KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VI KHUẨN Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri VÀ Vibrio TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH CÓ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC (probiotic) Ở ĐỒNG THÁP

KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VI KHUẨN Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri VÀ Vibrio TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH CÓ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC (probiotic) Ở ĐỒNG THÁP"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Bộ môn Sinh học bệnh thủy sản ĐẶNG CHÍ CƠNG KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VI KHUẨN Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri VÀ Vibrio TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH CÓ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC (probiotic) Ở ĐỒNG THÁP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Bộ môn Sinh học bệnh thủy sản ĐẶNG CHÍ CƠNG KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VI KHUẨN Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri VÀ Vibrio TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC NI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH CĨ SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC (probiotic) Ở ĐỒNG THÁP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS NGUYỄN THỊ THU HẰNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong năm gần nghề Nuôi trồng Thủy sản Việt Nam phát triển mạnh, sản lượng xuất không ngừng tăng lên, số mặt hàng thủy sản xuất cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối tượng chiếm sản lượng cao Theo số liệu Tổng cục Hải quan, năm 2008, Việt Nam xuất 640 nghìn cá tra, basa loại, đạt 1,453 tỉ USD, trì mức tăng trưởng 66% khối lượng 48% giá trị so với năm 2007 Tuy nhiên, ngành ni trồng thủy sản nói chung nghề ni cá tra nói riêng phải đối mặt với nhiều thách thức lớn nuôi cá cách tự phát chưa theo qui hoạch cụ thể, nuôi với mật độ ngày cao, hệ thống thủy lợi phục vụ nuôi thủy sản chưa đảm bảo làm ô nhiễm môi trường nước Đặc biệt trình ni lượng thức ăn dư thừa, chất thải cá, phân hủy chất hữu tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây hại phát triển Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas, Vibrio …là tác nhân yếu gây bệnh xuất huyết, trắng da, bệnh gan thân mủ làm thiệt hại đáng kể đến suất ao nuôi (Từ Thanh Dung ctv, 2003) Hơn nữa, việc sử dụng kháng sinh để chữa bệnh cho cá khơng cịn ứng dụng nhiều dư lượng kháng sinh sản phẩm ngày cao, không đáp ứng yêu cầu số thị trường lớn Mỹ, Châu Âu Do vậy, số đề tài nghiên cứu vai trò chế phẩm sinh học (probiotic) ao nuôi thủy sản bước đầu mang lại hiệu Nghiên cứu Vijayabaskar et al (2008) ứng dụng thành công vi khuẩn có lợi mà cụ thể nhóm vi khuẩn bacillus sp nuôi cá rô phi nhằm để hạn chế mầm bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây Một nghiên cứu khác sử dụng CP Bio-dream bể ương ấu trùng tôm xanh cho thấy yếu tố thủy lý, hóa mơi trường nước bể ương nhiệt độ, pH, oxy hịa tan, khí NH 3, tốt so với ao đối chứng (Oanh et al., 2004) Qua việc sử dụng chế phẩm sinh học ni thủy sản có ý nghĩa thực tiễn góp phần đưa nghề ni thủy sản nước ta phát triển cách bền vững (Nguyễn Phước Thành, 2007) Để hiểu rõ thêm quan hệ nhóm vi khuẩn gây bệnh với tình hình dịch bệnh tỷ lệ sống cá nuôi Đề tài “Khảo sát mật độ vi khuẩn Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri Vibrio môi trường nước nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) Đồng Tháp” thực PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1.2 Mục tiêu Tìm hiểu mật số số giống loài vi khuẩn mơi trường nước ao ni cá tra thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học ao nuôi không sử dụng chế phẩm sinh học 1.3 Nội dung − Phân tích mẫu nước ao ni cá tra thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học − Phân tích mẫu nước ao nuôi cá tra thâm canh không sử dụng chế phẩm sinh học PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đặc điểm sinh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Cá tra phân bố chủ yếu lưu vực sơng Mê kơng, có mặt nước Lào, Việt Nam, Campuchia Thái lan Ở Việt Nam, cá tra nuôi thương phẩm nhiều tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh, (Ferguson et al., 2001) Cá tra sống chủ yếu nước ngọt, sống vùng nước lợ nhạt (nồng độ muối 10‰), chịu đựng nước phèn với pH > Cá có quan hơ hấp phụ, hơ hấp bóng khí nên chịu đựng mơi trường nước có nồng độ oxy hịa tan thấp Do cá tra ni mơ hình ni khác mật độ cao loài thủy sản khác (Ali et al., 2005) Cá tra lớn nhanh ao nuôi Sau tháng ni, cá đạt trọng lượng 1-1,2kg/con Là lồi cá ăn tạp, thích ăn mồi có nguồn gốc động vật, ăn nhiều loại thức ăn từ phụ phế phẩm loại thức ăn viên công nghiệp tự chế theo công thức 70,2% cám : 29,8% cá tạp (Huỳnh Thị Tú ctv, 2006) 2.2 Tình hình ni cá tra ngồi nước 2.2.1 Trong nước Lợi dụng đặc tính cá tra sống mơi trường có oxy thấp ăn thức ăn cơng nghiệp mà người dân ni cá tra với mơ hình khác nuôi ao, nuôi đăng quầng nuôi bè mật độ cao tùy theo mơ hình ni mang lại hiệu kinh tế cao, chứng sản lượng tăng nhanh vượt bật 10 năm trở lại đây, tổng sản lượng cá tra nuôi năm 2002 150.000 đến năm 2005 500.000 (Dương Nhật Long, 2006) đến cuối năm 2006 tổng sản lượng cá tra toàn quốc lên đến khoảng 825.000 (Hà Văn, 2007) Số liệu chứng minh cá tra đối tượng quan trọng để phát triển kinh tế đất nước để phát triển cách bền vững, Bộ Thủy sản đưa vào thử nghiệm mơ hình ni cá tra Bước đầu mang lại hiệu có ý nghĩa thực tiển nghề nuôi cá tra hứa hẹn phát triển tương lai 2.2.2 Ngoài nước Hiện nay, cá tra đối tượng nuôi kinh tế quan trọng số quốc gia Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Malaysia, Trung Quốc, Bangladesh với nhiều mơ hình ni khác mang lại hiệu thiết thực Trong số PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Thái lan quốc gia có sản lượng ni cá tra tương đối lớn đứng sau Việt Nam, cịn Bangladesh với mơ hình ni cá tra vùng nông thôn cho sản lượng từ 5,08,5 tấn/ha/năm Bangladesh ngày trọng việc cải tiến mơ hình ni nhằm đạt sản lượng cao, tốc độ tăng trưởng nhanh, hiệu cao Tuy nhiên, dịch bệnh thường xun xảy q trình ni đặc biệt bệnh gan thận mủ, xuất huyết, trắng da trắng mang vi khuẩn gây Đó số nguyên nhân làm giảm sản lượng chất lượng cá tra nuôi (Ahmed et al., 2007) 2.3 Một số bệnh thường gặp cá tra Song song với tăng sản lượng khơng ngừng tình hình dịch bệnh thường xun xảy ngày phức tạp bệnh ký sinh trùng; bệnh đốm đỏ, bệnh trắng da, phù đầu phù mắt, bệnh gan thận mủ vi khuẩn Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas Vibrio gây Gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra vùng Đồng sông Cửu Long (Từ Thanh Dung, 2008) 2.4 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas Vibrio động vật thủy sản 2.4.1 Vi khuẩn Aeromonas 2.4.1.1 Đặc điểm chung Aeromonas vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae, nhóm vi khuẩn gram âm, hình que có kích thước 0,3-1,0 x 1,0-4,0 µm, di động nhờ roi cực thể Phản ứng lên men oxy hóa đường, oxidase, catalase dương tính kháng với O/129 (Inglis et al., 1993) Aeromonas tìm thấy nước ao hồ ni ao ngồi tự nhiên (Swann et al., 1989) Vi khuẩn Aeromonas phát triển tốt môi trường thạch TSA (pH = 7,1-7,2) 24 28°C (Huys et al., 2003) môi trường Aeromonas agar nhiệt độ 28-30°C, khuẩn lạc số lồi có sắc tố màu vàng, kích thước thay đổi theo loài (Moro et al., 1999) Riêng Aeromonas hydrophila mơi trường Rimler-Shotts khuẩn lạc có màu vàng da cam, kích thước từ 2-3 mm (Inglis et al., 1993) 2.4.1.2 Phổ loài cảm nhiễm dấu hiệu bệnh lý Theo nghiên cứu Swann et al (1989) cho vi khuẩn Aeromonas sống môi trường ngọt, lợ, mặn chúng gây bệnh số loài cá nước ngọt, cá da trơn, cá biển cá cảnh bệnh nhiễm trùng máu (Motile Aeromonas Septicemia-MAS), bệnh lở loét (Ulcer Disease) gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi thủy sản PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Đặc điểm bệnh Aeromonas gây làm cho động vật bị bệnh xuất huyết, hình thành vết đỏ thể, lở loét da vết loét ngày lan rộng bề mặt da, quan ăn sâu vào bên cấu trúc mô Tùy vào đối tượng ni, nhóm vi khuẩn gây bệnh giai đoạn bệnh mà có biểu bệnh lý không giống (Inglis et al., 1993) Theo Bergey (1974) bệnh đốm đỏ gọi bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi…là vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây (Trích dẫn Từ Thanh Dung, 2008) Aeromonas hydrophila xem đối tượng gây bệnh nguy hiểm cho loài cá nước đặc biệt cá tra Thật vậy, theo nghiên cứu Ferguson et al (2001) cá tra nuôi thâm canh ao khu vực Đồng sơng Cửu Long có dấu hiệu xuất huyết, lồi mắt, gan tái nhạt A hydrophila gây (hình 2.1) Hình 2.1: Cá tra bệnh xuất huyết vi khuẩn A hydrophila (Nguồn: Crumlish, 2007) A hydrophila vi khuẩn gây bệnh có phổ loài cảm nhiễm rộng, gây bệnh đối tượng nuôi khác điều kiện khác Theo Nguyễn Chung (2008), A hydrophila gây bệnh lở loét cá bống tượng (Oxyeleotris marmorata) tỷ lệ chết lên đến 90% điều kiện môi trường bất lợi cho vật ni Ngồi ra, Bùi Quang Tề (2002) cho A hydrophila gây bệnh viêm ruột (đốm đỏ) cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus) làm hoại tử ruột vết loét ăn sâu vào cơ, tỷ lệ tử vong lên đến 70% Ngồi loại cá ni kinh tế cao có giá trị xuất cá tra, cá bống tượng, cá trắm cỏ A hydrophila gây bệnh xuất huyết bụng chân, quẹo cổ, mù mắt, chân bại liệt…trên ếch Thái Lan (Rana tigerina) (Trần Hồng Thủy, 2007) số đối tượng nuôi kinh tế khác cá chép, cá mè, cá trôi, cá tai tượng nuôi ao; cá mè nuôi bè; kể giáp xác bệnh đốm nâu tơm xanh Việt Nam (Đỗ Thị Hịa ctv, 2005), cá rô phi đỏ (Oreochomis niloticus), cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus) A hydrophila số PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com tác nhân hội, đóng vai trị quan trọng gây hội chứng lở loét (Epizootic Ulcerative Symdrome- EUS) cá lóc (Channa striata) Năm 2002, Řehulka nghiên cứu tác nhân gây bệnh lở loét da cá hồi (Oncorhynchus mykiss) phân lập vi khuẩn Aeromonas sobria Aeromonas caviae mẫu cá bệnh với triệu chứng lở loét da, lồi mắt, bụng đầy dịch, bong bóng gan bị xuất huyết nghiêm trọng Còn theo Bùi Quang Tề (2002) phân lập mẫu bệnh đốm đỏ cá trắm cỏ thấy diện Aeromonas caviae với tỷ lệ 25% số loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Aeromonas Ngoài tác nhân Aeromonas spp kết hợp với Aeromonas punctala gây bệnh xuất huyết cá kèo (Pseudapocryptes elongatus) gây tỷ lệ chết cao, đặc biệt giai đoạn cá nhỏ (Nguyễn Chung, 2008) Trong ao nuôi môi trường nước gặp bất lợi chất lượng nước xấu, hàm lượng oxy thấp, hàm lượng CO2 NO2 cao tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển tăng độc lực nhóm vi khuẩn Aeromonas gây bệnh cho cá nuôi (Swann et al., 1989) 2.4.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.4.2.1 Đặc điểm chung Edwardsiella ictaluri vi khuẩn gram âm, que ngắn, kích thước khoảng 0,75x1,5µm, thuộc nhóm Enterobacteriaceae di động yếu 25°C, không di động 35°C Catalase dương tính, âm tính với oxidase indole Khơng sinh H2S có khả lên men đường glucose, sinh gas 20-30°C 37°C khơng có tượng sinh gas (Keskin et al., 2002; Hawke et al., 1981 trích dẫn Inglis et al., 1993) Theo Shotts et al (1990) Edwardsiella ictaluri phát triển tốt môi trường chọn lọc Edwardsiella ictaluri medium (EIM) (pH=7,0-7,2) sau 48 nhiệt độ 28-30°C Khuẩn lạc có dạng nhỏ li ti, khơng suốt, có kích thước 0,5-1,0 mm Còn theo Crumlish et al (2002), phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra Việt Nam môi trường TSA sau 48 28°C cho thấy khuẩn lạc có dạng pinpoint (nhỏ li ti) có rìa xung quanh, màu trắng nhạt, kích thước từ 0,11-0,17 mm Phát triển yếu môi trường thạch 37°C (Keskin et al., 2002) Theo Plumb (1999), Edwardsiella ictaluri tồn nhiều môi trường nước (ao nuôi, hồ) lớp bùn đáy ao Tuy nhiên, phụ thuộc lớn vào điều kiện nhiệt độ môi trường nước, nhiệt độ nước 5°C vi khuẩn tồn ao khoảng 15 ngày 25°C thời gian tồn chúng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com nước khoảng 10 ngày Còn lớp bùn đáy ao Edwardsiella ictaluri tồn 15 ngày 5°C, 45 ngày 18°C 25°C sống 95 ngày (Trích dẫn Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008) 2.4.2.2 Phổ loài cảm nhiễm dấu hiệu bệnh lý Edwardsiella ictaluri lần phân lập Hawke (1979) cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), sau Austin & Austin (1987) phát Edwardsiella ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu (enteric septicemia of catfishESC) cấp tính đối tượng cá nheo Mỹ (Plumb et al., 1995) Tuy nhiên, khả gây hại Edwardsiella ictaluri cá nheo Mỹ phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường nước, 18°C gây chết 10% 25°C tỷ lệ tử vong lên đến 77%, trái lại 30°C 23% Trên cá nheo Mỹ, Edwardsiella ictaluri gây dấu hiệu bệnh lý bên ngồi có tượng xuất huyết da thân, mang, bụng hàm dưới, tổn thương màu đỏ xuất da, lan rộng giai đoạn sau bệnh, phòng mang, lồi mắt, bệnh mãn tính vết loét mở rộng quan phần đầu mắt gây tỷ lệ tử vong cao (Plumb et al., 1995) Bên cạnh cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Edwardsiella ictaluri gây bệnh số loài cá giống cá lao (I furcatus), cá sọc ngựa lam (Danio devario), cá trê trắng (Clarias batrachus) gây thiệt hại lớn kinh tế nghề nuôi cá công nghiệp Mỹ (Keskin et al., 2002) Ở Việt Nam bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây xuất vào năm 1998 cá tra ni Đồng sơng Cửu Long có tên BNP (bacillary necrosis of pangasius) (Ferguson et al., 2001) Theo Từ Thanh Dung ctv (2003) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trắng gan cá tra bệnh xảy tất giai đoạn phát triển cá tra, gây thiệt hại lớn giai đoạn cá cỡ 300-500 g với dấu hiệu bệnh lý cá gầy yếu, bơi lờ đờ, có tượng xuất huyết da hậu môn Bên nội quan xuất đốm trắng đường kính 1-3 mm gan, thận, tùy tạng có tượng nhũn thận (hình 2.2) Đây bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho hộ nuôi cá tra, basa Đồng sông Cửu Long Tỷ lệ xuất bệnh mủ gan cá tra khoảng (61%) không cao nhiều so với bệnh khác bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (68,3%), bệnh phù đầu (51,2%) tỷ lệ chết cao lên đến 90% (Trần Anh Dũng, 2005) Hiện Đồng sông Cửu Long bệnh gan thận mủ xuất quanh năm, yếu tố gây sốc cho động vật thủy sản điều kiện cho vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Hình 2.2 Cá tra bệnh mủ gan: đốm trắng gan, thân tùy tạng ( (Nguồn: Từ Thanh Dung, 2003) ) Theo Keskin et al (2002) phân lập Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá hồi (Oncorhynchus mykiss) Thổ Nhĩ Kỳ với đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa tương tự nghiên cứu Từ Thanh Dung ctv (2003) Plumb et al (2005) 2.4.3 Vi khuẩn Pseudomonas 2.4.3.1 Đặc điểm chung Inglis et al (1993) cho biết giống Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae vi khuẩn gram âm, hình que thẳng cong, có kích thước 0,5-1,0 x 1,55,0 µm Di động mạnh hay nhiều tiên mao, oxidase dương tính, âm tính với vi khuẩn dạng que thẳng Có thể tạo sắc tố màu vàng-xanh hay xanh nhạt, không lên men môi trường O/F Pseudomonas vi khuẩn rộng nhiệt phát triển khoảng nhiệt độ thay đổi từ 4-43°C Chúng có khả thích ứng rộng, tồn nước lẫn bùn ngồi tự nhiên ao ni đơi tìm thấy khỏe Có thể gây bệnh động vật, thực vật người Vi khuẩn Pseudomonas phát triển tốt môi trường Pseudomonas isolation agar 18-48 33-37°C 2.4.3.2 Phổ loài cảm nhiễm dấu hiệu bệnh lý Ba loài gây bệnh chủ yếu động vật thủy sản Pseudomonas fluoresens phân bố chủ yếu nước ngọt, P chlororaphis, P anguilliseptica phân bố chủ yếu vùng biển (Inglis et al., 1993) Theo Nguyễn Chung (2008) bổ sung thêm loài Pseudomonas spp, P aeroginosa, P dermoalba,…cũng gây bệnh số đối tượng cá nuôi Việt Nam Wakababayshi & Egusa (1972) cho Pseudomonas tác nhân hội, đặc thù hầu hết thủy vực tự nhiên, gây bệnh nhiều đối tượng nuôi thủy sản Bằng chứng bệnh đốm đỏ (Red spot disease) cá chình PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 12 Ferguson, H.K., J.F Turbull, A Shinn, K Thompson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed the Mekong Delta, Vietnam Journal of Fish Diseases, 24: 509-513pp 13 Hà Văn, 2007 điều kiện để phát triển bền vững nghề nuôi cá tra http://agriviet.com/news_detail1059-c46-s67-p1-3_dieu_kien_de_phat_trien_ ben_vung_nghe_nuoi_ca_tra.html (cập nhật 04/11/2008) 14 Health Protection Agency (2004) Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar (TCBS agar) National Standard Method MSOP 16 Issue http://www.hpastandardmethods.org.uk/pdf_sops.asp 15 Huỳnh Thị Phương Uyên, 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thuốc kháng sinh lên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Khoa Thủy sản Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 16 Huỳnh Thị Tú, Trần Văn Nhì, Trần Văn Bùi, Trần Thị Thanh Hiền Nguyễn Thanh Phương, 2006 Tình hình ni sử dụng thức ăn cho cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi ao bè An Giang Tạp chí nghiên cứu khoa học 2006: trang 152-157 17 Huys, G 2002 Preservation of bacteria using commercial cryopreservation systems Standard Operationg Procedure, Asiaresist 2002 18 Huys, G., M Pearson, P Kämpfer, R Denys, M Cnockaert, V Inglis and J Swings, 2003 Aeromonas hydrophila subsp ranae subsp nov., isolated from septicaemic farmed frogs in Thailand International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53: 885–891pp 19 Inglis V., R.J Roberts and N.R Bromage, 1993 Bacterial disease of fish Institute of aquaculture 20 Keskin, O., S Seỗer, M Izgür, S Türkyilmaz, S Mkakosya, 2002 Edwardsiella ictaluri Infection in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Turk J Vet Anim Sci, 28 (2004): 649-653pp 21 Lê Đình Duẩn Phạm Văn Ty, 2007 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic làm nước nuôi tôm Trường Đại học KHTN-ĐHQG Hà Nội 22 Moriarty, D.J.W., 1999 Disease Control in Shrimp Aquaculture with Probiotic Bacteria Microbial Interactions in Aquaculture 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 23 Moro, E., R Weiss, R Friedrich, C Vargas, L Weiss and M P Nunes, 1999 Aeromonas hydrophila isolated from cases of bovine seminal vesiculitis in south Brazil J Vet Diagn Invest, 11:189–191pp 24 Nguyễn Chung, 2008 Kỹ thuật nuôi cá kèo (Pseudapocryptes elongatus) NXB Nông nghiệp Hà Nội 25 Nguyễn Chung, 2008 Kỹ thuật sinh sản nuôi cá bống tượng (Oxyeleotris marmorata) NXB Nông nghiệp Hà Nội 26 Nguyễn Phước Thành, 2007 Sử dụng men vi sinh nuôi trồng thủy sản http://agriviet.com/?comp=news_details&cat=46&&p=6&id=742 (cập nhật ngày 02/11/2008) 27 Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008 Điều tra trạng nuôi, bệnh tình hình sử dụng thuốc - hóa chất nuôi thâm canh cá tra ao (Pangasianodon hypophthalmus) Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 28 Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005 Giáo trình thực tập vi sinh vật học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 29 Nusbaum, K.E and E.E Morrison, 2002 Edwardsiella ictaluri bacteraemia elicits shedding of Aeromonas hydrophila complex in latently infected channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque) Journal of Fish Diseases, 25: 343-350pp 30 Oanh, D.T.H., 1999 Characterization and Pathogenicity Studies on Vibrio Bacteria Isolated from fish anf shellfish in Vietnam College Aquaculture and Fisheries Can Tho Unversity 29pp 31 Oanh, D.T.H., T.T.T Hoa and N.T Phuong, 2004 The Effects of Probiotics on Culture Conditions of Freshwater Prawn (Macrobrachium rosenbergii) Larvae nstitute for Marine Aquaculture, College of Agriculture, Can Tho Unversity, Can Tho, Vietnam 32 Olsson, J.C., A Westerdahl, P.L Conway and S Kjelleberg, 1992 Intestinal Colonization Potential of Turbot (Scophthalmus maximus)- and Dab (Limanda limanda)-Associated Bacteria with Inhibitory Effects against Vibrio anguillarum Applied And Environmental Microbiology, 58: 551556pp 33 Phạm Thị Mỹ Hạnh, 2004 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasius hypophthalmus) 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa thủy sản Trường Đại học Cần Thơ, 47 trang 34 Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007 Giáo trình vi sinh vật hữu ích Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 35 Plumb, J.A and C Shoemaker, 1995 Effects of temperature and salt concentration on latent Edwardsiella ictaluri infections in channel catfish Disease Of Aquatic Organisms, 21: 171-175pp 36 Plumb, J.A and D.J Sanchez, 2006 Susceptibility of five species of fish to Edwardsiella ictaluri Journal of Fish Diseases, 6:261-266pp 37 Reed, P A and R Francis-Floyd, 1996 Vibrio Infections of Fish Institute of Food and Agricultural Sciences Published June 1996 38 Řehulka, J., (2002) Aeromonas causes severe skin lesions in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): clinical pathology, haematology and biochemistry ACTA VET BRNO, 71: 351–360pp 39 Shotts, E.B and W.D Waltman, 1990 A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri Journal of Wildlife Diseases, 26: 214-218 pp 40 Swann, L and M.R White, 1989 Diagnosis and Treatment of “Aeromonas hydrophila” Infection of Fish Aquaculture Extension 41 Tô Công Tâm, 2002 Khảo sát biến động yếu tố thủy lý, hóa nước nhóm vi khuẩn gây bệnh ao ni cá tra mùa lũ Tiểu luận tốt nghiệp Đại học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 42 Trần Anh Dũng, 2005 Điều tra tình hình bệnh cá tra (Pangasius hypophthalmus) basa (Pangasius borcouti) nuôi thâm canh An Giang Luận văn cao học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 43 Trần Hồng Thủy, 2007 Phân lập định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila ếch Thái Lan (Rana tigerina) nuôi khu vực ven đô Thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí KHKT Nơng lâm nghiệp & (2007) Đại học Nông lâm Tp HCM 44 Trần Thị Tuyết Hoa, Cao Tuấn Anh, Đặng Thụy Mai Thy, Nguyễn Thị Thu Hằng Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007 Bệnh vi khuẩn cá tra (Pangasius hypophthalmus) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) Nguyễn Thanh Phương, 2007 Quan trắc môi trường xác định tác nhân gây bệnh cá da trơn (Tra- Pangasius hypophthalmus basa- Pangasius borcouti) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tỉnh An Giang Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 45 Từ Thanh Dung Nguyễn Thị Như Ngọc, 2002 Giáo trình bệnh học thủy sản Khoa Thủy sản Đại học Cần Thơ 46 Từ Thanh Dung Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006 Thực tập bệnh vi khuẩn động vật thủy sản Khoa Thủy sản Đại học Cần Thơ 47 Từ Thanh Dung, 2008 Bài giảng bệnh vi khuẩn động vật thủy sản Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 48 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hồng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thủy sản Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ 49 Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2003 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 trang 50 Vijayabaskar, P and S.T Somasundaran, 2008 Isolation of bacteriocin producing lactic acid bacteria from fish gut and probiotic activity against common fresh water fich pathogen Aeromonas hydrophila Biotechnology, 7: 124-128pp 51 Xiang-Hong, W., L Jun, J Wei-Shang, X Huai-Shu, 1998 Application of Probiotics in Aquaculture Ocean University of Qingdao Qingdao 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC 1 Thành phần cách pha số môi trường chọn lọc 1.1 Môi trường Aeromonas medium base (England) Thành phần: − − − − − − − − − − − − − − − Proteoes pentone Yeast extract Lysine mono-hydrochloride L-Arginine mono-hydrochloride Inositol Lactose Sorbitol Xylose Bile salt Sodium thiosulphate Sodium chloride Ferric ammonium citrate Bromothymol blue Thymol blue Agar 5,0 g 3,0 g 3,5 g 2,0 g 2,5 g 1,5 g 3,0 g 3,75 g 3,0 g 10,67 g 5,0 g 0,8 g 0,04 g 0,04 g 12,5 g Hịa tan 29,5 g mơi trường với 500 ml nước cất sau nấu đến tan mơi trường, để nguội khoảng 40-50°C, cho dung dịch ampicillin (hòa tan với ml nước cất tiệt trùng) vào dung dịch môi trường điều kiện vô trùng Trộn đều, sau đổ đĩa petri 1.2 Mơi trường Pseudomonas isolation agar (PIA) Thành phần: − − − − − Peptone Magnesium Chloride Potassium Sulfate Irgasan™ Agar 20,0 g 1,4 g 10,0 g 0,025 g 13,6 g Hịa tan 45g mơi trường với glycerol 100% lít nước cất, lắc Sau đem trùng nồi khử trùng áp suất (autoclave) 121°C, 15 phút Để nguội đổ đĩa petri 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1.3 Môi trường Edwardsiella ictaluri medium (EIM) (Shotts et al., 1990) Thành phần: Dung dịch − − − − − − − − Bacto-tryptone (Difco) Yeast extract (Difco) Phenylalanine Ferric ammonium citrate Sodium chloride Bromothymol blue Agar Nước cất 10,0 g 10,0 g 1,25 g 1,2 g 5,0 g 0,03 g 17,0 g 990 ml Dung dịch − − − − Mannitol (Difco) Colistin Bile salts (Difco) Nước cất 3,5 g 0,01 g 10,0 g 10 ml Hòa tan dung dịch cách đun sôi Để nguội khoảng 40-50°C chỉnh pH=7,0-7,2 Sau tiệt trùng 121°C, 15 phút, để nguội khoảng 40-50°C Thêm dung dịch vào qua lọc (0,22µm) điều kiện vơ trùng Để nguội đổ đĩa petri 1.4 Môi trường thiosulfate citrate bile salt sucrose agar (TCBS agar) Thành phần: − − − − − − − − − − − − Mixed peptone Yeast extract Sucrose Sodium citrate Ferric citrate Sodium chloride Sodium thiosulfate Oxbile Sodium cholate Thymol blue Bromothymol blue Agar 10,0 g 5,0 g 20,0 g 10,0 g 1,0 g 10,0 g 10,0 g 5,0 g 3,0 g 0,04 g 0,04 g 14,0 g Hịa tan 88 g mơi trường lít nước cất cách đun sơi Để nguội khoảng 40-50°C đổ đĩa petri 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nước muối sinh lý Hòa tan 0,85g NaCl 100 ml nước cất, lắc đều, dùng pipet hút ml cho vào ống nghiệm Sau tiệt trùng 121°C, 15 phút 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Bảng 1: Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn môi trường nước ao nuôi đối chứng mọc môi trường chọn lọc nồng độ pha loãng Aeromonas -1 E ictaluri -1 10 10 10 10-2 10 25/07/08 29 0 31/07/08 62 4 07/08/08 15 14/08/08 >200 19 0 21/08/08 >200 42 0 28/08/08 >200 50 04/09/08 12 0 11/09/08 131 11 18/09/08 >200 37 N N 25/09/08 156 10 59 02/10/08 31 0 09/10/08 >200 21 42 16/10/08 112 14 27 23/10/08 32 30/10/08 62 06/11/08 92 11 23 13/11/08 18 23 20/11/08 98 39 27/11/08 >200 63 32 04/12/08 62 27 11/12/08 170 16 60 18/12/08 >200 74 85 25/12/08 144 16 18 01/01/09 >200 27 25 08/01/09 28 15/01/09 120 12 49 22/01/09 110 10 Ghi chú: “N”: Môi trường bị nhiễm 10-2 0 0 0 0 N 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pseudomonas 10 32 39 21 >200 114 20 47 58 73 147 53 37 82 N 62 117 >200 130 >200 >200 169 >200 98 140 68 -1 10 3 33 8 11 12 N 15 143 14 30 83 18 30 12 10-2 0 0 0 0 0 N 15 1 Vibrio 10 0 0 0 11 0 13 0 0 0 10-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10-2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 39 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Bảng 2: Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn mơi trường nước ao ni có sử dụng CPSH mọc môi trường chọn lọc nông độ pha loãng Aeromonas E ictaluri Pseudomonas Vibrio (khuẩn lạc) (khuẩn lạc) (khuẩn lạc) (khuẩn lạc) 25/07/08 31/07/08 07/08/08 14/08/08 21/08/08 28/08/08 04/09/08 11/09/08 18/09/08 25/09/08 02/10/08 09/10/08 16/10/08 23/10/08 30/10/08 06/11/08 13/11/08 20/11/08 27/11/08 04/12/08 11/12/08 18/12/08 25/12/08 01/01/09 08/01/09 15/01/09 22/01/09 100 30 42 35 >200 >200 >200 32 172 >200 188 44 >200 10 110 77 158 36 119 >200 68 133 11 66 168 56 84 82 10-1 42 60 55 15 29 13 23 12 13 10 40 12 17 8 10-2 0 1 0 1 100 0 10 10 N 68 N 72 39 12 62 47 14 17 24 48 27 14 15 35 10-1 0 1 N N 10 2 1 10-2 0 0 0 0 N N 0 0 0 0 0 0 0 100 12 47 15 >200 139 16 92 108 118 29 >200 49 80 133 N 89 148 >200 49 >200 112 59 180 109 6,4 64 10-1 75 16 27 19 N 10 12 77 25 11 17 10 13 10-2 0 0 0 0 N 1 2 1 100 0 12 0 13 17 67 1 0 0 0 10-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10-2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ghi chú: “N”: Môi trường bị nhiễm 40 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Nguyễn Thị Thu Hằng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành tốt đề tài Chân thành cảm ơn q thầy, cơ, anh, chị Bộ mơn Thủy sinh học Bệnh thủy sản nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cảm ơn người bạn thân tập thể lớp Bệnh học thủy sản K31 ủng hộ tơi, gắn bó chia sẻ với tơi khó khăn học tập sống Chân thành cảm ơn! i 41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát mật độ vi khuẩn Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri Vibrio môi trường nước nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) Đồng Tháp” thực nhằm tìm hiểu mật số số giống lồi vi khuẩn mơi trường nước ao nuôi cá tra thâm canh Qua tháng phân tích mẫu nước ao ni cá tra thâm canh Đồng Tháp Tổng cộng có 54 mẫu, có 27 mẫu ao đối chứng (khơng sử dụng chế phẩm sinh học) 27 mẫu ao có sử dụng chế phẩm sinh học (Pond-clear, Soilpro, Lactobacillus feed, Beta-glucan 40, Microcin) Bằng phương pháp phân lập vi khuẩn môi trường nước Huys et al (2002) xác định có diện nhóm vi khuẩn Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas Vibrio môi trường chọn lọc với mật độ vi khuẩn dao động suốt vụ nuôi ao đối chứng 1,2-74 x 10 (cfu/ml); 0-8,5 x 102 (cfu/ml); 0,6-143 x 102 (cfu/ml), 0-1,3 x 102 (cfu/ml) Đối với ao có sử dụng CPSH mật độ dao động vi khuẩn Aeromonas (1,0-60 x 10 2) cfu/ml, Edwardsiella ictaluri (0-7,2 x 102) cfu/ml, Pseudomonas (0,6-77 x 102) cfu/ml Vibrio (0-6,7 x 102) cfu/ml Kết cho thấy ao nuôi đối chứng xuất bệnh lần cá bệnh với tỉ lệ cá chết 23,6%, ao ni có sử dụng CPSH có lần xuất bệnh với tỷ lệ hao hụt thấp nhiều so với ao đối chứng 13% suốt vụ nuôi Như vậy, sử dụng CPSH ao nuôi cá tra thâm canh khống chế mật độ vi khuẩn gây bệnh cho cá, giảm tỉ lệ cá chết gần 50% suốt q trình ni cá 42 ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu 1.3 Nội dung CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đặc điểm sinh học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.2 Tình hình ni cá tra nước 2.2.1 Trong nước 2.2.2 Ngoài nước 2.3 Một số bệnh thường gặp cá tra 2.4 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas Vibrio động vật thủy sản 2.4.1 Vi khuẩn Aeromonas 2.4.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.4.3 Vi khuẩn Pseudomonas 2.4.4 Vi khuẩn Vibrio 2.5 Sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) nuôi trồng thủy sản 10 2.5.1 Sơ lược probiotic 10 2.5.2 Tình hình sử dụng probiotic ni trồng thủy sản 12 2.5.3 Một số sản phẩm sinh học dùng nuôi thủy sản 12 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2.1 Dụng cụ 14 3.2.2 Thiết bị 14 3.2.3 Hóa chất mơi trường 14 3.2.4 Chế phẩm sinh học 14 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất mơi trường 15 3.3.2 Thu mẫu 15 3.3.3 Phân tích mẫu 15 3.3.4 Xử lý số liệu 16 43 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Sử dụng chế phẩm sinh học biến động tỷ lệ chết ao nuôi 17 4.1.1 Sử dụng chế phẩm sinh học ao nuôi 17 4.1.2 Sự biến động tỷ lệ chết ao nuôi 17 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn phân lập trong môi trường nước hai mơ hình ni 20 3.3 Sự biến động mật số vi khuẩn môi trường nước ao nuôi 21 3.3.1 Mật số vi khuẩn Aeromonas tổng cộng 22 3.3.2 Mật số vi khuẩn Pseudomonas tổng cộng 24 3.3.3 Mật số vi khuẩn Edwardsiella ictaluri tổng cộng 25 3.3.4 Mật số vi khuẩn Vibrio tổng cộng 25 3.4 Mối quan hệ biến động mật số vi khuẩn gây bệnh tình hình xuất bệnh ao ni 26 3.4.1 Ao nuôi đối chứng 26 3.4.2 Ao ni có sử dụng CPSH 27 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 36 PHỤ LỤC 39 PHỤ LỤC 40 44 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Các thông số kỹ thuật hai mô hình ni 17 Bảng 3.2 Số lượng tỷ lệ chết cá sau tháng ni hai mơ hình 18 Bảng 3.3: Mật số vi khuẩn môi trường nước ao nuôi đối chứng ao ni có sử dụng CPSH 23 Bảng 3.4: Dấu hiệu bệnh lý tỷ lệ cá chết xuất bệnh ao nuôi đối chứng 26 Bảng 3.5: Dấu hiệu bệnh số lượng cá chết xuất bệnh ao ni có sử dụng CPSH .28 v 45 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Cá tra bệnh xuất huyết vi khuẩn A hydrophila .5 Hình 2.2 Cá tra bệnh mủ gan: đốm trắng gan, thân tùy tạng Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Aeromonas, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas môi trường chọn lọc 20 vi 46 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... sống cá nuôi Đề tài ? ?Khảo sát mật độ vi khuẩn Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri Vibrio môi trường nước nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học. .. ? ?Khảo sát mật độ vi khuẩn Aeromonas, Pseudomonas, Edwardsiella ictaluri Vibrio môi trường nước ni cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) Đồng Tháp? ??... canh có sử dụng chế phẩm sinh học ao nuôi không sử dụng chế phẩm sinh học 1.3 Nội dung − Phân tích mẫu nước ao ni cá tra thâm canh có sử dụng chế phẩm sinh học − Phân tích mẫu nước ao ni cá tra