cần thiết để thực hiện tiêm phòng khẩn cấp với kháng nguyên tương ứng và để đánh dấu nguồn gốc ổ dịch Vì thế chẩn đoán bằng kỹ thuật gene là phương pháp đang được nghiên cứu và áp dụng để phát hiện kịp thời để đưa ra những giải pháp xử lý hiệu quả

I TỔNG QUAN

1.1 FMD (foot and mouth disease)

Lở mồm long móng (FMD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do virus gây ra Đây là bệnh được tổ chức dịch tể thế giới (Office International des Epizooties _ OIE) xếp vào hàng đầu trong danh mục A gồm 15 bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho các loài móng guốc chẵn: trâu, bò, dê, cừu, heo (Cục thú y, 1993) Năm 2001, một vụ dịch khác xảy ra sau hơn 20 năm vắng bóng tại nước Anh, cũng gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi và du lịch khoảng 2 tỷ USD Ở nước ta bệnh đầu tiên được phát hiện ở Nha Trang (1898) sau

đó lang ở cả ba miền Năm 1995 có 26 tỉnh, thành có bệnh với hàng ngàn ổ dịch (19.883 trâu, bò và 10.293 heo bệnh, chết 384 trâu bò, 5208 heo _ cục thú y Việt Nam) đã gây tác hại lớn đến nền kinh tế cho các trại chăn nuôi (giảm 25% sức sản xuất) và nền kinh tế nước ta Việt Nam là nước trong vùng Châu Á được báo cáo trên bản đồ dịch tể bệnh lở mồm long móng thế giới là vùng dịch địa phương (endemic) (Gleeson, 2002) Dịch lở mồm long móng đã xảy ra trên trâu bò liên tục suốt thời gian từ 1975-2005, trên lợn 1992-2005 và gây thiệt hại nặng nề nhất vào các năm 1993, 1995, 1999, 2000 Ngoài typ

O lưu hành trong nhiều năm qua, typ A cũng đã được phát hiện năm 2004 trên trâu bò và

typ Asia 1 trên lợn năm 2005 ở Việt Nam FMD là một bệnh địa phương và các type huyết thanh phổ biến là O, Asia 1 và A Các typ huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới Typ huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á Riêng typ huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippine Trong các ổ dịch, động vật có thể mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều typ huyết thanh Sự biến đổi của các typ huyết thanh cũng khá phức tạp, đôi khi còn những điều chưa được hiểu biết rõ Các

chủng virus lở mồm long móng biến đổi rất nhiều và do sự phân bố rộng rãi, phức tạp của chúng nên thường gặp rất nhiều khó khăn trong việc xác định nguồn gốc lây lan của chúng Chỉ riêng typ O người ta đã các định được 8 nhóm với kiểu di truyền sai khác nhau từ 15% trở lên khi so sánh trình tự gene VP1 Virus lở mồm long móng typ A là nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất, typ A có đến 32 subtype Và hiện nay người ta cũng chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của virus typ A khi giải trình tự gene VP1 Với virus typ C việc giải trình tự gene VP1 cho phép phân chúng thành 8 nhóm di truyền Typ virus Asia 1 có sự đa dạng di truyền ít nhất, chúng chỉ có 1 nhóm di truyền Theo kết quả giải trình tự gene VP1 các typ SAT1 có 3 nhóm, SAT2 có 2 nhóm, SAT3 có 3 nhóm di truyền và phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng Ở Việt Nam đã xác định có typ O, A, và Asia 1 ở trâu, bò và typ A, O ở heo

1.2 Triệu chứng bệnh tích

™ Triệu chứng

Ở trâu bò và lợn hoặc các loài vật khác, bệnh có chung đặc điểm là sốt đột ngột 2-3 ngày, viêm dạng mụn nước rồi lở loét ở miệng, vú, vùng móng chân, nước bọt chảy nhiều như

bọt bia Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng, khô, nóng Mụn nước bắt đầu mọc

ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề mặt lưỡi Kích thước mụn bằng hạt gạo, hạt ngô hoặc to hơn Mụn nước phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong chứa nước trong, sau đục dần Sau 1-2 ngày, mụn nước bị vỡ, lớp niêm mạc tróc ra để lộ mặt dưới

đỏ, chạm nhẹ vào dễ chảy máu Mụn nước thường không có mủ Do viêm vùng miệng, con vật có chịu, luôn lúc lắc đầu, nhai tóp tép, nước bọt sùi ra đầy mõm miệng, chảy lòng thòng thành sợi dài

Do có viêm mụn nước ở vùng vành móng, kẽ móng chân làm con vật khó chịu, tỏ ra đau đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên Dễ thấy nhất là hiện tượng què, không đi cày kéo được trong khoảng 1-2 tuần Có trường hợp móng chân bị long hẳn ra, phổ biến nhất là ở lợn Triệu chứng què ở cả đàn trâu bò gây ảnh hưởng xấu đối với vùng dựa vào sức kéo của chúng, làm lỡ thời vụ gieo trồng, có nơi năng suất lúa bị giảm 20%

ở con vật cái đang nuôi con, triệu chứng và bệnh tích ở bầu vú, núm vú cũng tương tự như ở miệng và chân làm con vật giảm tiết sữa, sữa bị giảm phẩm chất Con mẹ thường không cho con bú vì đau, làm con non thiếu sữa Hơn nữa chính con non cũng bị viêm lở mồm như mẹ nên không bú được Hậu quả có tới 50-80% gia súc non bị chết Ở con vật trưởng thành, tỷ lệ mắc bệnh trong đàn có serotyp đều gây bệnh giống nhau

Súc vật cái mang thai nhiễm virus lở mồm long móng sẽ sẩy thai

Biến chứng: Viên cơ tim ở súc vật non và viêm ruột (bê non, lợn <-2 tháng)

Hình: Triệu chứng FMD ở trâu, bò và heo

™ Bệnh tích

Từ miệng tới thực quản, dạ dày, ruột đều có mụn loét với từng mảng xuất huyết hoặc tụ máu Bộ máy hô hấp cũng bị viêm

Ở trâu bò hay gặp hiện tượng mặt ngoài cơ tim có những vệt hoại tử màu trắng xen kẽ trông giống như da hổ nên gọi là “tim vằn hổ”

Bệnh lở mồm long móng ở người: Lây nhiễm bệnh lở mồm long móng ở người khá hiếm

và nhẹ Đôi khi gặp ở người hay tiếp xúc với gia súc có bệnh hoặc với virus trong phòng thí nghiệm như người chăn nuôi, chăm sóc gia súc, cán bộ thú y, công nhân lò mổ, nhân viên phòng thí nghiệm Đôi khi do uống sữa nhiễm mầm bệnh không tiệt trùng kỹ, hoặc qua vết trầy xước trên da Biểu hiện là có mụn nước nổi trên da ở tay, chân và lưỡi, lợi,

có cảm giác ngứa ngáy và hơi nóng rát Mụn nước có thể tự vỡ ra hoặc xẹp đi sau

1.3 Đường lây truyền và thời gian lây truyền

ra hoặc gián tiếp qua thức ăn, nước uống, bãi chăn, đồng cỏ, dụng cụ, quần áo, tay chân

bị nhiễm trùng ở đây, con người là yếu tố quan trọng làm lây lan bệnh, nhất là khi đưa gia súc có bệnh hoặc các sản phẩm của chúng đến nơi khác Bệnh có thể truyền qua bào thai

™ Thời kỳ ủ bệnh

Từ 1 – 7 ngày, trung bình 3 – 4 ngày Trong suốt thời gian từ khi có các triệu chứng đầu tiên đến khi khỏi bệnh Nhiều trâu bò sau khi khỏi bệnh vẫn còn mang trùng và thải trùng hàng tháng, có trường hợp tới 3 năm Lợn có vai trò thải trùng rất lớn, gấp nhiều lần trâu

bò khi đang có triệu chứng, nhưng sau khi khỏi lâm sàng, lợn vẫn thải virut sau 1-2

tháng, trâu bò sau khỏi lâm sàng vẫn thải virut 6-24 tháng Đây là đặc điểm quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh ở gia súc Sức đề kháng của mầm bệnh với điều kiện tự nhiên và thuốc sát trùng

II NỘI DUNG

2.1 Giới thiệu về virus gây lở mồng long móng (FMDV)

Do virus Apthovirus gây ra Aphthovirus thuộc giống Picornaviridae Có 7 type huyết thanh gồm: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1 gây bệnh có triệu chứng giống nhau nhưng không gây miễn dịch chéo Các typ O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 … căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc của FMDV (foot and mouth disease virus) là cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, gồm 1 sợi RNA mạch đơn chứa

8500 nucleotide được đóng gói trong một vỏ protein được tạo thành từ 60 capsome, không vỏ bọc Mỗi capsomer gồm 4 loại polypeptide VP (virus protein) ký hiệu

VP1(1D), VP2 (1C), VP3 (1B), VP4 (1A) 4 loại VP này đều có nguồn gốc từ VP0, VP1

ở lớp ngoài cùng, là yếu tố cấu trúc, tham gia quá trình cố định virus trên màng tế bào, có tính sinh miễn dịch chủ yếu Người ta đã ứng dụng phát hiện này để điều chế vacxin cho hiệu quả cao với VP1 (dẫn liệu của Lê Anh Phụng, 1996; Trần Thanh Phong, 1996) Do

có đặc điểm của các virus sợi đơn (+) RNA, virus có tính biến dị và truyền nhiễm mạnh

Bộ gene gồm vùng không giải mã (UTR: untranslated region) dài 1200base ở đầu 5’ (5’UTR) (có vai trò quan trọng trong việc giải mã, độc lực, hình thành capsid), vùng này chứa một cấu trúc thứ cấp có thể xoay (clover-leaf secondary structure), và được biết như

là vị trí để tiến vào bên trong ribosome (IRES: international ribosome entry site) và đầu 3’ (3’UTR) Phần giải mã protein cấu trúc (1ABCD) và phần giải mã protein không cấu trúc (2ABC và 3ABCD) Chỉ thị phần tử sử dụng nhiều nhất trong định typ và nghiên cứu phả hệ virus lở mồm long móng là 5’UTR và VP1 Cả hai đầu của bộ gene có thể được

thay đổi, đầu 5’ tận cùng bởi VPg (genome-linked protein) (khoảng 23 acid amin), đầu 3’ bởi chuổi dài adenyl (King, 2000)

5' UTR L VP4 VP2VP3VP12A2B2C3A3B 1 3B 2 3B 3 3C3D3' UTR

VP1: xanh dương

VP2: xanh lá cây VP3: đỏ

VP4: vàng

pentamer, 12 pentamer liên kết nhau theo cấu trúc khối đối xứng gồm 3 trục để hình

thành 1 sợi RNA, đó là 1 virus

Hình: Cấu trúc của FMDV Có

3 loại protein bề mặt là VP1, VP2, VP3 Mỗi protein hiện diện với dạng hình thang trên bề mặt Ba loại protein này nhóm lại tạo thành 1 đơn vị cấu trúc được chỉ ở bên trái

Vỏ protein ngoài của virus được tạo thành từ 60 bản copy của mỗi loại protein 1A (VP4), 1B (VP2), 1C (VP3), và 1D (VP1)

4 loại protein này lắp ráp thành một đơn vị thay thế protein (protein sub-unit) hay một protomer 5 protomer kết hợp thành 1 pentamer 12 pentamer đóng gói vào sợi RNA và tạo thành hạt virus. 

Hình: cấu trúc FMDV 

Thành phần hệ gene của virus luôn biến đổi ngay cả trong một serotyp, các chủng phân lập ở các vùng địa lý khác nhau có mức độ tương đồng về thành phần nucleotide và acid amin cũng khác nhau (Feng và ctv, 2004)

™ Sức đề kháng

Tương đối mạnh, chịu lạnh, chịu khô đến 14 ngày (mùa hè), 6 tháng (mùa đông) Trong đất từ 3-28 ngày Trong nước tiểu virus tồn tại 39 ngày Virus bền vững ở pH 7,2 và 7,6 nhưng rất mẫn cảm với pH <4 và pH >11 Ở 40C virus có thể sống sót 1 năm, nhưng khi nhiệt độ tăng lên thì thời gian sống sót còn 8-10 tuần ở 280C, 10 ngày ở 370C và ít hơn 30 phút ở 500C Đun nóng 700C, chết sau 15 phút, 1000C chết ngay Trong tủ lạnh sống được

425 ngày, trong cỏ khô sống được 8-15 tuần Trong đất ẩm virut sống hàng năm Xút 1%

diệt virus sau 10 phút, Formol 2% - 6 giờ

Virus trong không khí còn sống tốt nhất ở ẩm độ tương đối RH > 60%

2.2 Các phương pháp chẩn đoán

Các kỹ thuật phân tích khác nhau đã được sử dụng để phát hiện acid nucleic của virus, kháng nguyên và sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ gồm: kết hợp bổ thể (complement fixation test_CFT), trung hòa virus (virus neutralization), ELISA (enzyme_linked

immunosorbent assay), RT_PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), xác định trình tự chuổi acid nucleic (nucleic acid sequence_based amplification, NASBA) (Anonymous, 2000; Collins và ctv, 2002; Feng và ctv, 2003)

™ Kết hợp bổ thể: dùng kháng thể chuẩn để phát hiện serotype virus O, A, C trong bệnh phẩm Phản ứng nhanh chỉ trong 12 giờ, đơn giản giúp khẳng định hoặc loại trừ nghi ngờ bệnh lở mồm long móng (FMD) Phản ứng này cũng đã được hoàn thiện và nếu sử dụng thành thục sẽ là một phương pháp hữu hiệu để chẩn đoán phân biệt giữa virus lở mồm long móng và các virus gây viêm mụn nước khác

™ Trung hòa virus: phát hiện qua xét nghiệm mẫu bằng phản ứng trung hòa virus dựa trên khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng thể kháng virus (nếu có) trong mẫu bệnh phẩm với virus lở mồm long móng Đây là phản ứng được dùng làm thí nghiệm kiểm chứng do có tính đặc hiệu cao nhưng phản ứng này không phân biệt được kháng thể có được là do tiêm phòng hay nhiễm bệnh Phương pháp này sử dụng dòng tế bào mẫn cảm BHK-21, hoặc tế bào sơ cấp của thận heo, cừu Kháng thể trung hòa được phát hiện sau 4-5 ngày bệnh

™ ELISA: được dùng phát hiện kháng nguyên và kháng thể virus trong vòng 3-4 giờ, không phụ thuộc môi trường mô, đặc hiệu nhanh, ít (+) tính giả Hiện bộ kit chẩn đoán đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 4

serotyp kháng nguyên O, A, C, Asia 1, và bộ kháng nguyên chuẩn để chẩn đoán 3 serotyp O, A, C Phương pháp này chẩn đoán nhanh, đặc hiệu và độ nhạy cao, được dùng trong giám định serotype của virus, thay thế phương pháp kết hợp bổ thể Có thể đây là 1 kỹ thuật huyết thanh học nhạy nhất với mục đích chẩn đoán và xác định typ

Cả hai phương pháp trung hòa virus và ELISA cạnh tranh trong pha lỏng đều phát hiện kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng không phân biệt được đó là kháng thể của động vật đã tiêm vacxin hay do nhiễm virus

Virus lở mồm long móng (FMDV) khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ sẽ dịch mã để tạo nên các protein cấu trúc và protein không cấu trúc Các protein không cấu trúc liên quan đến hoạt động của virus và biến đổi chức năng tế bào vật chủ Một số protein không cấu trúc gây đáp ứng miễn dịch và tạo ra các kháng thể đặc hiệu với chúng Vacxin chỉ chứa hạt virus tinh sạch với dung dịch đệm và chất bổ trợ nên đáp ứng miễn dịch với vacxin chỉ tạo ra kháng thể kháng protein cấu trúc của virus Trong trường hợp vacxin không tinh sạch bị nhiễm protein không cấu trúc, cũng xảy ra một đáp ứng miễn dịch yếu và ngắn ngủi đối với loại protein này, vì hàm lượng chúng rất thấp Do đó nếu phát hiện kháng thể kháng protein không cấu trúc ta có thể kết luận con vật bị nhiễm virus lở mồm long móng (FMDV) chứ không phải do vacxin

Một số protein không cấu trúc của virus gây đáp ứng miễn dịch: 3D, 3A/3AB/3ABC, 2C, 2B, 3C và Lpro Trong thời gian gần đây một số protein không cấu trúc 2C, 3B, 3AB, 3ABC đã được nghiên cứu và nhiều phương pháp có độ nhạy cao đã được phát triển

™ RT_PCR: để xác định gia súc nhiễm bệnh đồng thời xác định typ virus gây bệnh FMD dai dẳng ở thực địa thì kỹ thuật PCR rất nhạy, nhanh, chính xác, hiệu quả sẽ

cần thiết và được xem như là phương pháp bổ sung hay thay thế cho phương pháp huyết thanh học

Phương pháp kết hợp bổ thể, phương pháp ELISA mới chỉ dừng lại ở việc trả lời câu hỏi type gây bệnh thuộc loại gì Phương pháp RT- PCR không dừng lại ở đó, chúng còn có thể phân biệt được sự khác biệt biến chủng có trong bệnh phẩm đã xác định có cùng một type huyết thanh, thông qua việc định chuỗi các sản phẩm PCR và so sánh trình tự đoạn DNA với các trình tự DNA khác của virus lở mồm long móng được chứa sẵn trong ngân hàng dữ liệu gen

9 Ưu điểm của RT-PCR

Những mẫu huyết thanh dương tính từ mẫu máu thu nhận có biểu hiện lâm sàn đối với virus thì không đủ cơ sở cho việc chẩn đoán virus Có thể đó chính là sự hiện diện của kháng thể mẹ truyền cho con Vì thế việc dùng kỹ thuật PCR để xác định chính xác sự hiện diện của FMDV Dùng kỹ thuật PCR không cần phân lập virus trong môi trường nuôi cấy tế bào Vì thế PCR sẽ tốn ít thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào PCR còn được coi là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Thông thường thời gian chẩn đoán bệnh phải mất trên 10 giờ đồng hồ đối với kỹ thuật soi bằng mắt, 5- 6 giờ đối với kỹ thuật ELISA (kỹ thuật này độ nhạy còn kém và chi phí khá cao) Áp dụng kỹ thuật RT- PCR vào chẩn đoán thời gian đã được rút ngắn xuống còn 4-

5 giờ với độ chính xác cao, an toàn TS Tô Long Thành cho biết: "Bình thường để biết con vật có mắc bệnh hay không, chúng ta phải đợi đến khi chúng phát bệnh ra ngoài với các hiện tượng chảy nước bọt ở mồm, mũi hay nứt toác móng chân Kỹ thuật RT- PCR cho phép phát hiện bệnh ngay trong giai đoạn đầu tiên"